608例早孕绒毛宫内感染巨细胞病毒的免疫组织化学诊断
作者：马守中 赵晶 张红岩 戚其玮 刘肖曼
单位：266071 青岛市计划生育科学技术研究所
关键词：绒毛；感染；巨细胞病毒属；免疫组织化学；过氧化物酶抗过氧化物酶
中华传染病杂志990111 【摘要】 目的 建立简便、快速的巨细胞病毒(CMV)胚胎感染的诊断方法，早期诊断胚胎CMV感染。方法 应用免疫组化过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)方法，检测与观察早孕绒毛组织的CMV感染病灶。结果 早孕绒毛608例，感染CMV 222例(36.5%)。感染灶可分为三类，点状感染占71%(158/ 222)，巢状感染占17%(37/ 222)，弥散状态感染占12%(27/ 222)。发现随胎龄增加巢状及弥散状感染增多，CMV往往先侵入绒毛霍夫保尔细胞。经电镜观察验证了PAP法。结论 免疫组化PAP法简便、灵敏、有效，可用于大量筛查宫内CMV感染。
, http://www.100md.com
Study on immunohistochemistry diagnosis of CMV infection in 608 cases of villi at first-trimester of pregnancy
MA Shouzhong,ZHAO Jing, ZHANG Hongyan, et al.
Qingdao Research Institute for Family Planning, Qingdao 266071
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to set up a simple and quick diagnosis measurement of CMV infection in embryo, so as to diagnose the intrauterine infection CMV early.Methods PAP method and electron microscope were to diagnose the CMV infection.Results Two hundred and twenty-two of 608 cases of villi were (36.5%) infected by CMV. The focus of infection were classified into three types. The rate of spotty infection is 71%(158/ 222), the nestlike infection is 17%(37/ 222), the diffuse infection is 12%(27/ 222). The longer the pregnancy is the more nestlike infection and the diffuse infection were observed. We found CMV often intruded into Hofbauer cell first. The electron microscope observation was used to evaluate the PAP method.Conclusion The PAP method is a simple, convenient, and effective measurement. It can be used as a method for mass-detection of CMV intrauterine infection.
, 百拇医药
【Key words】 Villus Infection Cytomegalovirus Immunohistochemistry PAP
巨细胞病毒(CMV)对孕妇感染的广泛性及感染胎儿的危害性，已受到临床重视。但简易、快速的CMV宫内感染的产前诊断方法尚待进一步开发。本研究应用免疫组化过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)法，检测绒毛组织CMV先天感染，对临床早诊早治有一定意义。
材料和方法
一、采样对象
608例要求人工流产的早孕妇女，年龄19～42岁，妊娠40～80天。
二、取材与标本处理
无菌吸宫采取绒毛组织，置无菌小瓶中，用Bouin's液固定24小时，脱水透明，浸蜡包埋，切片厚度4微米，连续切片，用甲醇明胶粘附于洁净玻片上待染色。
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三、试剂
(一) 鼠抗人CMV单克隆抗体 由中国预防医学科学院提供。
(二) 兔抗鼠免疫球蛋白 由中国军事科学院流行病研究所提供。
(三) PAP复合物(鼠) 瑞士进口产品。
四、PAP染色方法
将制备好的绒毛切片，经脱蜡、各级无水乙醇、酸甲醇处理，PBS冲洗后，用正常兔血清包被。设空白对照片，余下片子加鼠抗人CMV单抗，置37°C 2小时，加二抗30分钟，再加PAP作用30分钟。以上反应均在37°C湿盒中进行。每步间用PBS冲洗，然后加DAB显色5～15分钟，用PBS冲洗，酒精逐级脱水。二甲苯透明。二次树脂封固。光镜下观察结果。
五、免疫组化PAP法的验证与评估
, 百拇医药
为验证PAP方法的可靠性，对12例PAP阳性绒毛和6例PAP阴性绒毛进行了透射电镜观察。
结果
一、染色结果
PAP阴性对照片中的绒毛组织在光镜下呈现极浅黄色，绒毛枝的合体磁养层、细胞滋养层及中柱部分的结缔组织，着色浅而均匀。
被病毒侵润的绒毛组织，在均匀浅黄色的背景下，显示绒毛枝中轴结缔组织及细胞滋养层着色加深，与浅黄色背景呈明显反差，被感染细胞呈暗棕黄色，感染可累及周围细胞，形成感染细胞群，呈深棕黄色，而临近未感染细胞呈极浅浅黄色。根据所见形态特征，将222例阳性结果分为三类：即点状感染、巢状感染与弥散状感染。
1. 点状感染：CMV感染多见于绒毛中轴结缔组织的霍夫保尔氏细胞，感染细胞胞浆明显加深，核膜清晰可见，核内着色也可加深、有的细胞膜边界不清。感染细胞可涉及周围组织，呈现几个细胞至20个细胞的感染灶。在一枝或数枝绒毛上出现星星点点的几个感染灶，称为点状感染(见图1)。
, 百拇医药
图1 绒毛的CMV点状感染灶PAP×400
2. 巢状感染：感染面积较大，侵染细胞数目往往多于20个，形成条索状、巢状的深棕色细胞群，累及3个以上绒毛枝，见到多个感染灶时，称巢状感染(见图2)。
图2 绒毛的CMV巢状感染灶PAP×400
3. 弥散状感染：点状感染灶或巢状感染灶同时存在，感染灶较多，十几个到几十个呈弥散状分布，累及3个以上绒毛枝，称为弥散状感染(见图3)。
图3 绒毛的CMV弥散状感染灶PAP×400
二、222例早孕绒毛感染CMV的三种形态学分布
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点状感染占71%(158/ 222)，巢状感染占17%(37/ 222)，弥散状感染占12%(27/ 222)。显示，点状感染所占比率最高，巢状感染次之，而弥散状感染最低。
三、不同胎龄绒毛中的点状感染、巢状感染及弥散状感染的分布
见表1，点状感染在40～50天的早孕绒毛中最多，且随胎龄增加逐渐减少，而弥散状感染，在早期绒毛中较少，却随胎龄增加而明显增加，统计学处理P<0.01，差异有极显著性，表明绒毛CMV的点状感染、巢状感染及弥散状感染与胎龄关系密切。
表1 222例绒毛感染CMV形态学分类 绒毛胎龄
点状感染
巢状感染
弥散状感染
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总例数
%
例数
%
例数
%
例数
%
40～50天
84
84
12
12
4
, http://www.100md.com
4
100
100
51～60天
53
62
18
21
14
10
85
100
61～80天
, http://www.100md.com 21
57
7
18
9
25
37
100
χ2=18.05；P<0.01
四、观察发现病毒侵入绒毛后，常先累及霍夫保尔氏细胞，片中单个霍氏细胞被感染现象较普遍，受感染霍氏细胞可累及周围细胞，从而发展为点状感染灶。
五、PAP染色结果
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608例早孕绒毛PAP染色阳性222例，感染率36.5%。
六、电镜结果
在PAP阳性标本中随机取12例绒毛，从PAP阴性绒毛随机取6例，作超薄切片透射电镜观察。PAP阳性绒毛在电镜下均见CMV包涵体及病毒颗粒，其绒毛组织受到不同程度的损害(见图4)。PAP阴性绒毛未发现巨细胞病毒包函体及病毒颗粒，组织结构良好，此外发现绒毛间隙中有成串精子，表明CMV对胚胎的传染途径，除血行传染，宫腔内部邻近细胞感染外，尚有上行感染的可能。
图4 绒毛中散落的CMV病毒颗粒电镜观察×10000
讨论
本实验采用了单克隆抗体酶联免疫技术诊断CMV感染，这是在CMV产前诊断研究中的一种新探索，新尝试。PAP是过氧化物酶抗过氧化物酶的复合物，过氧化酶增加一倍之多，使反应更加灵敏，足量的过氧化物酶不断催化底物产生颜色的变化，直到光镜下出现显而易见的病毒感染迹象。本试验方法简单，一天内可完成近百份标本染色，可被一般实验室接受，简单快速适于推广应用。
, 百拇医药
本研究将绒毛组织的CMV感染按形态学分为点状感染、巢状感染、弥散状感染三类。三类感染从感染面积来看，依次增大；从与胎龄关系分析表明随胎龄增长，巢状感染及弥散状感染的发生率依次增高，看来随感染时间的延长感染在扩散。三种分类法对判断先天感染的严重程度，预后及决定处理，有一定临床意义。
妊娠早期绒毛感染CMV之初，往往感染灶小。随胎龄增长，感染面积扩大，从点状感染发展到巢状感染及弥散状态感染，由轻型感染发展到较严重的感染，提示早期诊断，早期治疗，早期处理的重要性。本研究为早期诊断绒毛感染CMV提供了简易直观的方法，对提高新生儿健康素质有积极意义。
绒毛切片中往往可见到散在的单个霍氏细胞感染的现象，这是本研究中的一种新的观察。霍氏细胞是具有吞噬能力的一种大型细胞，是组织细胞的一种，它虽然能起到胎盘屏障的保护作用，但不能将病毒消灭，病毒仍可在细胞内复制，形成许多浆内及核内包涵体，再释放到细胞外，进入邻近的其他细胞，使点性灶扩大。进一步发展为巢状感染及弥散状感染。CMV侵入绒毛首先进入霍氏细胞，这与霍氏细胞的主动免疫有关。以上观察为研究CMV从母宿主进入子宿主的方式及CMV在母婴间传播提供了实验室依据。并且提出了如何提高霍氏细胞的免疫功能以达到产前能防治CMV感染的新问题。
, 百拇医药
本研究中绒毛的CMV阳性率为36.5%，远远高于国外报道。国外调查新生儿CMV感染率在0.2%～2.3%[1]，美国克利夫兰市资料调查2147例新生儿，尿病毒分离率为0.5%～2.5%。这种差异可能与取材不同、方法不同、地区差异有关。或者可能部分感染CMV婴儿尿中不排病毒或间歇排毒影响了检出阳性率。Hohled[2]对15例活动性CMV感染进行产前诊断有8例胎儿被确诊为CMV感染。李上奎等[3]对23例血中CMV DNA阳性妇女用PCR检测羊水中CMV，有11例阳性，阳性率47.8%。孟璐英等[4]用PCR分析了7份婴儿肝穿刺标本结果全部CMV阳性。
12例阳性绒毛透射电镜观察均见到病毒包涵体及病毒颗粒，而6例PAP阴性绒毛中，病毒及包涵体均为阴性，从细微结构上证实了PAP方法的可靠性。研究结果表明PAP方法不失为一种宫内胚胎CMV感染的产前诊断好方法。推广应用对防治CMV先天感染将产生很好作用。
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参考文献
1 刘培，董兆文.先天性巨细胞病毒感染.优生与遗传，1991，2：109111.
2 Hohlfed. Cytomegalo virus fetal infection prenatal diagnosis obstet Gynecol， 1991, 38:615618.
3 李上奎，孟璐英，张基增.聚合酶链反应产前诊断人巨细胞病毒感染的初步探讨.中华妇产科杂志，1993，3：130131.
4 孟璐英，张文炳，彭华国.人巨细胞病毒DNA检测技术的建立和应用.生物化学与生物物理进展，1992，1：5456.
(收稿：1997-10-13 修回：1998-08-07), 百拇医药
单位：266071 青岛市计划生育科学技术研究所
关键词：绒毛；感染；巨细胞病毒属；免疫组织化学；过氧化物酶抗过氧化物酶
中华传染病杂志990111 【摘要】 目的 建立简便、快速的巨细胞病毒(CMV)胚胎感染的诊断方法，早期诊断胚胎CMV感染。方法 应用免疫组化过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)方法，检测与观察早孕绒毛组织的CMV感染病灶。结果 早孕绒毛608例，感染CMV 222例(36.5%)。感染灶可分为三类，点状感染占71%(158/ 222)，巢状感染占17%(37/ 222)，弥散状态感染占12%(27/ 222)。发现随胎龄增加巢状及弥散状感染增多，CMV往往先侵入绒毛霍夫保尔细胞。经电镜观察验证了PAP法。结论 免疫组化PAP法简便、灵敏、有效，可用于大量筛查宫内CMV感染。
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Study on immunohistochemistry diagnosis of CMV infection in 608 cases of villi at first-trimester of pregnancy
MA Shouzhong,ZHAO Jing, ZHANG Hongyan, et al.
Qingdao Research Institute for Family Planning, Qingdao 266071
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to set up a simple and quick diagnosis measurement of CMV infection in embryo, so as to diagnose the intrauterine infection CMV early.Methods PAP method and electron microscope were to diagnose the CMV infection.Results Two hundred and twenty-two of 608 cases of villi were (36.5%) infected by CMV. The focus of infection were classified into three types. The rate of spotty infection is 71%(158/ 222), the nestlike infection is 17%(37/ 222), the diffuse infection is 12%(27/ 222). The longer the pregnancy is the more nestlike infection and the diffuse infection were observed. We found CMV often intruded into Hofbauer cell first. The electron microscope observation was used to evaluate the PAP method.Conclusion The PAP method is a simple, convenient, and effective measurement. It can be used as a method for mass-detection of CMV intrauterine infection.
, 百拇医药
【Key words】 Villus Infection Cytomegalovirus Immunohistochemistry PAP
巨细胞病毒(CMV)对孕妇感染的广泛性及感染胎儿的危害性，已受到临床重视。但简易、快速的CMV宫内感染的产前诊断方法尚待进一步开发。本研究应用免疫组化过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)法，检测绒毛组织CMV先天感染，对临床早诊早治有一定意义。
材料和方法
一、采样对象
608例要求人工流产的早孕妇女，年龄19～42岁，妊娠40～80天。
二、取材与标本处理
无菌吸宫采取绒毛组织，置无菌小瓶中，用Bouin's液固定24小时，脱水透明，浸蜡包埋，切片厚度4微米，连续切片，用甲醇明胶粘附于洁净玻片上待染色。
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三、试剂
(一) 鼠抗人CMV单克隆抗体 由中国预防医学科学院提供。
(二) 兔抗鼠免疫球蛋白 由中国军事科学院流行病研究所提供。
(三) PAP复合物(鼠) 瑞士进口产品。
四、PAP染色方法
将制备好的绒毛切片，经脱蜡、各级无水乙醇、酸甲醇处理，PBS冲洗后，用正常兔血清包被。设空白对照片，余下片子加鼠抗人CMV单抗，置37°C 2小时，加二抗30分钟，再加PAP作用30分钟。以上反应均在37°C湿盒中进行。每步间用PBS冲洗，然后加DAB显色5～15分钟，用PBS冲洗，酒精逐级脱水。二甲苯透明。二次树脂封固。光镜下观察结果。
五、免疫组化PAP法的验证与评估
, 百拇医药
为验证PAP方法的可靠性，对12例PAP阳性绒毛和6例PAP阴性绒毛进行了透射电镜观察。
结果
一、染色结果
PAP阴性对照片中的绒毛组织在光镜下呈现极浅黄色，绒毛枝的合体磁养层、细胞滋养层及中柱部分的结缔组织，着色浅而均匀。
被病毒侵润的绒毛组织，在均匀浅黄色的背景下，显示绒毛枝中轴结缔组织及细胞滋养层着色加深，与浅黄色背景呈明显反差，被感染细胞呈暗棕黄色，感染可累及周围细胞，形成感染细胞群，呈深棕黄色，而临近未感染细胞呈极浅浅黄色。根据所见形态特征，将222例阳性结果分为三类：即点状感染、巢状感染与弥散状感染。
1. 点状感染：CMV感染多见于绒毛中轴结缔组织的霍夫保尔氏细胞，感染细胞胞浆明显加深，核膜清晰可见，核内着色也可加深、有的细胞膜边界不清。感染细胞可涉及周围组织，呈现几个细胞至20个细胞的感染灶。在一枝或数枝绒毛上出现星星点点的几个感染灶，称为点状感染(见图1)。
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图1 绒毛的CMV点状感染灶PAP×400
2. 巢状感染：感染面积较大，侵染细胞数目往往多于20个，形成条索状、巢状的深棕色细胞群，累及3个以上绒毛枝，见到多个感染灶时，称巢状感染(见图2)。
图2 绒毛的CMV巢状感染灶PAP×400
3. 弥散状感染：点状感染灶或巢状感染灶同时存在，感染灶较多，十几个到几十个呈弥散状分布，累及3个以上绒毛枝，称为弥散状感染(见图3)。
图3 绒毛的CMV弥散状感染灶PAP×400
二、222例早孕绒毛感染CMV的三种形态学分布
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点状感染占71%(158/ 222)，巢状感染占17%(37/ 222)，弥散状感染占12%(27/ 222)。显示，点状感染所占比率最高，巢状感染次之，而弥散状感染最低。
三、不同胎龄绒毛中的点状感染、巢状感染及弥散状感染的分布
见表1，点状感染在40～50天的早孕绒毛中最多，且随胎龄增加逐渐减少，而弥散状感染，在早期绒毛中较少，却随胎龄增加而明显增加，统计学处理P<0.01，差异有极显著性，表明绒毛CMV的点状感染、巢状感染及弥散状感染与胎龄关系密切。
表1 222例绒毛感染CMV形态学分类 绒毛胎龄
点状感染
巢状感染
弥散状感染
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总例数
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例数
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例数
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例数
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40～50天
84
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51～60天
53
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61～80天
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57
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χ2=18.05；P<0.01
四、观察发现病毒侵入绒毛后，常先累及霍夫保尔氏细胞，片中单个霍氏细胞被感染现象较普遍，受感染霍氏细胞可累及周围细胞，从而发展为点状感染灶。
五、PAP染色结果
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608例早孕绒毛PAP染色阳性222例，感染率36.5%。
六、电镜结果
在PAP阳性标本中随机取12例绒毛，从PAP阴性绒毛随机取6例，作超薄切片透射电镜观察。PAP阳性绒毛在电镜下均见CMV包涵体及病毒颗粒，其绒毛组织受到不同程度的损害(见图4)。PAP阴性绒毛未发现巨细胞病毒包函体及病毒颗粒，组织结构良好，此外发现绒毛间隙中有成串精子，表明CMV对胚胎的传染途径，除血行传染，宫腔内部邻近细胞感染外，尚有上行感染的可能。
图4 绒毛中散落的CMV病毒颗粒电镜观察×10000
讨论
本实验采用了单克隆抗体酶联免疫技术诊断CMV感染，这是在CMV产前诊断研究中的一种新探索，新尝试。PAP是过氧化物酶抗过氧化物酶的复合物，过氧化酶增加一倍之多，使反应更加灵敏，足量的过氧化物酶不断催化底物产生颜色的变化，直到光镜下出现显而易见的病毒感染迹象。本试验方法简单，一天内可完成近百份标本染色，可被一般实验室接受，简单快速适于推广应用。
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本研究将绒毛组织的CMV感染按形态学分为点状感染、巢状感染、弥散状感染三类。三类感染从感染面积来看，依次增大；从与胎龄关系分析表明随胎龄增长，巢状感染及弥散状感染的发生率依次增高，看来随感染时间的延长感染在扩散。三种分类法对判断先天感染的严重程度，预后及决定处理，有一定临床意义。
妊娠早期绒毛感染CMV之初，往往感染灶小。随胎龄增长，感染面积扩大，从点状感染发展到巢状感染及弥散状态感染，由轻型感染发展到较严重的感染，提示早期诊断，早期治疗，早期处理的重要性。本研究为早期诊断绒毛感染CMV提供了简易直观的方法，对提高新生儿健康素质有积极意义。
绒毛切片中往往可见到散在的单个霍氏细胞感染的现象，这是本研究中的一种新的观察。霍氏细胞是具有吞噬能力的一种大型细胞，是组织细胞的一种，它虽然能起到胎盘屏障的保护作用，但不能将病毒消灭，病毒仍可在细胞内复制，形成许多浆内及核内包涵体，再释放到细胞外，进入邻近的其他细胞，使点性灶扩大。进一步发展为巢状感染及弥散状感染。CMV侵入绒毛首先进入霍氏细胞，这与霍氏细胞的主动免疫有关。以上观察为研究CMV从母宿主进入子宿主的方式及CMV在母婴间传播提供了实验室依据。并且提出了如何提高霍氏细胞的免疫功能以达到产前能防治CMV感染的新问题。
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本研究中绒毛的CMV阳性率为36.5%，远远高于国外报道。国外调查新生儿CMV感染率在0.2%～2.3%[1]，美国克利夫兰市资料调查2147例新生儿，尿病毒分离率为0.5%～2.5%。这种差异可能与取材不同、方法不同、地区差异有关。或者可能部分感染CMV婴儿尿中不排病毒或间歇排毒影响了检出阳性率。Hohled[2]对15例活动性CMV感染进行产前诊断有8例胎儿被确诊为CMV感染。李上奎等[3]对23例血中CMV DNA阳性妇女用PCR检测羊水中CMV，有11例阳性，阳性率47.8%。孟璐英等[4]用PCR分析了7份婴儿肝穿刺标本结果全部CMV阳性。
12例阳性绒毛透射电镜观察均见到病毒包涵体及病毒颗粒，而6例PAP阴性绒毛中，病毒及包涵体均为阴性，从细微结构上证实了PAP方法的可靠性。研究结果表明PAP方法不失为一种宫内胚胎CMV感染的产前诊断好方法。推广应用对防治CMV先天感染将产生很好作用。
, http://www.100md.com
参考文献
1 刘培，董兆文.先天性巨细胞病毒感染.优生与遗传，1991，2：109111.
2 Hohlfed. Cytomegalo virus fetal infection prenatal diagnosis obstet Gynecol， 1991, 38:615618.
3 李上奎，孟璐英，张基增.聚合酶链反应产前诊断人巨细胞病毒感染的初步探讨.中华妇产科杂志，1993，3：130131.
4 孟璐英，张文炳，彭华国.人巨细胞病毒DNA检测技术的建立和应用.生物化学与生物物理进展，1992，1：5456.
(收稿：1997-10-13 修回：1998-08-07), 百拇医药