茶多酚对HL-60细胞氧化损伤时DNA双链残余率的影响
作者：张海涛 祝其锋 莫丽儿
单位：张海涛 祝其锋(广东医学院医用生化研究所，湛江 524023)；莫丽儿(广东医学院化学教研室)
关键词：H2O2；HL-60细胞；FADU；荧光；茶多酚
中国老年学杂志000221摘 要 目的 观察茶多酚对HL-60细胞氧化损伤时DNA双链残余率的影响。方法 采用DNA荧光解旋法(FADU)对DNA双链残余率进行检测。结果 过氧化氢可以对细胞DNA造成损伤，细胞浓度为1.5×109/L时，过氧化氢浓度在0.1～0.5 mmol/L时与DNA双链残余率有良好的线性关系。茶多酚浓度在10～80 mg/L时过氧化氢诱导的DNA氧化损伤具有明显的抑制作用(P<0.05)，但茶多酚浓度过高，DNA双链残余率有减少趋势。结论 过氧化氢可以造成HL-60细胞DNA的氧化损伤，茶多酚具有保护细胞，抑制DNA氧化断裂程度，在一定浓度范围内，茶多酚的抗氧化作用与其浓度成正比，过高浓度的茶多酚则抗氧化能力下降。
, http://www.100md.com
Effect of teapolyphenol on the percentage of double-stranded DNA in HL-60 cells damaged by H2O2
Zhang Haitao,Mo Lier,Zhu Qifeng
(Department of Biochemistry,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023)
Abstract：Objective The effects of teapolyphenol on DNA damaged in cell treated with H2O2 were investigated.Medthod analyzing the break of DNA by fluorescence analysis of DNA unwinding(FADU).Results H2O2 can break the DNA in cells,with linear relationship between double-stranded DNA percentage with H2O2 0.1～0.5 mmol.L-1 in 1.5×109.L-1 cells.Teapolyphenol 10～80 mg.L-1 can inhibit the result of DNA damaged by H2O2,but the higher concentration of teapolyphenol may enhance the DNA damaged by H2O2.Conclusions H2O2 can damage DNA in cells and teapolyphenol can prevent it in certain concentration,teapolyphenol in high eoncentration may enhance H2O2 induced damage.
, 百拇医药
Key words H2O2 HL-60 cell Fadu Fluorescence Teapolyphenol
茶叶含有丰富的茶多酚(teapolyphenol,TP)。许多实验证明茶多酚具有清除活性氧、自由基的功效，在抗癌、抗心血管疾病、提高机体免疫功能、延缓衰老等方面的功能已被许多体内体外实验所证实〔1〕。但也有实验表明TP在高浓度时有细胞毒性作用〔2〕。我们观察TP对过氧化氢致HL-60细胞DNA氧化损伤的影响，进一步探讨TP在DNA氧化损伤中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 仪器 Perkin Elmer荧光分析仪(美国Perkin Elmer公司)；日立冷冻高速离心机(日本日立公司)；超声破碎机(上海仪器厂)；CO2孵箱(美国公司)；YJ-1300A医用净化作台(苏州净化设备公司)。
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1.2 试剂 蛋白酶K，溴化乙啶(EB)，过氧化氢(Sigma公司产品)；RPMI1640完全培养基(GIBCO.公司产品)；小牛血清(杭州四季清公司)；牛血清白蛋白(上海东风生化技术公司)；牛胰核糖核酸酶(上海东风生化技术公司)；茶多酚(浙江莫干山制药厂)。
1.3 方法
1.3.1 H2O2对细胞DNA损伤实验〔3，4〕 取对数生长期的HL-60细胞，细胞浓度为1.5×109/L，加入H2O2，使之终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mmol/L，其中0 mmol/LH2O2为对照组(下同)。37 ℃、5%CO2卵箱中培养20 min。0 ℃ 2 000 r/min离心10 min，收集细胞。加入预冻A液(0.87% NH4Cl，10 mmol/L Tris-HCl，pH7.2)3 ml，洗细胞，2 000 r/min离心10 min，收集细胞，加B液(0.25 mmol/L肌醇，10 mmol/L Na3PO4 ，1 mmol/L MgCl2，pH7.2) 3 ml。将每瓶细胞分为T、B、P三组。每组每个样品各0.2 ml，各管加入C液(9 mmol/L尿素，10 mmol/L NaOH，2.5 mmol/L环己二胺四乙酸，0.1%SDS)0.2 ml，0 ℃放置10 min。T组加入F液(1 mmol/L葡萄糖，14/L巯基乙醇)0.8 ml，然后各管分别加入D液(0.45体积C液溶于0.55体积0.63 mmol/L NaOH)、E液(0.40体积C液溶于0.60体积0.63 mmol/L NaOH)各0.1 ml，0 ℃放置30 min(以下操作均避光)B组超声处理5～10 s，然后置于15 ℃，40 min。B、P组各加入F液0.8 ml，T、P组分别超声处理5～10 s。各组加入G液(6.7 mmol/L溴乙啶，13.3 mmol/L NaOH)1.5 ml，放置20 min。激光光波长520 nm，发射光波长590 nm，测荧光强度，求各管平均值。以DNA双链残余率反映DNA断裂程度，按公式D=(P-B)/(T-B)×100%计算(D为双链残余率，P为剩余的双链DNA荧光强度，即代表解旋率，B为除双链DNA外，其他物质的荧光强度，T为体系总荧光强度)。
, 百拇医药
1.3.2 TP对H2O2造成细胞DNA损伤影响的实验 取对数生长期的HL-60细胞，细胞浓度为1.5×109/L，加入TP使之终浓度为10、20、40、60、80 mg/L，加入H2O2终浓度为0.4 mmol/L，37 ℃，5%CO2孵箱中培养20 min。0 ℃ 2 000 r/min离心10 min收集细胞，以下操作同1.3.1。
2 结 果
2.1 细胞DNA损伤 HL-60细胞在受H2O2作用20 min后，细胞DNA受到损伤，产生断链现象。H2O2在0.2～0.6 mmol/L这一浓度范围内DNA双链残余率逐渐减少，而H2O2在0.6～1.0 mmol/L变化基本趋于平缓(表1)。进一步实验表明，在H2O2 0.1～0.5 mmol/L内DNA双链残余率与H2O2浓度有良好的线性关系：Y=72.27-110.14X，r=0.99(图1)。
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表1 不同浓度过氧化氢对DNA双链残余率的影响(
±s) H2O2(mmol/L)
n
DNA双链残余率(%)
0
4
98.49±8.62
0.2
4
52.21±5.911)
0.4
, http://www.100md.com
4
32.03±10.122)
0.6
4
20.68±8.532)
0.8
4
17.52±9.942)
1.0
4
16.58±4.162)
, http://www.100md.com 与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同
图1 过氧化氢浓度和DNA双链残余率曲线
2.2 TP对H2O2造成的细胞DNA损伤的影响 见表2。从表2中我们可以发现TP在10～80 mg/L时对过氧化氢造成的DNA链断裂有明显的抑制作用(P<0.05)，其中以TP为40 mg/L时抑制作用最强。
表2 不同浓度的TP对过氧化氢诱导的DNA双链
残余率的影响(±s) TP(mg/L)
n
, http://www.100md.com
DNA双链残余率(%)
0
4
25.90±11.12
10
4
40.59±4.021)
20
4
56.70±9.931)
40
4
, http://www.100md.com
71.79±9.651)
60
4
63.75±6.741)
80
4
51.46±10.181)
3 讨 论
化学物质造成的DNA损伤，大多可直接或间接导致DNA链断裂。DNA荧光解旋分析法是检测DNA断裂较灵敏的方法，该方法的原理是双链DNA在碱性溶液中，氢键发生断裂，出现解链。哺乳动物细胞的DNA完全解链一般需几小时，而衰老、肿瘤等原因造成的DNA链断裂后其链速度加快，在一定条件下，解链速度与断裂程度成正比。适当的碱性条件，溴化乙啶(EB)可选择性地结合于双链DNA而发光，可由荧光强度的变化反映双链DNA的相对含量，估计DNA解链情况，进而了解DNA断裂程度〔4〕。
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H2O2可以引起DNA损伤及细胞的死亡。H2O2在作用几分钟内就可以看到DNA链的断裂，且呈剂量依赖性的特征〔5〕。本文结果显示，H2O2作用HL-60细胞20 min，用FADU法检测的DNA双链残余率与H2O2浓度呈负相关(图1)，表明DNA断裂增加，这种DNA断裂可能是由于H2O2直接作用结果。
TP的抗氧化、延缓衰老的功效被许多实验证实，但也有研究证实多酚类化合物在一定浓度时可以作为前氧化物(proxidant)对细胞产生毒害〔2〕。本实验结果表明：TP在10～80 mg/L时，对过氧化氢诱导的DNA链断裂具有明显的抑制作用，这表明TP具有抗DNA氧化损伤作用，以40 mg/LTP的抗氧化能力最强，而60～80 mg/L TP的抗氧化能力表现出下降的趋势，可能是过高浓度的TP表现出前氧化物的性质所致。因此，摸索一个合适浓度的TP对于研究延缓衰老和抑制肿瘤的发生具有重要意义。
, 百拇医药
广东省重点学科资助课题，课题号9608
作者简介：张海涛，男，28岁，医学硕士，从事衰老生化研究
参考文献
1，Yang CS，Wang ZY.Tea and cancer.J Natl Cancer Inst，1993；85(13)：1038
2，Laughton MJ，Evans PJ,Moroney MA et al.Inhibition of mammalian 5-lipoxygenase and cyclooxygenase by flavonoids and phenolic dietary additives：Relationship to antioxidant activity and to iron ion-reducing ability.Biochem Pharmacol，1991；42(9)：1673
, 百拇医药
3，陈 勤主编.抗衰老研究实验.第1版，北京：中国医药科技出版社，1996：476-479
4，Celotti L，ferraro P,Biasin MR.Detection by fluorescence analysis of DNA unwinding and unscheduled DNA synthesis,of DNA damage and repair induced in vitro by direct-acting mutagens on human lymphocytes.Mutat Res，1992；28(1)：17
5，成 军主编.程序性细胞死亡与疾病.第1版，北京：北京医科大学/协和医科大学联合出版社；1997：17-19
收稿日期：1999-01-17
修回日期：1999-03-31, http://www.100md.com
单位：张海涛 祝其锋(广东医学院医用生化研究所，湛江 524023)；莫丽儿(广东医学院化学教研室)
关键词：H2O2；HL-60细胞；FADU；荧光；茶多酚
中国老年学杂志000221摘 要 目的 观察茶多酚对HL-60细胞氧化损伤时DNA双链残余率的影响。方法 采用DNA荧光解旋法(FADU)对DNA双链残余率进行检测。结果 过氧化氢可以对细胞DNA造成损伤，细胞浓度为1.5×109/L时，过氧化氢浓度在0.1～0.5 mmol/L时与DNA双链残余率有良好的线性关系。茶多酚浓度在10～80 mg/L时过氧化氢诱导的DNA氧化损伤具有明显的抑制作用(P<0.05)，但茶多酚浓度过高，DNA双链残余率有减少趋势。结论 过氧化氢可以造成HL-60细胞DNA的氧化损伤，茶多酚具有保护细胞，抑制DNA氧化断裂程度，在一定浓度范围内，茶多酚的抗氧化作用与其浓度成正比，过高浓度的茶多酚则抗氧化能力下降。
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Effect of teapolyphenol on the percentage of double-stranded DNA in HL-60 cells damaged by H2O2
Zhang Haitao,Mo Lier,Zhu Qifeng
(Department of Biochemistry,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023)
Abstract：Objective The effects of teapolyphenol on DNA damaged in cell treated with H2O2 were investigated.Medthod analyzing the break of DNA by fluorescence analysis of DNA unwinding(FADU).Results H2O2 can break the DNA in cells,with linear relationship between double-stranded DNA percentage with H2O2 0.1～0.5 mmol.L-1 in 1.5×109.L-1 cells.Teapolyphenol 10～80 mg.L-1 can inhibit the result of DNA damaged by H2O2,but the higher concentration of teapolyphenol may enhance the DNA damaged by H2O2.Conclusions H2O2 can damage DNA in cells and teapolyphenol can prevent it in certain concentration,teapolyphenol in high eoncentration may enhance H2O2 induced damage.
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Key words H2O2 HL-60 cell Fadu Fluorescence Teapolyphenol
茶叶含有丰富的茶多酚(teapolyphenol,TP)。许多实验证明茶多酚具有清除活性氧、自由基的功效，在抗癌、抗心血管疾病、提高机体免疫功能、延缓衰老等方面的功能已被许多体内体外实验所证实〔1〕。但也有实验表明TP在高浓度时有细胞毒性作用〔2〕。我们观察TP对过氧化氢致HL-60细胞DNA氧化损伤的影响，进一步探讨TP在DNA氧化损伤中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 仪器 Perkin Elmer荧光分析仪(美国Perkin Elmer公司)；日立冷冻高速离心机(日本日立公司)；超声破碎机(上海仪器厂)；CO2孵箱(美国公司)；YJ-1300A医用净化作台(苏州净化设备公司)。
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1.2 试剂 蛋白酶K，溴化乙啶(EB)，过氧化氢(Sigma公司产品)；RPMI1640完全培养基(GIBCO.公司产品)；小牛血清(杭州四季清公司)；牛血清白蛋白(上海东风生化技术公司)；牛胰核糖核酸酶(上海东风生化技术公司)；茶多酚(浙江莫干山制药厂)。
1.3 方法
1.3.1 H2O2对细胞DNA损伤实验〔3，4〕 取对数生长期的HL-60细胞，细胞浓度为1.5×109/L，加入H2O2，使之终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mmol/L，其中0 mmol/LH2O2为对照组(下同)。37 ℃、5%CO2卵箱中培养20 min。0 ℃ 2 000 r/min离心10 min，收集细胞。加入预冻A液(0.87% NH4Cl，10 mmol/L Tris-HCl，pH7.2)3 ml，洗细胞，2 000 r/min离心10 min，收集细胞，加B液(0.25 mmol/L肌醇，10 mmol/L Na3PO4 ，1 mmol/L MgCl2，pH7.2) 3 ml。将每瓶细胞分为T、B、P三组。每组每个样品各0.2 ml，各管加入C液(9 mmol/L尿素，10 mmol/L NaOH，2.5 mmol/L环己二胺四乙酸，0.1%SDS)0.2 ml，0 ℃放置10 min。T组加入F液(1 mmol/L葡萄糖，14/L巯基乙醇)0.8 ml，然后各管分别加入D液(0.45体积C液溶于0.55体积0.63 mmol/L NaOH)、E液(0.40体积C液溶于0.60体积0.63 mmol/L NaOH)各0.1 ml，0 ℃放置30 min(以下操作均避光)B组超声处理5～10 s，然后置于15 ℃，40 min。B、P组各加入F液0.8 ml，T、P组分别超声处理5～10 s。各组加入G液(6.7 mmol/L溴乙啶，13.3 mmol/L NaOH)1.5 ml，放置20 min。激光光波长520 nm，发射光波长590 nm，测荧光强度，求各管平均值。以DNA双链残余率反映DNA断裂程度，按公式D=(P-B)/(T-B)×100%计算(D为双链残余率，P为剩余的双链DNA荧光强度，即代表解旋率，B为除双链DNA外，其他物质的荧光强度，T为体系总荧光强度)。
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1.3.2 TP对H2O2造成细胞DNA损伤影响的实验 取对数生长期的HL-60细胞，细胞浓度为1.5×109/L，加入TP使之终浓度为10、20、40、60、80 mg/L，加入H2O2终浓度为0.4 mmol/L，37 ℃，5%CO2孵箱中培养20 min。0 ℃ 2 000 r/min离心10 min收集细胞，以下操作同1.3.1。
2 结 果
2.1 细胞DNA损伤 HL-60细胞在受H2O2作用20 min后，细胞DNA受到损伤，产生断链现象。H2O2在0.2～0.6 mmol/L这一浓度范围内DNA双链残余率逐渐减少，而H2O2在0.6～1.0 mmol/L变化基本趋于平缓(表1)。进一步实验表明，在H2O2 0.1～0.5 mmol/L内DNA双链残余率与H2O2浓度有良好的线性关系：Y=72.27-110.14X，r=0.99(图1)。
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表1 不同浓度过氧化氢对DNA双链残余率的影响(
±s) H2O2(mmol/L)n
DNA双链残余率(%)
0
4
98.49±8.62
0.2
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52.21±5.911)
0.4
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32.03±10.122)
0.6
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20.68±8.532)
0.8
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17.52±9.942)
1.0
4
16.58±4.162)
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图1 过氧化氢浓度和DNA双链残余率曲线
2.2 TP对H2O2造成的细胞DNA损伤的影响 见表2。从表2中我们可以发现TP在10～80 mg/L时对过氧化氢造成的DNA链断裂有明显的抑制作用(P<0.05)，其中以TP为40 mg/L时抑制作用最强。
表2 不同浓度的TP对过氧化氢诱导的DNA双链
残余率的影响(
±s) TP(mg/L)n
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DNA双链残余率(%)
0
4
25.90±11.12
10
4
40.59±4.021)
20
4
56.70±9.931)
40
4
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71.79±9.651)
60
4
63.75±6.741)
80
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51.46±10.181)
3 讨 论
化学物质造成的DNA损伤，大多可直接或间接导致DNA链断裂。DNA荧光解旋分析法是检测DNA断裂较灵敏的方法，该方法的原理是双链DNA在碱性溶液中，氢键发生断裂，出现解链。哺乳动物细胞的DNA完全解链一般需几小时，而衰老、肿瘤等原因造成的DNA链断裂后其链速度加快，在一定条件下，解链速度与断裂程度成正比。适当的碱性条件，溴化乙啶(EB)可选择性地结合于双链DNA而发光，可由荧光强度的变化反映双链DNA的相对含量，估计DNA解链情况，进而了解DNA断裂程度〔4〕。
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H2O2可以引起DNA损伤及细胞的死亡。H2O2在作用几分钟内就可以看到DNA链的断裂，且呈剂量依赖性的特征〔5〕。本文结果显示，H2O2作用HL-60细胞20 min，用FADU法检测的DNA双链残余率与H2O2浓度呈负相关(图1)，表明DNA断裂增加，这种DNA断裂可能是由于H2O2直接作用结果。
TP的抗氧化、延缓衰老的功效被许多实验证实，但也有研究证实多酚类化合物在一定浓度时可以作为前氧化物(proxidant)对细胞产生毒害〔2〕。本实验结果表明：TP在10～80 mg/L时，对过氧化氢诱导的DNA链断裂具有明显的抑制作用，这表明TP具有抗DNA氧化损伤作用，以40 mg/LTP的抗氧化能力最强，而60～80 mg/L TP的抗氧化能力表现出下降的趋势，可能是过高浓度的TP表现出前氧化物的性质所致。因此，摸索一个合适浓度的TP对于研究延缓衰老和抑制肿瘤的发生具有重要意义。
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广东省重点学科资助课题，课题号9608
作者简介：张海涛，男，28岁，医学硕士，从事衰老生化研究
参考文献
1，Yang CS，Wang ZY.Tea and cancer.J Natl Cancer Inst，1993；85(13)：1038
2，Laughton MJ，Evans PJ,Moroney MA et al.Inhibition of mammalian 5-lipoxygenase and cyclooxygenase by flavonoids and phenolic dietary additives：Relationship to antioxidant activity and to iron ion-reducing ability.Biochem Pharmacol，1991；42(9)：1673
, 百拇医药
3，陈 勤主编.抗衰老研究实验.第1版，北京：中国医药科技出版社，1996：476-479
4，Celotti L，ferraro P,Biasin MR.Detection by fluorescence analysis of DNA unwinding and unscheduled DNA synthesis,of DNA damage and repair induced in vitro by direct-acting mutagens on human lymphocytes.Mutat Res，1992；28(1)：17
5，成 军主编.程序性细胞死亡与疾病.第1版，北京：北京医科大学/协和医科大学联合出版社；1997：17-19
收稿日期：1999-01-17
修回日期：1999-03-31, http://www.100md.com