PET与Alzheimer病诊断
作者：徐雁 李舜伟
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院神经科，北京100730
关键词：
基础医学与临床990505 摘要 疟原虫抗原B表位NKND是由本所寄生虫免疫室与分子生物学研究室合作发现的一个疟疾抗原表位。它存在于多种不同的疟原虫分离株。在其C末端加上一个D可以增强它与抗体的结合能力[1]。我们人工合成NKNDD和CS.T3的寡核苷酸片段并将之串联后插入沙门氏菌鞭毛蛋白表达载体。斑点杂交得到阳性克隆。序列分析鉴定为2拷贝NKNDD与2拷贝CS.T3的串联体。
Construction of Salmonella Flagellin Chimera Gene
, http://www.100md.com Containing Malaria Parasite Epitope
Huang Liang Tu Zheng Yin Bin，et al
(Dept. of Molecular Biology and Biochemistry，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing100005)
Abstract A new conserved B-cell epitope of Malaria erythrocytic stage protein，NKND，was firstly reported by Chinese scientists.And CS.T3 is a well-known T-cell epitope.We synthesized oligonucleotides encoding NKNDD and CS.T3 and linked them together.Then the complex gene was inserted into Salmonella flagellin expressing vector.Dot blot and DNA sequencing revealed a recombinant containing two copy NKNDD and two copy CS.T3.
, http://www.100md.com
Key words malaria vaccine Salmonela mueuchen B cell epitope NKND
世界卫生组织(WHO)将疟疾列为应优先控制的六种传染病之首。蚊耐药性和疟原虫抗药性的产生与扩散促使人们考虑发展人工合成多肽和基因工程疫苗来控制疟疾流行[2]。疟原虫抗原B表位NKND是由中国医学科学院基础医学研究所寄生虫免疫室与分子生物学研究室合作发现的一个疟原虫红内期抗原表位。它是一种较理想的候选疫苗抗原表位，存在于多种不同的疟原虫分离株。在其C末端加上一个D可以增强它与抗体的结合能力[1]。我们人工合成NKNDD和CS.T3的寡核苷酸片段并将之串联后插入沙门氏菌鞭毛蛋白表达载体。斑点杂交得到阳性克隆。DNA序列分析鉴定为2拷贝NKNDD与2拷贝CS.T3的串联体。为进一步制备疟疾疫苗打下基础。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 寡核苷酸片段的合成
由本所分子生物学国家重点实验室合成。
NKNDD片段编码序列：
1.1.1 5' AAC AAG AAC GAT GAT 3'
1.1.2 5' TTG CTA CTA TTG TTC 3'
CS.T3片段序列：
1.1.3 5' ATC GCC AAA ATG GAA AAA GCC TCC 3'
1.1.4 5' TTT TTC CAT TTT GGC CAT TTT TTT 3'
, http://www.100md.com 1.1.5 5' AGC GTG TTT AAC GTG AAG AAG 3'
1.1.6 5' CAC GTT AAA CAC GCT GGA GGC 3'
1.1.7 5' AAC AAG AAA AAA 3'
1.1.8 5' CTT GTT CTT CTT 3'
测序引物序列：
5' ACT GCT GTA ACC GTT GAT 3'
1.2 菌株与质粒
含有鞭毛蛋白基因的质粒pLS408，大肠杆菌菌株CL447(k-12 C600 hag)由美国斯坦福大学Stocker教授提供。
, 百拇医药
1.3 主要试剂
T4噬菌体DNA连接酶，Klenow酶，T4多核苷酸激酶为Promega公司产品；γ-32P-ATP购自北京亚辉生物医学工程公司；测序试剂盒采用Promega公司的Circumvent Sequencing kit；C18反向层析柱购自Millipore公司；甲叉双丙烯酰胺购自Fluka公司；TEMED购自E.Merck公司；丙烯酰胺，SDS，PEG8000及过硫酸铵购自Sigma公司。
1.4 寡核苷酸片段的合成及纯化
将合成的NKNDD，CS.T3寡核苷酸片段于55 ℃除氨，真空抽干后溶于0.8 mL饱和脲中。用浓度为19%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离核苷酸片段，电泳电压为600V，缓冲液为TBE，电泳时间为10h。电泳后切下正确大小的DNA条带。于干净试管中，用玻棒将胶条挤碎，并加入1～2mL 0.5mol/L NaCl，37 ℃水浴过夜。用C18反向层析柱对上述合成片段的DNA浸泡液进行吸附与洗脱，冷冻抽干后溶于去离子水或TE缓冲液，定量后于-20 ℃冻存。用γ-32ρ-ATP进行末端标记，并用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影鉴定所得DNA纯度。
, 百拇医药
1.5 人工合成片段的克隆
先将上述合成的DNA片段1～8磷酸化。取等量片段1～7，混匀，于100 ℃水浴5min后，将溶液逐渐降温至室温，过夜，再逐渐降温至4 ℃，备用。在14 ℃下，连接片段1～7约16h，得到一个复合片段(其中含片段1～7)。再取第8片段与此复合片段连接，并补平所得新的复合片段(其中含片段1～8)的两个末端。
将质粒pLS408用EcoRV酶切2h，酶切温度为37 ℃。经酚、氯仿抽提纯化、乙醇沉淀，溶于TE中定量。
将上述DNA大片段与质粒载体于14～16 ℃随机连接24h。
1.6 斑点杂交筛选阳性克隆
转化大肠杆菌CL447，方法同Sambrook方法[3]，并小量抽提转化子质粒。将质粒分别点在两张硝酸纤维膜上。晾干。取前述合成的寡核苷酸片段1或2作NKNDD探针，取寡核苷酸片段5～8之一作CS.T3探针，和γ-32ρ-ATP末端标记这两种探针。探针标记后，直接加入预杂交液中。探针标记及杂交方法同Sambrook方法[3]。
, 百拇医药
与CS.T3探针水浴杂交的硝酸纤维膜的杂交温度为50 ℃。与NKNDD探针杂交的硝酸纤维膜的杂交温度为室温，杂交时间均为3h，并轻轻振摇。
杂交完毕，先将与CS.T3探针杂交的硝酸纤维膜置于50 ℃的2×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，再将膜置于50 ℃的1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，最后将膜置于50 ℃的0.1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，并重复两次；室温下，将与NKNDD探针杂交的另一张硝酸纤维膜置于2×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，再将膜置于1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，最后将膜置于0.1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min。晾干上述两张硝酸纤维膜，放射自显影，压片1天后读片。
1.7 测序鉴定阳性克隆
挑取与两种探针杂交均为阳性的转化子，抽提测序模板DNA，测序方法同Sambrook方法[3]。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 重组质粒的构建
本实验选用质粒pLS408作为NKNDD和CS.T3的表达载体。将编码沙门氏菌鞭毛蛋白的基因H1-d插入质粒pUC19的EcoRI的酶切位点后，再用EcoRV酶切除去H1-d基因的48个bp，即可得到鞭毛蛋白表达载体质粒pLS408。外源基因可以插入H1-d基因内的EcoRV酶切位点。如图1。
图1 重组质粒结构图
Fig1 Construction of the recombinant plasmid
片段1～7退火连接后得到复合片段，它是多拷贝NKNDD与单拷贝CS.T3的串联体。片段8与此复合片段再连接，即获得多拷贝NKNDD与多拷贝CS.T3的串联体。用Klenow酶补平新的复合片段。将此大片段插入质粒pLS408的EcoRV酶切位点，即可获得含多拷贝NKNDD与多拷贝CS.T3串联体的重组质粒。
, 百拇医药
2.2 筛选阳性克隆
连接产物转化大肠杆菌CL447，选取具有氨苄抗性的转化子，小量抽提质粒，行斑点杂交，得到2个与NKNDD探针杂交阳性的克隆，2个与CS.T3探针杂交阳性的克隆。其中一个克隆与两种探针杂交均为阳性。如图2。
图2 点杂交示图。左部为与NKNDD探针杂交阳性的2个克隆(第84号及第79号)及阳性对照，右部为与CS.T3探针杂交阳性的2个克隆(第93号及第79号)及阳性对照。可见第79号克隆与两种探针杂交均为阳性。
Fig2 Dot blot showed two positive clones hybrydized with NKNDD probe (clone NO.84 and NO.79) and one of which is also positive for CS.T3 probe. (clone NO.79)
, http://www.100md.com
2.3 测序鉴定与两种探针杂交均为阳性的克隆
如图3，测序确证得到含2拷贝NKNDD串联2拷贝CS.T3的重组质粒。
图3 重组质粒的DNA序列图
Fig3 Sequence of the recombinant plasmid
3 讨论
恶性疟是一种严重危害人类健康的热带病，研究抗疟疫苗特别是基因工程重组疫苗，是目前疟疾防治的重点。然而，至今尚无令人满意的有效抗疟基因工程亚单位疫苗问世。筛选适应面广的保护性抗原和表位、构建多价疫苗，是克服疟原虫免疫逃避机制的一项有效措施。
, 百拇医药
本所寄生虫免疫室与分子生物学研究室合作，用能够与许多种疟原虫红内期抗原结合的单抗M26-32，筛选海南岛恶性疟FCC1/HN的cDNA文库，得到14个阳性克隆，根据cDNA序列翻译成的氨基酸顺序，采用八肽扫描技术，鉴定出与单抗结合的抗原表位是以NKND为代表的四肽。它在恶性疟、间日疟、卵圆疟中均存在，并且是世界各地许多疟原虫株(巴西、非洲、中国、泰国、新几内亚等分离株)共有的B表位。因此，NKND如能诱发产生高滴度的抗体，则很有可能帮助人们预防世界各地的恶性疟原虫的感染。另外实验表明在NKND的C末端加一个D能增强它与抗体的结合力[1]。本实验就是采用NKNDD作为候选疫苗的B表位。
CS.T3是恶性疟成熟子孢子表面的环子孢子蛋白CSP的378～398位氨基酸，它的序列在恶性疟各株间相对保守。该位点的一个特点是能与大多数人的组织相容性复合物(Major Histocompatability Complex，MHC)分子结合，克服MHC限制性，被多种不同基因型的人和小鼠的辅助T细胞识别，从而能引起大多数个体产生免疫反应。因此被称为泛T表位(universal)[4]。另外，CS.T3还能诱导T细胞产生IFN-γ，从而激活免疫效应细胞。有人用表达CS.T3抗原的疫苗免疫接种Aotus猴[5]，发现Aotus猴能抵抗疟原虫攻击。同时发现动物体内的抗体与保护作用无关，而动物血清IFN-γ含量增高。提示CS.T3已诱导Aotus猴产生有效的细胞免疫。
, 百拇医药
沙门氏菌作为疫苗表达系统有下列优点：1 能口服，易于接种。2 沙门氏菌减毒活疫苗能够有限感染机体，刺激机体产生持久的免疫反应。Gonzalez等人[6]将表达恶性疟CSP的CVD908菌株口服接种10位志愿者，有3人出现针对CSP的抗体滴度增高，其中一人还产生了针对CSP的细胞免疫。最近，黄建生[7]等人在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中表达了恶性疟杂合113肽抗原。
本实验首次将NKNDD与CS.T3编码序列多拷贝串联，利用CS.T3来加强NKNDD的免疫原性。并将此DNA片段克隆到质粒表达载体pLS408的基因片段H1-d中，后者编码表达相当于鼠伤寒沙门氏菌(salmonela muenchen)的I相鞭毛蛋白的抗原区域，因此，本实验为进一步制备口服抗疟疫苗打下了基础。
参考文献
1 Cheng Q，Jones G，Liu EX，et al.Identification of a common Plasmodium epitope (CPE) recognised by a panspecific inhibitory monoclonal antibody.Mol Biochem Parasitol，1991，49:73
, http://www.100md.com
2 刘尔翔，强伯勤，等.疟疾疫苗研究进展， 阮力等主编“新型疫苗研究的现状与展望”，北京：学苑出版社，1992，238
3 Sambrook J，et al.ed. Molecular Cloning，A laboratory Manual，2nd ed.，New York: Cold Spring Harbor Laboratory，1989
4 Sinigaglia F，Guttinger M，Romagnoli P，et al.Malaria antigens and MHC restriction.Immunol Lett，1990，25:265
5 Herrera MA，Rosero F，Herrera S.Protection against Malaria in Aotus Monkeys Immunized with recombinant blood-stage Antigen fused to a universal T-cell epitope: Correlation of Serum Gamma Interferon levels with Protection.Infect Immun，1992，6:154
6 Gonzalez C，Hone D，Noriega FR，et al.Salmonella typhi vaccine strain CVD908 expressing the circumsporozoite protein of plasmodium falciparum: Strain construction and safety and immunogenicity in humans.Infect Disea，1994，169:927
7 黄建生，王昌才，陈仁荣，等.恶性疟原虫杂合113肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中的初步表达.中国寄生虫防治杂志，1995，8:173, http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院神经科，北京100730
关键词：
基础医学与临床990505 摘要 疟原虫抗原B表位NKND是由本所寄生虫免疫室与分子生物学研究室合作发现的一个疟疾抗原表位。它存在于多种不同的疟原虫分离株。在其C末端加上一个D可以增强它与抗体的结合能力[1]。我们人工合成NKNDD和CS.T3的寡核苷酸片段并将之串联后插入沙门氏菌鞭毛蛋白表达载体。斑点杂交得到阳性克隆。序列分析鉴定为2拷贝NKNDD与2拷贝CS.T3的串联体。
Construction of Salmonella Flagellin Chimera Gene
, http://www.100md.com Containing Malaria Parasite Epitope
Huang Liang Tu Zheng Yin Bin，et al
(Dept. of Molecular Biology and Biochemistry，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing100005)
Abstract A new conserved B-cell epitope of Malaria erythrocytic stage protein，NKND，was firstly reported by Chinese scientists.And CS.T3 is a well-known T-cell epitope.We synthesized oligonucleotides encoding NKNDD and CS.T3 and linked them together.Then the complex gene was inserted into Salmonella flagellin expressing vector.Dot blot and DNA sequencing revealed a recombinant containing two copy NKNDD and two copy CS.T3.
, http://www.100md.com
Key words malaria vaccine Salmonela mueuchen B cell epitope NKND
世界卫生组织(WHO)将疟疾列为应优先控制的六种传染病之首。蚊耐药性和疟原虫抗药性的产生与扩散促使人们考虑发展人工合成多肽和基因工程疫苗来控制疟疾流行[2]。疟原虫抗原B表位NKND是由中国医学科学院基础医学研究所寄生虫免疫室与分子生物学研究室合作发现的一个疟原虫红内期抗原表位。它是一种较理想的候选疫苗抗原表位，存在于多种不同的疟原虫分离株。在其C末端加上一个D可以增强它与抗体的结合能力[1]。我们人工合成NKNDD和CS.T3的寡核苷酸片段并将之串联后插入沙门氏菌鞭毛蛋白表达载体。斑点杂交得到阳性克隆。DNA序列分析鉴定为2拷贝NKNDD与2拷贝CS.T3的串联体。为进一步制备疟疾疫苗打下基础。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 寡核苷酸片段的合成
由本所分子生物学国家重点实验室合成。
NKNDD片段编码序列：
1.1.1 5' AAC AAG AAC GAT GAT 3'
1.1.2 5' TTG CTA CTA TTG TTC 3'
CS.T3片段序列：
1.1.3 5' ATC GCC AAA ATG GAA AAA GCC TCC 3'
1.1.4 5' TTT TTC CAT TTT GGC CAT TTT TTT 3'
, http://www.100md.com 1.1.5 5' AGC GTG TTT AAC GTG AAG AAG 3'
1.1.6 5' CAC GTT AAA CAC GCT GGA GGC 3'
1.1.7 5' AAC AAG AAA AAA 3'
1.1.8 5' CTT GTT CTT CTT 3'
测序引物序列：
5' ACT GCT GTA ACC GTT GAT 3'
1.2 菌株与质粒
含有鞭毛蛋白基因的质粒pLS408，大肠杆菌菌株CL447(k-12 C600 hag)由美国斯坦福大学Stocker教授提供。
, 百拇医药
1.3 主要试剂
T4噬菌体DNA连接酶，Klenow酶，T4多核苷酸激酶为Promega公司产品；γ-32P-ATP购自北京亚辉生物医学工程公司；测序试剂盒采用Promega公司的Circumvent Sequencing kit；C18反向层析柱购自Millipore公司；甲叉双丙烯酰胺购自Fluka公司；TEMED购自E.Merck公司；丙烯酰胺，SDS，PEG8000及过硫酸铵购自Sigma公司。
1.4 寡核苷酸片段的合成及纯化
将合成的NKNDD，CS.T3寡核苷酸片段于55 ℃除氨，真空抽干后溶于0.8 mL饱和脲中。用浓度为19%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离核苷酸片段，电泳电压为600V，缓冲液为TBE，电泳时间为10h。电泳后切下正确大小的DNA条带。于干净试管中，用玻棒将胶条挤碎，并加入1～2mL 0.5mol/L NaCl，37 ℃水浴过夜。用C18反向层析柱对上述合成片段的DNA浸泡液进行吸附与洗脱，冷冻抽干后溶于去离子水或TE缓冲液，定量后于-20 ℃冻存。用γ-32ρ-ATP进行末端标记，并用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影鉴定所得DNA纯度。
, 百拇医药
1.5 人工合成片段的克隆
先将上述合成的DNA片段1～8磷酸化。取等量片段1～7，混匀，于100 ℃水浴5min后，将溶液逐渐降温至室温，过夜，再逐渐降温至4 ℃，备用。在14 ℃下，连接片段1～7约16h，得到一个复合片段(其中含片段1～7)。再取第8片段与此复合片段连接，并补平所得新的复合片段(其中含片段1～8)的两个末端。
将质粒pLS408用EcoRV酶切2h，酶切温度为37 ℃。经酚、氯仿抽提纯化、乙醇沉淀，溶于TE中定量。
将上述DNA大片段与质粒载体于14～16 ℃随机连接24h。
1.6 斑点杂交筛选阳性克隆
转化大肠杆菌CL447，方法同Sambrook方法[3]，并小量抽提转化子质粒。将质粒分别点在两张硝酸纤维膜上。晾干。取前述合成的寡核苷酸片段1或2作NKNDD探针，取寡核苷酸片段5～8之一作CS.T3探针，和γ-32ρ-ATP末端标记这两种探针。探针标记后，直接加入预杂交液中。探针标记及杂交方法同Sambrook方法[3]。
, 百拇医药
与CS.T3探针水浴杂交的硝酸纤维膜的杂交温度为50 ℃。与NKNDD探针杂交的硝酸纤维膜的杂交温度为室温，杂交时间均为3h，并轻轻振摇。
杂交完毕，先将与CS.T3探针杂交的硝酸纤维膜置于50 ℃的2×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，再将膜置于50 ℃的1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，最后将膜置于50 ℃的0.1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，并重复两次；室温下，将与NKNDD探针杂交的另一张硝酸纤维膜置于2×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，再将膜置于1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min，最后将膜置于0.1×SSC溶液(含0.1% SDS)中漂洗10min。晾干上述两张硝酸纤维膜，放射自显影，压片1天后读片。
1.7 测序鉴定阳性克隆
挑取与两种探针杂交均为阳性的转化子，抽提测序模板DNA，测序方法同Sambrook方法[3]。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 重组质粒的构建
本实验选用质粒pLS408作为NKNDD和CS.T3的表达载体。将编码沙门氏菌鞭毛蛋白的基因H1-d插入质粒pUC19的EcoRI的酶切位点后，再用EcoRV酶切除去H1-d基因的48个bp，即可得到鞭毛蛋白表达载体质粒pLS408。外源基因可以插入H1-d基因内的EcoRV酶切位点。如图1。
图1 重组质粒结构图
Fig1 Construction of the recombinant plasmid
片段1～7退火连接后得到复合片段，它是多拷贝NKNDD与单拷贝CS.T3的串联体。片段8与此复合片段再连接，即获得多拷贝NKNDD与多拷贝CS.T3的串联体。用Klenow酶补平新的复合片段。将此大片段插入质粒pLS408的EcoRV酶切位点，即可获得含多拷贝NKNDD与多拷贝CS.T3串联体的重组质粒。
, 百拇医药
2.2 筛选阳性克隆
连接产物转化大肠杆菌CL447，选取具有氨苄抗性的转化子，小量抽提质粒，行斑点杂交，得到2个与NKNDD探针杂交阳性的克隆，2个与CS.T3探针杂交阳性的克隆。其中一个克隆与两种探针杂交均为阳性。如图2。
图2 点杂交示图。左部为与NKNDD探针杂交阳性的2个克隆(第84号及第79号)及阳性对照，右部为与CS.T3探针杂交阳性的2个克隆(第93号及第79号)及阳性对照。可见第79号克隆与两种探针杂交均为阳性。
Fig2 Dot blot showed two positive clones hybrydized with NKNDD probe (clone NO.84 and NO.79) and one of which is also positive for CS.T3 probe. (clone NO.79)
, http://www.100md.com
2.3 测序鉴定与两种探针杂交均为阳性的克隆
如图3，测序确证得到含2拷贝NKNDD串联2拷贝CS.T3的重组质粒。
图3 重组质粒的DNA序列图
Fig3 Sequence of the recombinant plasmid
3 讨论
恶性疟是一种严重危害人类健康的热带病，研究抗疟疫苗特别是基因工程重组疫苗，是目前疟疾防治的重点。然而，至今尚无令人满意的有效抗疟基因工程亚单位疫苗问世。筛选适应面广的保护性抗原和表位、构建多价疫苗，是克服疟原虫免疫逃避机制的一项有效措施。
, 百拇医药
本所寄生虫免疫室与分子生物学研究室合作，用能够与许多种疟原虫红内期抗原结合的单抗M26-32，筛选海南岛恶性疟FCC1/HN的cDNA文库，得到14个阳性克隆，根据cDNA序列翻译成的氨基酸顺序，采用八肽扫描技术，鉴定出与单抗结合的抗原表位是以NKND为代表的四肽。它在恶性疟、间日疟、卵圆疟中均存在，并且是世界各地许多疟原虫株(巴西、非洲、中国、泰国、新几内亚等分离株)共有的B表位。因此，NKND如能诱发产生高滴度的抗体，则很有可能帮助人们预防世界各地的恶性疟原虫的感染。另外实验表明在NKND的C末端加一个D能增强它与抗体的结合力[1]。本实验就是采用NKNDD作为候选疫苗的B表位。
CS.T3是恶性疟成熟子孢子表面的环子孢子蛋白CSP的378～398位氨基酸，它的序列在恶性疟各株间相对保守。该位点的一个特点是能与大多数人的组织相容性复合物(Major Histocompatability Complex，MHC)分子结合，克服MHC限制性，被多种不同基因型的人和小鼠的辅助T细胞识别，从而能引起大多数个体产生免疫反应。因此被称为泛T表位(universal)[4]。另外，CS.T3还能诱导T细胞产生IFN-γ，从而激活免疫效应细胞。有人用表达CS.T3抗原的疫苗免疫接种Aotus猴[5]，发现Aotus猴能抵抗疟原虫攻击。同时发现动物体内的抗体与保护作用无关，而动物血清IFN-γ含量增高。提示CS.T3已诱导Aotus猴产生有效的细胞免疫。
, 百拇医药
沙门氏菌作为疫苗表达系统有下列优点：1 能口服，易于接种。2 沙门氏菌减毒活疫苗能够有限感染机体，刺激机体产生持久的免疫反应。Gonzalez等人[6]将表达恶性疟CSP的CVD908菌株口服接种10位志愿者，有3人出现针对CSP的抗体滴度增高，其中一人还产生了针对CSP的细胞免疫。最近，黄建生[7]等人在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中表达了恶性疟杂合113肽抗原。
本实验首次将NKNDD与CS.T3编码序列多拷贝串联，利用CS.T3来加强NKNDD的免疫原性。并将此DNA片段克隆到质粒表达载体pLS408的基因片段H1-d中，后者编码表达相当于鼠伤寒沙门氏菌(salmonela muenchen)的I相鞭毛蛋白的抗原区域，因此，本实验为进一步制备口服抗疟疫苗打下了基础。
参考文献
1 Cheng Q，Jones G，Liu EX，et al.Identification of a common Plasmodium epitope (CPE) recognised by a panspecific inhibitory monoclonal antibody.Mol Biochem Parasitol，1991，49:73
, http://www.100md.com
2 刘尔翔，强伯勤，等.疟疾疫苗研究进展， 阮力等主编“新型疫苗研究的现状与展望”，北京：学苑出版社，1992，238
3 Sambrook J，et al.ed. Molecular Cloning，A laboratory Manual，2nd ed.，New York: Cold Spring Harbor Laboratory，1989
4 Sinigaglia F，Guttinger M，Romagnoli P，et al.Malaria antigens and MHC restriction.Immunol Lett，1990，25:265
5 Herrera MA，Rosero F，Herrera S.Protection against Malaria in Aotus Monkeys Immunized with recombinant blood-stage Antigen fused to a universal T-cell epitope: Correlation of Serum Gamma Interferon levels with Protection.Infect Immun，1992，6:154
6 Gonzalez C，Hone D，Noriega FR，et al.Salmonella typhi vaccine strain CVD908 expressing the circumsporozoite protein of plasmodium falciparum: Strain construction and safety and immunogenicity in humans.Infect Disea，1994，169:927
7 黄建生，王昌才，陈仁荣，等.恶性疟原虫杂合113肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中的初步表达.中国寄生虫防治杂志，1995，8:173, http://www.100md.com