斑点免疫结合实验用于乙酰胆碱受体抗体的检测
作者：唐吟岫 谈华 虞伟 武建国
单位：唐吟岫(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；谈华(南京市儿童医院)；虞伟(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；武建国(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)
关键词：斑点免疫实验；抗乙酰胆碱受体抗体；重症肌无力
医学研究生学报000614中图分类号：R392.33 文献标识码：B
文章编号：1008-8199(2000)06-0392-02
0 引 言
抗乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)为重症肌无力(mgasthemia graris, MG)特异的自身抗体，对辅助临床诊断、疗效观察及研究MG的发病机制有重要意义[1,2]。我们在原ELISA法的基础上，采用α-银环蛇毒素(α-BGT)包被硝酸纤维素膜(NC)，建立了检测AchR-Ab的斑点免疫结合实验(DIBA)，对各类疾病患者进行了初步的临床观察，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 α-BGT由广西医科大学蛇毒研究所提供，辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄球菌A蛋白(SPA)，均购自上海生物制品研究所，其酶结合物采用改良过碘酸钠法进行标记[3]；硝酸纤维素膜(NC，孔径为0.45 μm，美国Bio-Rad);乙酰胆碱受体提取物[4](本室自制)；Stat-fax 2100型酶标仪(美国倍肯公司)。
1.2 待检血清 获自确诊的重症肌无力患者22例，其中13例合并胸腺瘤；单纯胸腺瘤4例；其他内科疾病包括甲状腺功能亢进、甲状腺炎、各类自身免疫病(SLE，SS，RA)和神经肌肉疾病共62例；正常对照组40例，获自健康体检战士及儿童入托体检者。均按常规采取静脉血，及时分离血清，置-20°C冰箱冻存待检。
1.3 DIBA反应条板制作 将硬质胶板裁剪成1 cm宽的长条，用打孔器打成孔径为6 mm的圆孔，在胶片的一面贴上胶纸布，将与圆孔等大的NC片嵌入到上述孔内(NC片需预先用含0.2%的戊二醛的0.01 mol/L PBS pH 7.4浸泡20 min)，于NC片中央点1 μl(2 mg/ml)的α-BGT，干燥后再加AchR提取物(用10%FCS-PBS作1∶20稀释)于37°C反应，再用5% 脱脂奶粉封闭(37°C，2 h)，经含0.05%吐温的PBS漂洗，吹干后置冰箱备用。
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1.4 临床标本检测 于上述包被好的NC片上加入1∶30稀释的待测血清，37°C反应10 min，PBST洗涤5次，3 min/次，滤纸吸干，加HRP-SPA(1∶1 000)，37°C作用10 min，同上洗涤后干燥，加DAB-H2O2底物，避光显色10 min，结果以NC片中央出现棕色斑点为阳性。
1.5 抗AchR-Ab的ELISA检测 用α-BGT 作预包被物，操作按本室常规。
2 结 果
2.1 最佳实验反应条件选择 采用方阵滴定法，于DIBA反应条板上依次点系列浓度的α-BGT 1 μl，综合斑点色泽、清晰度、背景底色几个方面的因素考虑，结果α-BGT以浓度为2 mg/ml为佳(总蛋白量为2 μg)，见图1，待检血清及酶结合物分别以1∶30和1∶1 000为最适工作浓度，抗原抗体反应及酶作用时间则以37℃ 10 min为宜。
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图1 AchR-Ab检测结果
DIBA反应条板(1，2)：1∶2～128为AchR-Ab阳性血清稀释倍数，N：AchR-Ab阴性血清；E：试剂空白；P：AchR-Ab阳性对照；DIBA反应条板(3)：为α-BGT点样量(μg)
2.2 方法重复性与稳定性 将上述包被好的NC片分别于4℃冰箱和室温下贮存3天、7天、2周、1个月后取出，用上述方法分别检测阳性对照、正常对照与无关疾病标本，结果与新鲜包被的 NC 片一致。
2.3 临床应用 128份血清标本检测结果见表1。
表1 临床病例抗AchR-Ab检测结果 组 别
n
阳性例数
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阳性率(%)
重症肌无力
22
11
50.0*
胸腺瘤
4
1
25.0*
甲状腺疾病
8
1
12.5
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自身免疫病
28
0
0
神经肌肉疾病
14
0
0
其他内科疾病
12
0
0
正常对照组
, http://www.100md.com 40
0
0
* 与正常对照组比，P<0.012.4 DIBA法与ELISA法的比较 128份血清标本同时用两种方法进行测定，结果DIBA法阳性13例，ELISA法阳性18例 (资料未列出)，两法同时阳性者13例。在未经选择的MG患者中，DIBA法阳性率为50.0%，低于ELISA法测定结果(有13例阳性, 检出率为59.1%)，但其特异性高于ELISA法，两法假阳性率分为1.9%和4.7%。
3 讨 论
由于获取AchR蛋白抗原较为困难，因此在检测AchR-Ab的各类实验方法中，大多用α-BGT进行预包被或同位素标记，本研究建立的DIBA法亦沿用了这一模式，不同的是以NC为固相包被载体，所用α-BGT可高度选择性地与提取物中的AchR结合，从而确保测定结果的特异性，同时亦有类似于亲合素-生物素系统的放大作用。用点印迹的方法进行酶免疫显色结果较为直观，并具有简便、快速等特点。
, 百拇医药
本法测定装置中，所选载体膜孔径以0.45 μm为佳，且不同膜种类对于测定结果亦有很大影响。我们在试用一种PVDF膜(带正电荷)时发现其为低本底，结果较为清晰，但斑点色泽弱淡，测定敏感性尚不及NC。经初步临床检测表明，在MG患者中，ELISA法所测抗AchR-Ab阳性检出率(用α-BGT预包被)高于我们以往的实验结果(采用简化ELISA法，直接以AchR为包被物)[4]，但DIBA法敏感性欠佳，这是本法存在的不足之处，尚需对实验条件作进一步的优化和改进。
作者简介：唐吟岫(1964-)，女，江苏南京人，主管技师，医学专科，从事临床 检验专业，现在南京市儿童医院工作。
参考文献：
[1] Lindstrom JM, Seybold ME, Lennon VA,et al. Antibody to acetycholine receptor in myasthenia gravis prevalence, clinical correlate and diagnostic value[J]. Neurology, 1976,26:1054.
, http://www.100md.com
[2] Lefvert AK,Bergstrom K,Matoll G,et al. Determination of acetylcholine receptor antibody in myasthenia gravis: clinical usefulness and pathogenetic implications[J]. J Neurol Neurosurg Psychiat,1976,41: 394.
[3] 武建国主编. 实用临床免疫学检验[M].第二版，南京：江苏科学技术出版社，1990，97.
[4] 谈 华，虞 伟，武建国. 乙酰胆碱受体的初步纯化及其抗体测定方法的建立[J]. 临床检验杂志，1997， 15(2):83.
收稿日期：2000-04-10, http://www.100md.com
单位：唐吟岫(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；谈华(南京市儿童医院)；虞伟(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；武建国(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)
关键词：斑点免疫实验；抗乙酰胆碱受体抗体；重症肌无力
医学研究生学报000614中图分类号：R392.33 文献标识码：B
文章编号：1008-8199(2000)06-0392-02
0 引 言
抗乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)为重症肌无力(mgasthemia graris, MG)特异的自身抗体，对辅助临床诊断、疗效观察及研究MG的发病机制有重要意义[1,2]。我们在原ELISA法的基础上，采用α-银环蛇毒素(α-BGT)包被硝酸纤维素膜(NC)，建立了检测AchR-Ab的斑点免疫结合实验(DIBA)，对各类疾病患者进行了初步的临床观察，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 α-BGT由广西医科大学蛇毒研究所提供，辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄球菌A蛋白(SPA)，均购自上海生物制品研究所，其酶结合物采用改良过碘酸钠法进行标记[3]；硝酸纤维素膜(NC，孔径为0.45 μm，美国Bio-Rad);乙酰胆碱受体提取物[4](本室自制)；Stat-fax 2100型酶标仪(美国倍肯公司)。
1.2 待检血清 获自确诊的重症肌无力患者22例，其中13例合并胸腺瘤；单纯胸腺瘤4例；其他内科疾病包括甲状腺功能亢进、甲状腺炎、各类自身免疫病(SLE，SS，RA)和神经肌肉疾病共62例；正常对照组40例，获自健康体检战士及儿童入托体检者。均按常规采取静脉血，及时分离血清，置-20°C冰箱冻存待检。
1.3 DIBA反应条板制作 将硬质胶板裁剪成1 cm宽的长条，用打孔器打成孔径为6 mm的圆孔，在胶片的一面贴上胶纸布，将与圆孔等大的NC片嵌入到上述孔内(NC片需预先用含0.2%的戊二醛的0.01 mol/L PBS pH 7.4浸泡20 min)，于NC片中央点1 μl(2 mg/ml)的α-BGT，干燥后再加AchR提取物(用10%FCS-PBS作1∶20稀释)于37°C反应，再用5% 脱脂奶粉封闭(37°C，2 h)，经含0.05%吐温的PBS漂洗，吹干后置冰箱备用。
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1.4 临床标本检测 于上述包被好的NC片上加入1∶30稀释的待测血清，37°C反应10 min，PBST洗涤5次，3 min/次，滤纸吸干，加HRP-SPA(1∶1 000)，37°C作用10 min，同上洗涤后干燥，加DAB-H2O2底物，避光显色10 min，结果以NC片中央出现棕色斑点为阳性。
1.5 抗AchR-Ab的ELISA检测 用α-BGT 作预包被物，操作按本室常规。
2 结 果
2.1 最佳实验反应条件选择 采用方阵滴定法，于DIBA反应条板上依次点系列浓度的α-BGT 1 μl，综合斑点色泽、清晰度、背景底色几个方面的因素考虑，结果α-BGT以浓度为2 mg/ml为佳(总蛋白量为2 μg)，见图1，待检血清及酶结合物分别以1∶30和1∶1 000为最适工作浓度，抗原抗体反应及酶作用时间则以37℃ 10 min为宜。
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图1 AchR-Ab检测结果
DIBA反应条板(1，2)：1∶2～128为AchR-Ab阳性血清稀释倍数，N：AchR-Ab阴性血清；E：试剂空白；P：AchR-Ab阳性对照；DIBA反应条板(3)：为α-BGT点样量(μg)
2.2 方法重复性与稳定性 将上述包被好的NC片分别于4℃冰箱和室温下贮存3天、7天、2周、1个月后取出，用上述方法分别检测阳性对照、正常对照与无关疾病标本，结果与新鲜包被的 NC 片一致。
2.3 临床应用 128份血清标本检测结果见表1。
表1 临床病例抗AchR-Ab检测结果 组 别
n
阳性例数
, 百拇医药
阳性率(%)
重症肌无力
22
11
50.0*
胸腺瘤
4
1
25.0*
甲状腺疾病
8
1
12.5
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自身免疫病
28
0
0
神经肌肉疾病
14
0
0
其他内科疾病
12
0
0
正常对照组
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0
0
* 与正常对照组比，P<0.012.4 DIBA法与ELISA法的比较 128份血清标本同时用两种方法进行测定，结果DIBA法阳性13例，ELISA法阳性18例 (资料未列出)，两法同时阳性者13例。在未经选择的MG患者中，DIBA法阳性率为50.0%，低于ELISA法测定结果(有13例阳性, 检出率为59.1%)，但其特异性高于ELISA法，两法假阳性率分为1.9%和4.7%。
3 讨 论
由于获取AchR蛋白抗原较为困难，因此在检测AchR-Ab的各类实验方法中，大多用α-BGT进行预包被或同位素标记，本研究建立的DIBA法亦沿用了这一模式，不同的是以NC为固相包被载体，所用α-BGT可高度选择性地与提取物中的AchR结合，从而确保测定结果的特异性，同时亦有类似于亲合素-生物素系统的放大作用。用点印迹的方法进行酶免疫显色结果较为直观，并具有简便、快速等特点。
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本法测定装置中，所选载体膜孔径以0.45 μm为佳，且不同膜种类对于测定结果亦有很大影响。我们在试用一种PVDF膜(带正电荷)时发现其为低本底，结果较为清晰，但斑点色泽弱淡，测定敏感性尚不及NC。经初步临床检测表明，在MG患者中，ELISA法所测抗AchR-Ab阳性检出率(用α-BGT预包被)高于我们以往的实验结果(采用简化ELISA法，直接以AchR为包被物)[4]，但DIBA法敏感性欠佳，这是本法存在的不足之处，尚需对实验条件作进一步的优化和改进。
作者简介：唐吟岫(1964-)，女，江苏南京人，主管技师，医学专科，从事临床 检验专业，现在南京市儿童医院工作。
参考文献：
[1] Lindstrom JM, Seybold ME, Lennon VA,et al. Antibody to acetycholine receptor in myasthenia gravis prevalence, clinical correlate and diagnostic value[J]. Neurology, 1976,26:1054.
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[2] Lefvert AK,Bergstrom K,Matoll G,et al. Determination of acetylcholine receptor antibody in myasthenia gravis: clinical usefulness and pathogenetic implications[J]. J Neurol Neurosurg Psychiat,1976,41: 394.
[3] 武建国主编. 实用临床免疫学检验[M].第二版，南京：江苏科学技术出版社，1990，97.
[4] 谈 华，虞 伟，武建国. 乙酰胆碱受体的初步纯化及其抗体测定方法的建立[J]. 临床检验杂志，1997， 15(2):83.
收稿日期：2000-04-10, http://www.100md.com