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编号:10286034
单克隆抗体3D3重链可变区基因结构分析①
http://www.100md.com 《中国免疫学杂志》 1999年第6期
     作者:史依仁 郭先健 颜江华②

    单位:第三军医大学新桥医院呼吸研究所,重庆400037

    关键词:

    中国免疫学杂志/990608 中国图书分类号 Q523-1

    单克隆抗体(McAb)在科研及影像诊断等领域应用十分广泛,鼠源性单克隆抗体,由于其抗原性,在人体疾病治疗应用受到限制,利用DNA重组技术,构建各种重组抗体基因,表达制备重组抗体,可降低其抗原性,前提是必须获得其可变区基因,我们利用设计合成的一对鼠抗体重链可变区引物,采用逆转录PCR方法,扩增抗人肺癌单克隆抗体3D3重链可变区基因[1],并对其进行测序分析,结果表明该DNA全长354 bp编码118个氨基酸。

    1 材料与方法
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    单克隆抗体3D3杂交瘤细胞常规复苏培养,收集培养细胞约1×108提取杂交瘤细胞总RNA,以细胞总RNA为模板,合成cDNA第一链,再以设计合成引物:VHfor:5′-d[ GATATACCCGGGTGTCAAACTG-

    CAGGGAGTCTGG]VHback:5′-d[ATTCTAGACTAGTGAGGAGACGGTGACCAGGGT],常规PCR扩增,电泳鉴定并回收纯化扩增产物,以粘末端方式将扩增单克隆抗体重链可变区基因克隆到puc18/puc19,双脱氧末端终止法[2],对插入重链可变区基因测序分析。

    2 结果与讨论

    测序结果表明单克隆抗体3D3重链可变区基因全长354 bp,编码118个氨基酸,由基因序列推导氨基序列如下:G V K L Q E S G A E L V R D G A D V F L T C A T S D F N I F D T Y I H W V R Q R P E Q G L E W I G R I D P A N A N T N Y D Q K F K D K A T L T A D Y S S N T V F L H V S S L T S A D T A V Y Y C A R W D T T A L F D C W G Q Q TT V S V S S。
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    同源性分析表明我们获得的DNA序列为单克隆抗体3D3重链可变区基因,与小鼠Ig重链可变区基因同源性达75%~85%,与其它基因序列无显著意义同源。进一步分析表明,该抗体重链可变区基因片段(VH)编码氨基酸序列与小鼠Ig重链可变区Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组同源性分别为45%、71%、49%、60%,又与Ⅱ(c)亚组同源性为最高达78%,连接基因片段(JH)编码氨基酸序列符合JH2基因编码氨基酸序列特点[3]。因此我们认为单克隆抗体3D3重链可变区基因是由胚系可变区基因片段(VH),多样性基因片段(D)和连接基因段(JH2)重排而成,属Ⅱ(C)亚组。免疫球蛋白重链可变区基因重排机制较复杂,涉及VH,D,JH基因片段识别、切割、连接及碱基剪切、增加等机制,因此,VH、D、JH连接方式多样,造成免疫球蛋白重链可变区高度可变性,尤其表现在重链可变区CDR3。小鼠免疫球蛋白重链CDR3长度由2~19个氨基酸残基组成,表面成分较复杂的抗原刺激产生较长CDR3,使抗体有足够空间与之更好地结合,反之较平坦简单抗原产生CDR3较短[4],本实验获得VH基因编码CDR1、CDR2、CDR3氨基酸残基分别有5、17、9个。CDR3为9个氨基酸,推测其识别相应抗原较复杂。
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    单克隆抗体3D3识别抗原在人肺癌细胞膜上有较高表达,我们从其杂交瘤细胞中获得了该抗体重链可变区基因,为进一步构建基因工程免疫毒素打下基础。

    ①本课题受国家自然科学基金资助(39300015)

    ②厦门大学抗癌研究中心

    作者简介:史依仁,男,32岁,博士

    3 参考文献

    1 颜江华.抗人肺癌单克隆抗体3D3的研制及其特性鉴定.单克隆抗体通讯,1992;8(3):22

    2 Sanger F, Nicklen S, Conlson A R. DNA Sequencing with chain-terninating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1987;74(12):5463
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    3 Kabat E A, Wutt, Perry H M et al. Sequences of proteins of immunlogical Interest [us], Deparpment of Health and Human Services, Bethasda:NIH, MD, 1991: 4351~4387

    4 Chen PP. Structural analysis of human developmentally regulatal VH genes. Scand J Immunol, 1990;(3):257

    [收稿1997-07-20 修回1998-03-07], 百拇医药