法呢基转移酶抑制剂抗癌机理及筛选方法的研究进展
作者：刘宏伟 姚新生
单位：沈阳药科大学中药系
关键词：ras蛋白；法呢基转移酶抑制剂；抗癌药物
沈阳药科大学学报990418 摘 要 综述了法呢基转移酶抑制剂的抗癌机理、筛选方法和开发前景.法呢基转移酶抑制剂通过抑制癌细胞中功能异常的ras蛋白的法呢基化发挥作用.
分类号 R979.1
A Survey of Studies on the Action Mechanism and the Screening Methods of Farnesyltransferase Inhibitors as Anti-cancer Drugs
Liu Hongwei,Yao Xinsheng
, http://www.100md.com
Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract Mutant ras gene is routinely found in most of tumour cells,it has become a novel target for the cancer therapy.Farnesyltransferase inhibitors can effectively inhibit the farnesylation of ras protein in tumour cells,therefore prevent the proliferation and differentiation of tumour cells.The screening methods for farnesyltransferase inhibitor have been set up at various levels.This paper is mainly concerned with the recent studies on the action mechanism and the screening methods of farmesyltransferase inhibitors as anti-cancer drugs.
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Key words ras protein;farnesyltransferase inhibitors;anti-cancer agents
法呢基转移酶(famesytransferase,FTase)抑制剂是近年来新抗癌药物研究领域的热点之一，并已成为寻找治疗肿瘤药物的一条新的有效途径.目前在世界上许多大的制药公司和实验室都在进行着大规模的筛选〔1，2〕，这方面的工作在国外已有许多报道.到目前为止，洛伐他汀(lovasatatin)和橙皮油的主要单萜成分苎烯(d-limonene)作为法呢基转移酶抑制剂，已进入肿瘤Ⅰ期临床试验.法呢基转移酶(FTase)抑制剂具有筛选方法简单、多样，作用机理明确的特点，值得深入研究和开发.作者从法呢基转移酶抑制剂(FTase inhibitor FTI)作为抗肿瘤药物的作用机理、筛选方法、开发前景等方面加以综述.
1 法呢基转移酶抑制剂抗肿瘤的作用机理
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1.1 法呢基转移酶抑制剂与ras蛋白的关系
Fig.1 Activation of ras protein
ras蛋白是由ras基因转录、翻译的一类分布于细胞膜内侧并有结合鸟核苷酸功能的蛋白质的总称.如图1所示：ras蛋白由α、β、γ三个亚基组成.α亚基含有与GDP和GTP的结合位点，在基态时α与GDP结合，并与β、γ亚基结合为复合体.当与ras蛋白耦连的受体被激活后，GDP被GTP取代，同时β、γ亚基与α亚基分离.α-GTP成为ras蛋白的活化形式，并进一步与效应器作用，行使ras蛋白的各种功能.由于α亚基本身含有GTPase的活性，因此可以使复合物逐渐转变为α-GDP而失活，并与β、γ亚基重新缔合，进入下一个循环〔3〕.
到目前为止，G-蛋白的功能已经研究得非常透彻，它是细胞信号网络的中枢分子之一，是多条信号通路的汇合点，控制非常广泛的细胞功能.除了与正常和变异的细胞生长、分化有关外，还监视和控制着细胞外信息的流入及细胞内各腔室间信息的传递，并且控制细胞骨架的形成和相关功能〔4，5〕.ras蛋白要通过翻译后加上特殊的脂类分子，才能固着于细胞膜的特定部位，从而发挥其信号传递作用.法呢基转移酶是ras蛋白脂类共价修饰过程中最关键的酶，它催化的是ras蛋白脂类修饰的第一步反应，即首先识别ras蛋白C末端的CA1A2X四肽(C为半胱氨酸，A为脂肪族氨基酸，X一般为蛋氨酸或色氨酸)，然后把焦磷酸法呢基酯(FPP)的法呢基转到CA1A2X的半胱氨酸巯基上，这一步对ras蛋白的膜定位和生物活性是不可缺少的〔6〕.
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1.2 ras蛋白与肿瘤细胞的关系
ras蛋白的功能异常在人类肿瘤中是个非常普遍的现象.据报道，ras突变基因约存在于50%的肺癌和肠癌中、95%有胰腺癌中〔7〕.突变ras基因产生的ras蛋白有极高的传导活性，而这种极高的传导活性是一些肿瘤细胞生长、分化所必须的.在正常细胞中，ras蛋白是通过自身GTPase活性从GTP结合的活化形式变为GDP结合的非活化形式.但是在肿瘤细胞中，变异的ras基因破坏了GTPase的活性，导致了细胞生长的失控和正常细胞的癌变.研究发现正常细胞的癌变至少在某种程度上是由于有丝分裂过程中信号的不正常调控造成的.法呢基转移酶抑制剂能够通过抑制法呢基化使ras蛋白脂类修饰受阻，ras蛋白不能定位于细胞膜，无法行使其信号传导功能，从而使那些依赖于高活性的ras蛋白的肿瘤生长受到抑制，所以FTase抑制剂具有抗癌活性〔8〕.1995年Kohl等人首次观察了FTase抑制剂对ras转化细胞在裸鼠中生长抑制情况〔9〕.同年，Sun等人首次报道了FTase抑制剂FTI 276可以选择性抑制基因突变的人肺癌细胞在裸鼠中的生长，而对无突变的人肺癌细胞则效果不明显〔10〕.
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最新研究发现法呢基转移酶抑制剂不仅抑制那些依赖于高活性的ras蛋白的肿瘤生长，其他具有野生型ras基因和ras非突变型的肿瘤细胞对FTI也很敏感.这是因为很多肿瘤的发生、发展与受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase)的激活有关.在很多肿瘤细胞中均发现了活化的酪氨酸激酶.酪氨酸激酶是一种与激活有丝分裂过程有关的蛋白激酶.它的活化与肿瘤细胞的产生、无限分裂和致瘤性的维持密切相关〔11〕.在肿瘤细胞中酪氨酸激酶的功能要依赖于高活性的ras蛋白.然而，这种高活性的ras蛋白并不是由于突变造成的，而是依赖于酪氨酸激酶的激活和上游信号的调控.法呢基转移酶抑制剂能够通过抑制法呢基化使ras蛋白脂类修饰受阻，ras蛋白不能定位于细胞膜，无法行使其信号传导功能，从而抑制了含有活化的酪氨酸激酶的肿瘤细胞的生长和繁殖.L-144832是CA1A2X类似物，可以有效地抑制ras蛋白的法呢基化，Laura Sepp等人的研究发现对70%的被测瘤株生长受到抑制〔12〕(见表1).
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1.3 法呢基转移酶抑制剂与正常细胞的关系
在哺乳动物细胞中，FTase的底物并不仅限于ras蛋白，还包含核纤层蛋白、视紫红质激酶等几种蛋白质.那么FTase抑制剂在有效剂量下会不会对正常细胞有影响呢?到目前为止，所有已报道的体内试验中，FTI在有效剂量下均没有引起动物的毒副反应.许多学者在这方面进行了研究，并提出了下面几种假设：在正常细胞中，当FTase被抑制后，一些需要法呢基化的蛋白会变为GGPTase的底物，而GGPTase不受FTase抑制剂的影响.这种假设已在Saccharom cerevisiae酵母中被证实了，这种酵母由于突变缺乏FTP酶，但却由于GGPT酶的补偿作用仍能正常生长〔13〕.体内需法呢基化的蛋白质对FTI的敏感度不同，如要抑制nuclear lamin B的法呢基化需要FTI浓度比抑制敏感肿瘤细胞高得多〔14，15〕.由于肿瘤细胞依赖于高活性的ras蛋白，一旦ras蛋白的法呢基化受到抑制，即使是很轻微的抑制，肿瘤细胞也不能正常生长、分裂，FTI治疗浓度通常在2～20 μmol/L；而正常细胞在这个浓度下受的影响不大.此外还有人提出在正常细胞和对FTI有抗性的肿瘤细胞中可能存在着不依赖ras蛋白功能的酪氨酸激酶活化的有丝分裂过程的通路.但是在肿瘤细胞中依赖高活性ras蛋白功能，使酪氨酸激酶活化的有丝分裂过程占主导作用，而这一过程是肿瘤细胞维持无限增殖能力和致瘤性的原因〔12〕
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Tab.1 Anticancer activity of L-144832 as FTI Cell line
FTI sensitivity
Cell line
FTI sensitivity
Breast
Lung
MCF7
S
H1264
S
MDA MB-468
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S
H2122
S
MDA MB-453
S
H460
S
T47-D
R
H345
S
BT474
R
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H716
S
SkBr3
R
H510A
S
MDA MB-231
S
Cervical
Colon
HeLa
R
Colo 205
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S
Epidermoid
HT-29
S
A431
S
LoVo-29
S
Hematopoietic
DiFi
S
HL60
S
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SW1417
R
JD38
S
DLD-1
R
Namalwa
S
LS180
R
K562
S
Pencreas
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MOLT4
S
PANC-1
R
CEM
S
AsPC-1
R
Ewing sarcoma
Capan-2
S
RD-ES
S
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PSN-1
S
Ovarian
Prostate
OVCAR420
S
PC-3
S
OVCAR429
R
DU145
R
OVCAR432
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S
DuPro-1
S
OVCAR433
S
LNCap
S
S—sensitive to L-144832；R—resistent to L-144832
2 法呢基转移酶抑制剂及其筛选方法
FTI一方面来自对天然产物的筛选，另一方面来自人工合成.它们可以分为四类：一类是FPP类似物，以α-羟基焦磷酸法呢基酯和手性霉素为代表〔1〕；一类是CA1A2X类似物，这方面的研究报道很多且已经发现了一些有潜力的FTI〔14～16〕；另两类是双底物类似物和非FPP和CA1A2X类似物的FTI，已经进入肿瘤Ⅰ期临床试验的洛伐他汀和橙皮油的主要单萜成分苎烯属于第四类〔17〕.图2列出了一些有代表性的FTI的结构.
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建立一套合理的筛选方法是从数量众多的天然产物和合成的系列化合物中找出有临床前景的FTase抑制剂的前提.已有的筛选方法建立在3个水平上：无细胞水平、细胞水平和体内水平.下面逐一介绍.
2.1 无细胞水平的筛选
即直接用纯化的FTase酶在人工反应体系中测定化合物对FTase活性的抑制作用.FTase一般从牛或大鼠的脑组织中提取，报道的纯化方法虽然各不相同，但大体上按下面的程序进行：组织捣碎→破细胞→分离胞浆→30%～50%硫酸铵分级沉淀→DEAE离子交换层析→亲和层析(以ras蛋白C末端的六肽作为配基)，在亲和层析之前或之后还可进行凝胶过滤，总纯化倍数可达2 000倍以上〔17〕.FTase的活性测定方法有多种，最常见的一种是测定[3H]法呢基从[3H]FPP转到ras蛋白的数量.一个酶活力单位定义为：1 h内在标准反应条件(37℃，pH 7.4)下，把1 pmol[3H]法呢基转移到ras蛋白上去的酶量.这种方法的关键是要能够完全分离标记的反应产物〔18〕.通常采用下面两种方法.
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Fig.2 Structures of typical FTase inhibitors
过滤法：先用酸(三氯乙酸或盐酸)终止反应和沉淀反应产物，然后沉淀的反应产物用一定孔径的玻璃纤维滤器分离.酸的沉淀是关键，它一方面决定了产物是否被定量沉淀，另一方面还分解未反应的[3H]FPP，以降低测定时的背景放射量.
免疫沉淀法：用ras蛋白的单抗沉淀ras蛋白.这种方法虽然被不少实验室采用，但有学者认为法呢基化后的ras蛋白不能被ras蛋白的单抗定量沉淀，所以此法的线形较差〔19〕.
2.2 细胞水平的筛选
用FTase筛选虽然直接，但筛选出的许多抑制剂并不能抑制细胞内的FTase，此类抑制剂很难用于治疗.因此需要在细胞水平进一步筛选.
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gpal酵母突变株筛选模型：这个模型发现较早，应用也较广.在啤酒酵母中，Gm蛋白负责将交配外激素携带的信号向细胞核内传递，Gm蛋白由α、β、γ三个亚基组成，分别由GAP1、STE4、STE18基因编码，其中γ亚基需要进行法呢基化才有生物活性.Gm接受到交配信号后，β、γ复合物与α亚基分离，作为生长抑制物使酵母细胞停滞在期，引起生长抑制.在galp突变株中，GPA基因发生突变，不能表达α亚基，β、γ一直处于游离状态，因而这种酵母突变株不能生长和分裂，而FTI剂则可以通过抑制法呢基化抑制γ亚基的活性，从而使突变株得以重新生长和分裂.将galp突变株在半乳糖的培养基中30℃培养至静止生长期，然后将50 μL的上述培养基与50 mL的葡萄糖琼脂混合制成琼脂板.待测化合物溶于DMSO，配成不同浓度的待测液，将浸有待测液的圆纸片放在琼脂板上，于30℃培养3 d，测量菌株生长圈的直径.手性霉素(manumycin)族抗生素的3种抑制剂就是用这种方法从链霉属中筛选出来的〔20〕.
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ras转化细胞模型：测定待测化合物对ras癌基因转化活性和ras转化细胞在软琼脂上停泊非依赖性生长的抑制作用是筛选FTase抑制剂更常用的一种细胞水平方法.以抑制转化细胞的停泊非依赖性生长和单层培养生长被认为是筛选FTase抑制剂的合适指标〔21〕.
蛙卵母细胞模型：显微注射ras蛋白可以刺激蛙卵母细胞进行成熟分裂，引起胚泡破裂，与此相对应的特征是蛙卵母细胞一端出现白色斑块.如果FTase抑制剂和ras蛋白一起注射到卵母细胞中，则可抑制该过程的发生，且具有剂量依赖性〔14〕.
2.3 体内水平的筛选
同研究其他抗癌药物一样，在体内水平研究FTase抑制剂的作用是将其发展成为临床药物所必须的.目前，体内水平的筛选主要有3种方法：线虫模型、转基因动物、裸鼠实验.由于利用转基因动物和裸鼠进行筛选实验条件要求高，花费较大，不适于大规模筛选.作者主要介绍线虫模型.该模型操作简单、周期短、灵敏度较高，适合在国内条件下进行.
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秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是研究细胞凋亡的常用动物模型.它的let-60基因表达产物属于蛋白家族的成员，也需要进行法呢基化，并且与人蛋白有83%序列完全相同，在C.elegans的生殖孔发育过程中起关键作用.生殖孔是两性体C.elegans与雄性个体交配和产卵的器官.野生型两性体幼虫有6个前体细胞，其中3个发育成生殖孔，另外3个则形成真皮组织，let-60蛋白是决定这6个细胞发育的开关分子.当let-60基因发生功能丧失性(loss-of-function)突变时，只有少于3个的前体细胞发育成生殖孔，形成无生殖孔表型(vulvalless,Vul).而发生功能性获得(gain-of-function)突变时则正好相反，最后形成多生殖孔表型(multivulva,Muv).let-60蛋白介导的调控线虫生殖孔发育的信号通路和哺乳动物细胞中ras蛋白介导的增殖信号通路相似，也有一个RTK-Ras-Raf-MAPK级联，并且gf突变和人肿瘤中ras蛋白的一种突变相同，Gly-12→Glu-13，因此C.elegans中发生gf突变引起的Muv表型与人某些肿瘤中突变引起的恶性增殖表型很类似.FTase抑制剂可以通过抑制法呢基化抑制Let-60 ras蛋白功能，从而抑制发生gf突变引起的C.elegans的幼虫Muv表型，并且具有剂量依赖关系，可以用来评价FTase抑制剂的活性.将被测化合物溶于DMSO中，配成各种浓度的待测液.取50 μL的待测液与450 μL的M 9缓冲液混合，迅速加入含有处于同步生长期的线虫胚胎的琼脂板中.经过孵化后，在20℃饲养4～5 d，然后用差示显微镜观察，计算出幼虫Muv表型的百分率.线虫已经具有简单的器官和系统分化，并且易于大量饲养，是一种简便、经济、有效的筛选模型〔22〕.
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筛选FTI作为抗癌药物属于基于机制的定向筛选，与传统筛选方法不同的是，进入这种定向筛选的化合物首先必需确定是FTI，然后再去确定它们是否具有抗癌活性；筛选程序则要求先建立一套针对FTase的筛选模型，看待测化合物在这些模型中是否有效.在以上所介绍的各种水平的筛选体系中，无细胞水平的筛选操作起来比较繁琐且花费比较大，影响因素较多，不适合大规模的筛选.细胞水平的筛选方法中，利用突变酵母筛选的方法简单、快速、有效，比较适合大规模的筛选和在现有条件下采用.此外，体内筛选方法中的利用秀丽隐杆线虫的体系也较适合于初筛.FTI作为一类新型、低毒、安全抗癌药物也已受到了广泛的重视，包括Merk公司下属的实验室都在竞相发展新的、尤其是具有临床发展前景的FTase抑制剂.到目前为止，有洛伐他丁、橙皮油的主要单萜成分苎烯已进入肿瘤Ⅰ期临床〔15〕.寻找作用于ras蛋白的抗癌药物已成为近年来抗癌药物研究领域的热点之一〔23〕.可以预见在不久的将来FTI将成为一类新的抗癌药物.
参考文献
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收稿日期:1999-03-05, http://www.100md.com
单位：沈阳药科大学中药系
关键词：ras蛋白；法呢基转移酶抑制剂；抗癌药物
沈阳药科大学学报990418 摘 要 综述了法呢基转移酶抑制剂的抗癌机理、筛选方法和开发前景.法呢基转移酶抑制剂通过抑制癌细胞中功能异常的ras蛋白的法呢基化发挥作用.
分类号 R979.1
A Survey of Studies on the Action Mechanism and the Screening Methods of Farnesyltransferase Inhibitors as Anti-cancer Drugs
Liu Hongwei,Yao Xinsheng
, http://www.100md.com
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Abstract Mutant ras gene is routinely found in most of tumour cells,it has become a novel target for the cancer therapy.Farnesyltransferase inhibitors can effectively inhibit the farnesylation of ras protein in tumour cells,therefore prevent the proliferation and differentiation of tumour cells.The screening methods for farnesyltransferase inhibitor have been set up at various levels.This paper is mainly concerned with the recent studies on the action mechanism and the screening methods of farmesyltransferase inhibitors as anti-cancer drugs.
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法呢基转移酶(famesytransferase,FTase)抑制剂是近年来新抗癌药物研究领域的热点之一，并已成为寻找治疗肿瘤药物的一条新的有效途径.目前在世界上许多大的制药公司和实验室都在进行着大规模的筛选〔1，2〕，这方面的工作在国外已有许多报道.到目前为止，洛伐他汀(lovasatatin)和橙皮油的主要单萜成分苎烯(d-limonene)作为法呢基转移酶抑制剂，已进入肿瘤Ⅰ期临床试验.法呢基转移酶(FTase)抑制剂具有筛选方法简单、多样，作用机理明确的特点，值得深入研究和开发.作者从法呢基转移酶抑制剂(FTase inhibitor FTI)作为抗肿瘤药物的作用机理、筛选方法、开发前景等方面加以综述.
1 法呢基转移酶抑制剂抗肿瘤的作用机理
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1.1 法呢基转移酶抑制剂与ras蛋白的关系
Fig.1 Activation of ras protein
ras蛋白是由ras基因转录、翻译的一类分布于细胞膜内侧并有结合鸟核苷酸功能的蛋白质的总称.如图1所示：ras蛋白由α、β、γ三个亚基组成.α亚基含有与GDP和GTP的结合位点，在基态时α与GDP结合，并与β、γ亚基结合为复合体.当与ras蛋白耦连的受体被激活后，GDP被GTP取代，同时β、γ亚基与α亚基分离.α-GTP成为ras蛋白的活化形式，并进一步与效应器作用，行使ras蛋白的各种功能.由于α亚基本身含有GTPase的活性，因此可以使复合物逐渐转变为α-GDP而失活，并与β、γ亚基重新缔合，进入下一个循环〔3〕.
到目前为止，G-蛋白的功能已经研究得非常透彻，它是细胞信号网络的中枢分子之一，是多条信号通路的汇合点，控制非常广泛的细胞功能.除了与正常和变异的细胞生长、分化有关外，还监视和控制着细胞外信息的流入及细胞内各腔室间信息的传递，并且控制细胞骨架的形成和相关功能〔4，5〕.ras蛋白要通过翻译后加上特殊的脂类分子，才能固着于细胞膜的特定部位，从而发挥其信号传递作用.法呢基转移酶是ras蛋白脂类共价修饰过程中最关键的酶，它催化的是ras蛋白脂类修饰的第一步反应，即首先识别ras蛋白C末端的CA1A2X四肽(C为半胱氨酸，A为脂肪族氨基酸，X一般为蛋氨酸或色氨酸)，然后把焦磷酸法呢基酯(FPP)的法呢基转到CA1A2X的半胱氨酸巯基上，这一步对ras蛋白的膜定位和生物活性是不可缺少的〔6〕.
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1.2 ras蛋白与肿瘤细胞的关系
ras蛋白的功能异常在人类肿瘤中是个非常普遍的现象.据报道，ras突变基因约存在于50%的肺癌和肠癌中、95%有胰腺癌中〔7〕.突变ras基因产生的ras蛋白有极高的传导活性，而这种极高的传导活性是一些肿瘤细胞生长、分化所必须的.在正常细胞中，ras蛋白是通过自身GTPase活性从GTP结合的活化形式变为GDP结合的非活化形式.但是在肿瘤细胞中，变异的ras基因破坏了GTPase的活性，导致了细胞生长的失控和正常细胞的癌变.研究发现正常细胞的癌变至少在某种程度上是由于有丝分裂过程中信号的不正常调控造成的.法呢基转移酶抑制剂能够通过抑制法呢基化使ras蛋白脂类修饰受阻，ras蛋白不能定位于细胞膜，无法行使其信号传导功能，从而使那些依赖于高活性的ras蛋白的肿瘤生长受到抑制，所以FTase抑制剂具有抗癌活性〔8〕.1995年Kohl等人首次观察了FTase抑制剂对ras转化细胞在裸鼠中生长抑制情况〔9〕.同年，Sun等人首次报道了FTase抑制剂FTI 276可以选择性抑制基因突变的人肺癌细胞在裸鼠中的生长，而对无突变的人肺癌细胞则效果不明显〔10〕.
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最新研究发现法呢基转移酶抑制剂不仅抑制那些依赖于高活性的ras蛋白的肿瘤生长，其他具有野生型ras基因和ras非突变型的肿瘤细胞对FTI也很敏感.这是因为很多肿瘤的发生、发展与受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase)的激活有关.在很多肿瘤细胞中均发现了活化的酪氨酸激酶.酪氨酸激酶是一种与激活有丝分裂过程有关的蛋白激酶.它的活化与肿瘤细胞的产生、无限分裂和致瘤性的维持密切相关〔11〕.在肿瘤细胞中酪氨酸激酶的功能要依赖于高活性的ras蛋白.然而，这种高活性的ras蛋白并不是由于突变造成的，而是依赖于酪氨酸激酶的激活和上游信号的调控.法呢基转移酶抑制剂能够通过抑制法呢基化使ras蛋白脂类修饰受阻，ras蛋白不能定位于细胞膜，无法行使其信号传导功能，从而抑制了含有活化的酪氨酸激酶的肿瘤细胞的生长和繁殖.L-144832是CA1A2X类似物，可以有效地抑制ras蛋白的法呢基化，Laura Sepp等人的研究发现对70%的被测瘤株生长受到抑制〔12〕(见表1).
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1.3 法呢基转移酶抑制剂与正常细胞的关系
在哺乳动物细胞中，FTase的底物并不仅限于ras蛋白，还包含核纤层蛋白、视紫红质激酶等几种蛋白质.那么FTase抑制剂在有效剂量下会不会对正常细胞有影响呢?到目前为止，所有已报道的体内试验中，FTI在有效剂量下均没有引起动物的毒副反应.许多学者在这方面进行了研究，并提出了下面几种假设：在正常细胞中，当FTase被抑制后，一些需要法呢基化的蛋白会变为GGPTase的底物，而GGPTase不受FTase抑制剂的影响.这种假设已在Saccharom cerevisiae酵母中被证实了，这种酵母由于突变缺乏FTP酶，但却由于GGPT酶的补偿作用仍能正常生长〔13〕.体内需法呢基化的蛋白质对FTI的敏感度不同，如要抑制nuclear lamin B的法呢基化需要FTI浓度比抑制敏感肿瘤细胞高得多〔14，15〕.由于肿瘤细胞依赖于高活性的ras蛋白，一旦ras蛋白的法呢基化受到抑制，即使是很轻微的抑制，肿瘤细胞也不能正常生长、分裂，FTI治疗浓度通常在2～20 μmol/L；而正常细胞在这个浓度下受的影响不大.此外还有人提出在正常细胞和对FTI有抗性的肿瘤细胞中可能存在着不依赖ras蛋白功能的酪氨酸激酶活化的有丝分裂过程的通路.但是在肿瘤细胞中依赖高活性ras蛋白功能，使酪氨酸激酶活化的有丝分裂过程占主导作用，而这一过程是肿瘤细胞维持无限增殖能力和致瘤性的原因〔12〕
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Tab.1 Anticancer activity of L-144832 as FTI Cell line
FTI sensitivity
Cell line
FTI sensitivity
Breast
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MDA MB-453
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H460
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T47-D
R
H345
S
BT474
R
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H716
S
SkBr3
R
H510A
S
MDA MB-231
S
Cervical
Colon
HeLa
R
Colo 205
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S
Epidermoid
HT-29
S
A431
S
LoVo-29
S
Hematopoietic
DiFi
S
HL60
S
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SW1417
R
JD38
S
DLD-1
R
Namalwa
S
LS180
R
K562
S
Pencreas
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MOLT4
S
PANC-1
R
CEM
S
AsPC-1
R
Ewing sarcoma
Capan-2
S
RD-ES
S
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PSN-1
S
Ovarian
Prostate
OVCAR420
S
PC-3
S
OVCAR429
R
DU145
R
OVCAR432
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S
DuPro-1
S
OVCAR433
S
LNCap
S
S—sensitive to L-144832；R—resistent to L-144832
2 法呢基转移酶抑制剂及其筛选方法
FTI一方面来自对天然产物的筛选，另一方面来自人工合成.它们可以分为四类：一类是FPP类似物，以α-羟基焦磷酸法呢基酯和手性霉素为代表〔1〕；一类是CA1A2X类似物，这方面的研究报道很多且已经发现了一些有潜力的FTI〔14～16〕；另两类是双底物类似物和非FPP和CA1A2X类似物的FTI，已经进入肿瘤Ⅰ期临床试验的洛伐他汀和橙皮油的主要单萜成分苎烯属于第四类〔17〕.图2列出了一些有代表性的FTI的结构.
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建立一套合理的筛选方法是从数量众多的天然产物和合成的系列化合物中找出有临床前景的FTase抑制剂的前提.已有的筛选方法建立在3个水平上：无细胞水平、细胞水平和体内水平.下面逐一介绍.
2.1 无细胞水平的筛选
即直接用纯化的FTase酶在人工反应体系中测定化合物对FTase活性的抑制作用.FTase一般从牛或大鼠的脑组织中提取，报道的纯化方法虽然各不相同，但大体上按下面的程序进行：组织捣碎→破细胞→分离胞浆→30%～50%硫酸铵分级沉淀→DEAE离子交换层析→亲和层析(以ras蛋白C末端的六肽作为配基)，在亲和层析之前或之后还可进行凝胶过滤，总纯化倍数可达2 000倍以上〔17〕.FTase的活性测定方法有多种，最常见的一种是测定[3H]法呢基从[3H]FPP转到ras蛋白的数量.一个酶活力单位定义为：1 h内在标准反应条件(37℃，pH 7.4)下，把1 pmol[3H]法呢基转移到ras蛋白上去的酶量.这种方法的关键是要能够完全分离标记的反应产物〔18〕.通常采用下面两种方法.
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Fig.2 Structures of typical FTase inhibitors
过滤法：先用酸(三氯乙酸或盐酸)终止反应和沉淀反应产物，然后沉淀的反应产物用一定孔径的玻璃纤维滤器分离.酸的沉淀是关键，它一方面决定了产物是否被定量沉淀，另一方面还分解未反应的[3H]FPP，以降低测定时的背景放射量.
免疫沉淀法：用ras蛋白的单抗沉淀ras蛋白.这种方法虽然被不少实验室采用，但有学者认为法呢基化后的ras蛋白不能被ras蛋白的单抗定量沉淀，所以此法的线形较差〔19〕.
2.2 细胞水平的筛选
用FTase筛选虽然直接，但筛选出的许多抑制剂并不能抑制细胞内的FTase，此类抑制剂很难用于治疗.因此需要在细胞水平进一步筛选.
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gpal酵母突变株筛选模型：这个模型发现较早，应用也较广.在啤酒酵母中，Gm蛋白负责将交配外激素携带的信号向细胞核内传递，Gm蛋白由α、β、γ三个亚基组成，分别由GAP1、STE4、STE18基因编码，其中γ亚基需要进行法呢基化才有生物活性.Gm接受到交配信号后，β、γ复合物与α亚基分离，作为生长抑制物使酵母细胞停滞在期，引起生长抑制.在galp突变株中，GPA基因发生突变，不能表达α亚基，β、γ一直处于游离状态，因而这种酵母突变株不能生长和分裂，而FTI剂则可以通过抑制法呢基化抑制γ亚基的活性，从而使突变株得以重新生长和分裂.将galp突变株在半乳糖的培养基中30℃培养至静止生长期，然后将50 μL的上述培养基与50 mL的葡萄糖琼脂混合制成琼脂板.待测化合物溶于DMSO，配成不同浓度的待测液，将浸有待测液的圆纸片放在琼脂板上，于30℃培养3 d，测量菌株生长圈的直径.手性霉素(manumycin)族抗生素的3种抑制剂就是用这种方法从链霉属中筛选出来的〔20〕.
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ras转化细胞模型：测定待测化合物对ras癌基因转化活性和ras转化细胞在软琼脂上停泊非依赖性生长的抑制作用是筛选FTase抑制剂更常用的一种细胞水平方法.以抑制转化细胞的停泊非依赖性生长和单层培养生长被认为是筛选FTase抑制剂的合适指标〔21〕.
蛙卵母细胞模型：显微注射ras蛋白可以刺激蛙卵母细胞进行成熟分裂，引起胚泡破裂，与此相对应的特征是蛙卵母细胞一端出现白色斑块.如果FTase抑制剂和ras蛋白一起注射到卵母细胞中，则可抑制该过程的发生，且具有剂量依赖性〔14〕.
2.3 体内水平的筛选
同研究其他抗癌药物一样，在体内水平研究FTase抑制剂的作用是将其发展成为临床药物所必须的.目前，体内水平的筛选主要有3种方法：线虫模型、转基因动物、裸鼠实验.由于利用转基因动物和裸鼠进行筛选实验条件要求高，花费较大，不适于大规模筛选.作者主要介绍线虫模型.该模型操作简单、周期短、灵敏度较高，适合在国内条件下进行.
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秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是研究细胞凋亡的常用动物模型.它的let-60基因表达产物属于蛋白家族的成员，也需要进行法呢基化，并且与人蛋白有83%序列完全相同，在C.elegans的生殖孔发育过程中起关键作用.生殖孔是两性体C.elegans与雄性个体交配和产卵的器官.野生型两性体幼虫有6个前体细胞，其中3个发育成生殖孔，另外3个则形成真皮组织，let-60蛋白是决定这6个细胞发育的开关分子.当let-60基因发生功能丧失性(loss-of-function)突变时，只有少于3个的前体细胞发育成生殖孔，形成无生殖孔表型(vulvalless,Vul).而发生功能性获得(gain-of-function)突变时则正好相反，最后形成多生殖孔表型(multivulva,Muv).let-60蛋白介导的调控线虫生殖孔发育的信号通路和哺乳动物细胞中ras蛋白介导的增殖信号通路相似，也有一个RTK-Ras-Raf-MAPK级联，并且gf突变和人肿瘤中ras蛋白的一种突变相同，Gly-12→Glu-13，因此C.elegans中发生gf突变引起的Muv表型与人某些肿瘤中突变引起的恶性增殖表型很类似.FTase抑制剂可以通过抑制法呢基化抑制Let-60 ras蛋白功能，从而抑制发生gf突变引起的C.elegans的幼虫Muv表型，并且具有剂量依赖关系，可以用来评价FTase抑制剂的活性.将被测化合物溶于DMSO中，配成各种浓度的待测液.取50 μL的待测液与450 μL的M 9缓冲液混合，迅速加入含有处于同步生长期的线虫胚胎的琼脂板中.经过孵化后，在20℃饲养4～5 d，然后用差示显微镜观察，计算出幼虫Muv表型的百分率.线虫已经具有简单的器官和系统分化，并且易于大量饲养，是一种简便、经济、有效的筛选模型〔22〕.
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筛选FTI作为抗癌药物属于基于机制的定向筛选，与传统筛选方法不同的是，进入这种定向筛选的化合物首先必需确定是FTI，然后再去确定它们是否具有抗癌活性；筛选程序则要求先建立一套针对FTase的筛选模型，看待测化合物在这些模型中是否有效.在以上所介绍的各种水平的筛选体系中，无细胞水平的筛选操作起来比较繁琐且花费比较大，影响因素较多，不适合大规模的筛选.细胞水平的筛选方法中，利用突变酵母筛选的方法简单、快速、有效，比较适合大规模的筛选和在现有条件下采用.此外，体内筛选方法中的利用秀丽隐杆线虫的体系也较适合于初筛.FTI作为一类新型、低毒、安全抗癌药物也已受到了广泛的重视，包括Merk公司下属的实验室都在竞相发展新的、尤其是具有临床发展前景的FTase抑制剂.到目前为止，有洛伐他丁、橙皮油的主要单萜成分苎烯已进入肿瘤Ⅰ期临床〔15〕.寻找作用于ras蛋白的抗癌药物已成为近年来抗癌药物研究领域的热点之一〔23〕.可以预见在不久的将来FTI将成为一类新的抗癌药物.
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收稿日期:1999-03-05, http://www.100md.com