不同病变胃粘膜DNA含量与癌基因表达的检测
作者：张熔熔
单位：无锡市第二人民医院 病理科, 无锡214002
关键词：胃；基因表达；DI值；倍体分布；图像分析技术。
基础医学与临床000612 摘要：用图像分析技术检测143例胃的慢性炎症、肠上皮化生、异型增生、癌各组细胞核DNA含量及倍体分布情况，并同时进行nm23、PCNA、 C-erbB-2抗体染色。结果显示nm23的阳性率在4种病变中无明显差异， DNA含量、PCNA、C-erbB-2则呈递增表达(P<0.01)；nm23阴性表达、 PCNA与C-erbB-2阳性表达的细胞核DNA含量与5倍体(5c)及非整倍体(AN)检出率显著高于nm23阳性、PCNA、C-erbB-2阴性表达者(P<0.05)。提示胃良恶性病变细胞核中DNA含量及倍体分布形式不同，nm23失表达、 PCNA与C-erbB-2过度表达与5c和AN细胞形成有关，形态定量分析及癌基因检测可作为胃粘膜上皮病变诊断和分类的综合性指标。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q344+.13 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)06-0042-03
Detection of the DNA content of stomach mucosa with pathologic
changes and oncogene expresion
ZHANG Rong-rong
(Dept of Pathol ,The Second People's Hospital of Wuxi 214002 China)
Abstract：We use 143 cases of stomach pathological change whose gene expression show negative,positive(including 20 cases of gastritis,16 cases of intestinal metaplasia,34 cases of dysplasia,73 cases of carcinom) DNA image analysis can be used to test the DNA content of nuclear.the positive percentge of nm23 decreases progressirely among four pathological changes and the DNA content,PCNA,C-erbB-2 incerase by regular degrees.The DNA content of nuclear of nm23 nositive,PCNA,C-erbB-2 positive and percinlages of aneuploidy is evidently higher than that of nm23 positive,PCNA,C-erbB-2 nositive(P<0.05).The DNA content of nuclear in stomach benign and malignant pathological changes is different.Image analysis technique cancer genes can be used as a comprehensive index to diagnose and classify pathological changes of gastric mucosa and can be helptul to conduct clinical treatment and estimate the malignant potential of tumor and prevent other pathologucal changes.
, 百拇医药
Key words： stomach;gene expression;DNA content;image analysis technique
细胞增殖的不同，主要表现为细胞核DNA含量及倍体的不同。本文对143例不同病变胃粘膜用图像分析技术进行DNA及倍体检测，并用国内外已经公认且比较成熟、应用较广、可作为胃粘膜上皮病变诊断和分类综合性指标的nm23、PCNA、C-erbB-2癌基因作为对照，根据基因表达形式、细胞核DNA含量及倍体分布情况、基因表达与细胞核DNA含量和倍体分布的关系，以判断胃的良恶性疾病。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源：1993～1997年胃镜活检和胃手术切除标本,慢性胃炎活检标本20例,肠上皮化生16例、异型增生34例、癌73例(管状腺癌55例、粘液腺癌8例、乳头状腺癌10例)，标本为10%中性甲醛固定、石蜡包埋之存档组织块，重新制备4μm切片5份，一份行Feulgen染色，3份做免疫酶标，1份备用。
, http://www.100md.com
1.1.2 MPIAS500多媒体彩色病理图文分析系统由同济医科大学清平影像工程公司研制。
1.2 方法
1.2.1 图像定量分析步骤：切片经常规脱蜡、水化、行Feulgen染色，将染色后的切片置显微镜下(40×)，像素点长0.212um，对所测细胞进行准确定位后，通过摄像系统提取数值化的细胞图像，并显示于监视器上，每例无选择地检测50个细胞核光密度，分别以同切片中50个小淋巴细胞作为正常二倍体(2c)对照，计算机按单个被测细胞积分光密度与淋巴细胞核平均积分光密度的比值统计1c—9c的百分率， DNA>5c细胞称作非整倍体，每一例DNA指数(DI)＝被测细胞核平均积分吸光度/对照淋巴细胞核平均积分吸光度[1] 。
1.2.2 免疫酶标：用S-P法，nm23、PCNA、C-erbB-2免疫试剂购自迈新生物技术开发公司，严格按说明书进行操作。TBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性的标本作阳性对照。
, 百拇医药
免疫反应阳性信号为棕黄色颗粒，每张切片观察10个高倍视野。nm23表达主要位于细胞浆内，核可见弱阳性，阴性(-)：阳性细胞数<5/HP；阳性(+)：阳性细胞数>5/HP；强阳性(++)：阳性细胞数>肿瘤细胞的30%。PCNA表达主要位于细胞核，胞浆可见弱阳性；阴性(-)：阳性细胞数<肿瘤细胞的15%；阳性(+)：阳性细胞数>肿瘤细胞的15%；强阳性(++)：阳性细胞数>肿瘤细胞的60%[2] 。C-erbB-2定位于胞浆和胞膜；阴性(-)：无阳性染色细胞；(+)：阳性细胞数<5%；(++)阳性细胞数为5%～30%；(+++)：阳性细胞数为30%～50%；(++++)：阳性细胞数>50%[3] 。
1.3 统计学处理
用X2 检验及t检验，数值以均数±标准差(
±s)表示。
, 百拇医药
2 结果
2.1 各组细胞DNA含量和倍体构成
表1统计结果显示良恶性病变之间DNA含量与DNA倍体构成有显著差异(P<0.01)，其中慢性炎症与肠上皮化生、肠上皮化生与异型增生之间无显著差异；慢性炎症与癌、肠上皮化生与癌、异型增生与癌之间均有显著性差异(P<0.05)
表1 各组细胞DNA含量和倍体%
Table 1 Nuclear DNA content and DNA ploidy
in the cells of stomach group
n
DNA ploidy(%)
, http://www.100md.com
DI
2c
3c-4c
5c
AN
gastritis
20
55.44
43.24
0.80
0.53
1.09±0.67
intestinal
, http://www.100md.com
16
46.57
52.24
0.75
0.45
1.26±0.50
metaplasia
dysplasia
34
47.10*
48.07*
3.14*
, http://www.100md.com
1.69*
1.38±0.56**
carcinom
73
20.02*
41.13*
10.57*
16.28*
1.56±0.96**
DNA X2 =13.105 * P<0.01; DI(DNA Index) X2 =55.50 ** P<0.001 C content AN aneuploidy2.2 nm23、PCNA、C-erbB-2在病变粘膜中的表达
, http://www.100md.com
表2示 nm23的阳性率在4种病变中的表达无明显差异，PCNA、C-erbB-2在4种病变中呈递增表达，各组均有极显著差异(P<0.01)
2.3 相关性
nm23与PCNA、C-erbB-2呈负相关系，nm23阴性表达者，PCNA与C-erbB-2阳性表达的百分比明显高于nm23阳性表达者，nm23与PCNA之间、nm23与C-erbB-2有明显的相关性(P<0.05)。
2.4 5c和AN检出率
nm23阳性表达、PCNA及C-erbB-2阴性表达者5c和AN检出率为10.35%，DI值＝1.01±0.33；而nm23阴性、PCNA及C-erbB-2阳性表达者5c和AN细胞检出率则显著增高，为40.94%，DI值＝2.11±1.03(P<0.05)。
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表2 nm23、PCNA、C-erbB-2在病变粘膜中的表达
Table 2 nm23.PCNA.C-erbB-2 expression in stomach group
n
nm23
PCNA
C-crbB-2
-
+
++
%
-
, 百拇医药 +
++
%
-
+
++
+++
%
gastritis
20
1
4
15
95
, 百拇医药
18
2
0
10
16
4
0
20
intestinal
16
0
3
17
100
, http://www.100md.com
16
4
0
20
17
3
0
15
metaplasia
dysplasia
34
1
6
, 百拇医药 27
97
12
14
8
65*
17
10
7
50*
carcinom
73
8
, 百拇医药
8
57
89
17
24
32
77*
17
22
24
10
77*
PCNA X2 =37.348 * P<0.01; C-erbB-2 X2 =32.727 * P<0.013 讨论
, 百拇医药
多媒体图文分析系统能测量构成染色体的DNA物质，即通过Feulgen染色，利用高精度图像采集系统将细胞DNA的显微数字化灰度图像摄入计算机，通过图像处理分析技术对该细胞核DNA进行定量分析计算，并给出被测细胞DNA的含量、倍体分布及其它参数，医生借助这些参数即可作出初步诊断。本文对143例不同病变胃粘膜用图像分析技术进行DNA及倍体分布检测，结果表明DNA分布图随各组细胞恶性度增加，图形加宽、主峰右移、细胞倍体组成分散。DI值与倍体分布是二个相互补充的指标，前者反应细胞DNA的平均含量，数据精确度高，但灵敏度稍差；后者反应细胞中染色体非整倍体核型的多少，灵敏度高，但特异性稍差。
nm23是一种抑制肿瘤转移的基因编码二磷酸核苷激酶，在细胞的能量代谢、糖代谢中发挥主要作用；它是正常组织中的一种正常基因，在细胞的能量代谢、糖原合成和核苷酸代谢中发挥重要作用。据文献报道，多种啮齿动物实验性肿瘤的转移能力与nm23基因的表达密切负相关[4,5] ，nm23基因是一种转移抑制基因，与肿瘤的生物学行为有关，并与胃癌细胞的转移潜能联系紧密[6] 。PCNA是细胞增殖周期的一种核蛋白，它仅存在于细胞的细胞周期G1和S期，其合成和表达与细胞增殖周期相关，通过分析PCNA阳性表达率可直接反应细胞功能状态和增殖活性。上海第二军医大学长海医院病理科常规应用PCNA作为判断肿瘤良、恶性的重要指标，认为 PCNA与肿瘤恶性程度、生物学行为及预后密切相关。C-erBb-2是一种细胞来源癌基因，在多种腺癌细胞中，其癌基因及其蛋白的产物均有超量表达，癌基因的蛋白产物的超表达可以间接反应癌基因的扩增。研究结果示：nm23的阳性率在4种胃粘膜病变中呈递减表达，PCNA、C-erBb-2则呈递增表达；其中 PCNA、C-erBb-2基因表达在良、恶性病变中的差异比nm23明显，其特异性也较强，PCNA、C-erbB-2在良性病变中，阳性表达率<=20%，而在癌中，阳性表达率达76.7%；nm23虽然在良性比恶性阳性表达率高，但还不足以用于鉴别良恶性，仅可作为胃癌患者预测转移和预后的指标[7] 。
, http://www.100md.com
基因表达与细胞DI值、倍体分布有着一定的关系。nm23阴性表达、 PCNA及C-erbB-2阳性表达的细胞核DNA含量显著高于nm23阳性表达、PCNA及c-erbB-2阴性表达者；在DNA倍体分布形式上，nm23阴性表达、PCNA与C-erbB-2阳性表达者5c和AN细胞检出率明显高于nm23阳性、PCNA及C-erbB-2性表达者。结果表明： nm23失表达、PCNA及C-erbB-2过度表达与非整倍体细胞形成有关。
参考文献：
[1] 徐根兴.定量细胞学和细胞化学技术[M].长春:吉林科技出版社，1993.79-101.
[2] 刘勇，李启明，路名芝，等. nm23-H1、P53、PCNA表达与大肠癌浸润转移的关系[J].临床与实验病理学杂志，1997，13:21-24.
[3] 汪勇，周子成，杨建民，等.肝癌组织中ras、C-myc、C-erBb-2和P53蛋白表达[J].临床与实验病理学杂志，1997，13:4-6.
, 百拇医药
[4] Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metaststic potential[J]. Natl Cancer Inst,1988,80:200-206.
[5] Giles AM,Presecan E,Vonica A,et al.Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes.Structural characterization of the two polypeptide chains responsible for heterogeneity of hexameric enzyme[J]. Biol Chem,1991,266:8784-8788.
[6] Ura H,Denno R,Hirate k,et al.The significance of nm23 protein expression in human gastric carcinomas[J].Surg Today,1996,26:957.
[7] 王盛乾，洪东旭，吴若华.120例胃癌中P16,nm23-H1基因蛋白表达与临床预后的关系[J] 实用肿瘤杂志, 1997，12:108-110.
收稿日期：1999-07-10
修回日期：2000-05-15, 百拇医药
单位：无锡市第二人民医院 病理科, 无锡214002
关键词：胃；基因表达；DI值；倍体分布；图像分析技术。
基础医学与临床000612 摘要：用图像分析技术检测143例胃的慢性炎症、肠上皮化生、异型增生、癌各组细胞核DNA含量及倍体分布情况，并同时进行nm23、PCNA、 C-erbB-2抗体染色。结果显示nm23的阳性率在4种病变中无明显差异， DNA含量、PCNA、C-erbB-2则呈递增表达(P<0.01)；nm23阴性表达、 PCNA与C-erbB-2阳性表达的细胞核DNA含量与5倍体(5c)及非整倍体(AN)检出率显著高于nm23阳性、PCNA、C-erbB-2阴性表达者(P<0.05)。提示胃良恶性病变细胞核中DNA含量及倍体分布形式不同，nm23失表达、 PCNA与C-erbB-2过度表达与5c和AN细胞形成有关，形态定量分析及癌基因检测可作为胃粘膜上皮病变诊断和分类的综合性指标。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q344+.13 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)06-0042-03
Detection of the DNA content of stomach mucosa with pathologic
changes and oncogene expresion
ZHANG Rong-rong
(Dept of Pathol ,The Second People's Hospital of Wuxi 214002 China)
Abstract：We use 143 cases of stomach pathological change whose gene expression show negative,positive(including 20 cases of gastritis,16 cases of intestinal metaplasia,34 cases of dysplasia,73 cases of carcinom) DNA image analysis can be used to test the DNA content of nuclear.the positive percentge of nm23 decreases progressirely among four pathological changes and the DNA content,PCNA,C-erbB-2 incerase by regular degrees.The DNA content of nuclear of nm23 nositive,PCNA,C-erbB-2 positive and percinlages of aneuploidy is evidently higher than that of nm23 positive,PCNA,C-erbB-2 nositive(P<0.05).The DNA content of nuclear in stomach benign and malignant pathological changes is different.Image analysis technique cancer genes can be used as a comprehensive index to diagnose and classify pathological changes of gastric mucosa and can be helptul to conduct clinical treatment and estimate the malignant potential of tumor and prevent other pathologucal changes.
, 百拇医药
Key words： stomach;gene expression;DNA content;image analysis technique
细胞增殖的不同，主要表现为细胞核DNA含量及倍体的不同。本文对143例不同病变胃粘膜用图像分析技术进行DNA及倍体检测，并用国内外已经公认且比较成熟、应用较广、可作为胃粘膜上皮病变诊断和分类综合性指标的nm23、PCNA、C-erbB-2癌基因作为对照，根据基因表达形式、细胞核DNA含量及倍体分布情况、基因表达与细胞核DNA含量和倍体分布的关系，以判断胃的良恶性疾病。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源：1993～1997年胃镜活检和胃手术切除标本,慢性胃炎活检标本20例,肠上皮化生16例、异型增生34例、癌73例(管状腺癌55例、粘液腺癌8例、乳头状腺癌10例)，标本为10%中性甲醛固定、石蜡包埋之存档组织块，重新制备4μm切片5份，一份行Feulgen染色，3份做免疫酶标，1份备用。
, http://www.100md.com
1.1.2 MPIAS500多媒体彩色病理图文分析系统由同济医科大学清平影像工程公司研制。
1.2 方法
1.2.1 图像定量分析步骤：切片经常规脱蜡、水化、行Feulgen染色，将染色后的切片置显微镜下(40×)，像素点长0.212um，对所测细胞进行准确定位后，通过摄像系统提取数值化的细胞图像，并显示于监视器上，每例无选择地检测50个细胞核光密度，分别以同切片中50个小淋巴细胞作为正常二倍体(2c)对照，计算机按单个被测细胞积分光密度与淋巴细胞核平均积分光密度的比值统计1c—9c的百分率， DNA>5c细胞称作非整倍体，每一例DNA指数(DI)＝被测细胞核平均积分吸光度/对照淋巴细胞核平均积分吸光度[1] 。
1.2.2 免疫酶标：用S-P法，nm23、PCNA、C-erbB-2免疫试剂购自迈新生物技术开发公司，严格按说明书进行操作。TBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性的标本作阳性对照。
, 百拇医药
免疫反应阳性信号为棕黄色颗粒，每张切片观察10个高倍视野。nm23表达主要位于细胞浆内，核可见弱阳性，阴性(-)：阳性细胞数<5/HP；阳性(+)：阳性细胞数>5/HP；强阳性(++)：阳性细胞数>肿瘤细胞的30%。PCNA表达主要位于细胞核，胞浆可见弱阳性；阴性(-)：阳性细胞数<肿瘤细胞的15%；阳性(+)：阳性细胞数>肿瘤细胞的15%；强阳性(++)：阳性细胞数>肿瘤细胞的60%[2] 。C-erbB-2定位于胞浆和胞膜；阴性(-)：无阳性染色细胞；(+)：阳性细胞数<5%；(++)阳性细胞数为5%～30%；(+++)：阳性细胞数为30%～50%；(++++)：阳性细胞数>50%[3] 。
1.3 统计学处理
用X2 检验及t检验，数值以均数±标准差(
±s)表示。, 百拇医药
2 结果
2.1 各组细胞DNA含量和倍体构成
表1统计结果显示良恶性病变之间DNA含量与DNA倍体构成有显著差异(P<0.01)，其中慢性炎症与肠上皮化生、肠上皮化生与异型增生之间无显著差异；慢性炎症与癌、肠上皮化生与癌、异型增生与癌之间均有显著性差异(P<0.05)
表1 各组细胞DNA含量和倍体%
Table 1 Nuclear DNA content and DNA ploidy
in the cells of stomach group
n
DNA ploidy(%)
, http://www.100md.com
DI
2c
3c-4c
5c
AN
gastritis
20
55.44
43.24
0.80
0.53
1.09±0.67
intestinal
, http://www.100md.com
16
46.57
52.24
0.75
0.45
1.26±0.50
metaplasia
dysplasia
34
47.10*
48.07*
3.14*
, http://www.100md.com
1.69*
1.38±0.56**
carcinom
73
20.02*
41.13*
10.57*
16.28*
1.56±0.96**
DNA X2 =13.105 * P<0.01; DI(DNA Index) X2 =55.50 ** P<0.001 C content AN aneuploidy2.2 nm23、PCNA、C-erbB-2在病变粘膜中的表达
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表2示 nm23的阳性率在4种病变中的表达无明显差异，PCNA、C-erbB-2在4种病变中呈递增表达，各组均有极显著差异(P<0.01)
2.3 相关性
nm23与PCNA、C-erbB-2呈负相关系，nm23阴性表达者，PCNA与C-erbB-2阳性表达的百分比明显高于nm23阳性表达者，nm23与PCNA之间、nm23与C-erbB-2有明显的相关性(P<0.05)。
2.4 5c和AN检出率
nm23阳性表达、PCNA及C-erbB-2阴性表达者5c和AN检出率为10.35%，DI值＝1.01±0.33；而nm23阴性、PCNA及C-erbB-2阳性表达者5c和AN细胞检出率则显著增高，为40.94%，DI值＝2.11±1.03(P<0.05)。
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表2 nm23、PCNA、C-erbB-2在病变粘膜中的表达
Table 2 nm23.PCNA.C-erbB-2 expression in stomach group
n
nm23
PCNA
C-crbB-2
-
+
++
%
-
, 百拇医药 +
++
%
-
+
++
+++
%
gastritis
20
1
4
15
95
, 百拇医药
18
2
0
10
16
4
0
20
intestinal
16
0
3
17
100
, http://www.100md.com
16
4
0
20
17
3
0
15
metaplasia
dysplasia
34
1
6
, 百拇医药 27
97
12
14
8
65*
17
10
7
50*
carcinom
73
8
, 百拇医药
8
57
89
17
24
32
77*
17
22
24
10
77*
PCNA X2 =37.348 * P<0.01; C-erbB-2 X2 =32.727 * P<0.013 讨论
, 百拇医药
多媒体图文分析系统能测量构成染色体的DNA物质，即通过Feulgen染色，利用高精度图像采集系统将细胞DNA的显微数字化灰度图像摄入计算机，通过图像处理分析技术对该细胞核DNA进行定量分析计算，并给出被测细胞DNA的含量、倍体分布及其它参数，医生借助这些参数即可作出初步诊断。本文对143例不同病变胃粘膜用图像分析技术进行DNA及倍体分布检测，结果表明DNA分布图随各组细胞恶性度增加，图形加宽、主峰右移、细胞倍体组成分散。DI值与倍体分布是二个相互补充的指标，前者反应细胞DNA的平均含量，数据精确度高，但灵敏度稍差；后者反应细胞中染色体非整倍体核型的多少，灵敏度高，但特异性稍差。
nm23是一种抑制肿瘤转移的基因编码二磷酸核苷激酶，在细胞的能量代谢、糖代谢中发挥主要作用；它是正常组织中的一种正常基因，在细胞的能量代谢、糖原合成和核苷酸代谢中发挥重要作用。据文献报道，多种啮齿动物实验性肿瘤的转移能力与nm23基因的表达密切负相关[4,5] ，nm23基因是一种转移抑制基因，与肿瘤的生物学行为有关，并与胃癌细胞的转移潜能联系紧密[6] 。PCNA是细胞增殖周期的一种核蛋白，它仅存在于细胞的细胞周期G1和S期，其合成和表达与细胞增殖周期相关，通过分析PCNA阳性表达率可直接反应细胞功能状态和增殖活性。上海第二军医大学长海医院病理科常规应用PCNA作为判断肿瘤良、恶性的重要指标，认为 PCNA与肿瘤恶性程度、生物学行为及预后密切相关。C-erBb-2是一种细胞来源癌基因，在多种腺癌细胞中，其癌基因及其蛋白的产物均有超量表达，癌基因的蛋白产物的超表达可以间接反应癌基因的扩增。研究结果示：nm23的阳性率在4种胃粘膜病变中呈递减表达，PCNA、C-erBb-2则呈递增表达；其中 PCNA、C-erBb-2基因表达在良、恶性病变中的差异比nm23明显，其特异性也较强，PCNA、C-erbB-2在良性病变中，阳性表达率<=20%，而在癌中，阳性表达率达76.7%；nm23虽然在良性比恶性阳性表达率高，但还不足以用于鉴别良恶性，仅可作为胃癌患者预测转移和预后的指标[7] 。
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基因表达与细胞DI值、倍体分布有着一定的关系。nm23阴性表达、 PCNA及C-erbB-2阳性表达的细胞核DNA含量显著高于nm23阳性表达、PCNA及c-erbB-2阴性表达者；在DNA倍体分布形式上，nm23阴性表达、PCNA与C-erbB-2阳性表达者5c和AN细胞检出率明显高于nm23阳性、PCNA及C-erbB-2性表达者。结果表明： nm23失表达、PCNA及C-erbB-2过度表达与非整倍体细胞形成有关。
参考文献：
[1] 徐根兴.定量细胞学和细胞化学技术[M].长春:吉林科技出版社，1993.79-101.
[2] 刘勇，李启明，路名芝，等. nm23-H1、P53、PCNA表达与大肠癌浸润转移的关系[J].临床与实验病理学杂志，1997，13:21-24.
[3] 汪勇，周子成，杨建民，等.肝癌组织中ras、C-myc、C-erBb-2和P53蛋白表达[J].临床与实验病理学杂志，1997，13:4-6.
, 百拇医药
[4] Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metaststic potential[J]. Natl Cancer Inst,1988,80:200-206.
[5] Giles AM,Presecan E,Vonica A,et al.Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes.Structural characterization of the two polypeptide chains responsible for heterogeneity of hexameric enzyme[J]. Biol Chem,1991,266:8784-8788.
[6] Ura H,Denno R,Hirate k,et al.The significance of nm23 protein expression in human gastric carcinomas[J].Surg Today,1996,26:957.
[7] 王盛乾，洪东旭，吴若华.120例胃癌中P16,nm23-H1基因蛋白表达与临床预后的关系[J] 实用肿瘤杂志, 1997，12:108-110.
收稿日期：1999-07-10
修回日期：2000-05-15, 百拇医药