博来霉素A5抑制血管生成和抗肿瘤转移作用的实验研究
作者：武利存 孙公甲 张维东 张庆慧
单位：武利存 孙公甲 张维东(山东省医学科学院基础医学研究所， 济南250062)；张庆慧(山东医科大学基础医学院， 济南250014)
关键词：博来霉素A5；鸡胚绒毛尿囊膜；血管生长抑制剂；Lewis肺癌；抗转移
中国抗生素杂志000118 摘 要 目的：证实博来霉素A5抑制血管生成和抗肿瘤转移作用。方法：将含有0.5μg博来霉素A5的载体置于胚龄7d的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上，48h后观察抑制血管生成情况。Lewis肺癌皮下接种C57BL/6小鼠6d后，在移植瘤周围及其基底部多处局部注射博来霉素A5，每鼠每次0.6mg，每5天1次，共3次，接种后25d处死小鼠，观察皮下移植瘤血管生成抑制情况和对肺转移的抑制作用。结果：博来霉素A5可使载体周围CAM新生血管明显减少甚至消失。Lewis肺癌皮下移植瘤体积小，颜色苍白，毛细血管稀少，很少出血，坏死常见。肺转移抑制率为80%。结论：博来霉素A5能强烈抑制鸡胚CAM和Lewis肺癌皮下移植瘤的血管生成，瘤周局注具有抗转移作用。提示博来霉素A5是一有潜力的血管生长抑制剂。
, 百拇医药
Antimetastasis of Lewis lung carcinoma by a novel angiogenesis lnhibitor
bleomycin A5 in a spontaneous metastasis model
Wu Licun， Sun Gongjia and Zhang Weidong
(Institute of Basic Medical Sciences, Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250062)
Zhang Qinghui
(Preclinical Medical College, Shandong Medical University， Jinan 250014)
, http://www.100md.com
ABSTRACT To determine whether bleomycin A5 can inhibit angiogenesis and cancer metastasis. Methods: 1.The pellet contained 0.5μg bleomycin A5 was placed onto the 7th day chick embryo chorioallantoic membrane, and antiangiogenesis activity was to be observed 48d later, 2.At the 6th day after Lewis lung carcinoma was inoculated s.c. into the right flank of C57BL/6 mice, bleomycin A5 was topically injected around and beneath the inoculum, 0.6mg per mouse, once every 5 days, and 3 times totally. All mice were sacrificed on the 25th day after tumor implantation. Tumor angiogenesis and lung metastatic foci were examined. Results: 1.A vessel-decreased or avascular zone appeared on the chick CAM around the pellet which contained bleomycin A5. 2. After administration of bleomycin A5, subcutaneously inoculated tumors were smaller than those of controls, and looked pale with sparse capillaries. Necrosis could be seen commonly. The percent inhibition of lung metastatic foci was 80%. Conclusion: Bleomycin A5 can inhibit angiogenesis both on the chick CAM assay and in s.c. Lewis lung carcinoma model. Furthermore, it has a markedly antimetastatic effect.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Bleomycin A5； CAM； Angiogenesis inhibitor； Lewis lung carcinoma； Antime-tastasis
原发肿瘤的生长必须依赖血管生成，同时原发灶血管数量的增多增加了转移的可能性，即新生血管形成与肿瘤的转移倾向呈正相关[1～3]。因此，抑制肿瘤血管生成已成为近年来控制肿瘤生长和抗转移研究中的热点之一[4～6]，而寻找高效、低毒、价廉、易得的血管生长抑制剂是该领域的关键问题。博来霉素A5是作者采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法筛选出的一种血管生长抑制剂，能强烈抑制CAM的血管生成。本文主要对其抑制血管生成和抗肿瘤转移作用进行探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药 1.1.1 动物 Leghorn鸡胚由山东省农科院家禽研究所提供，C57BL/6小鼠由山东医科大学实验动物中心提供，雌雄兼有，体重10～14g；Lewis肺癌瘤种由中国医学科学院药物研究所提供。
1.1.2 实验药品 甲基纤维素由英国进口，上海化学试剂厂分装；氢化考的松系山东新华制药厂生产；肝素由上海生化制药厂生产；盐酸博来霉素A5由天津河北制药厂生产，又称平阳霉素。
1.2 方法
1.2.1 鸡胚CAM法[7] 采用假气室法在蛋壳上开一小窗，暴露CAM，将吸附有待测药物的滤纸载体(Φ0.5cm)置于7d胚龄的CAM上，孵育48h后，在解剖镜下观察血管生成抑制情况；对照组用1%甲基纤维素，氢化考的松加肝素为阳性对照。
1.2.2 小鼠腋下接种Lewis肺癌后用博来霉素A5治疗实验 从荷瘤小鼠上剥离Lewis肺癌，选取良好的瘤块，按肿瘤(g)∶生理盐水(ml)为1∶3比例研磨成匀浆，给每只C57 BL/6小鼠腋窝皮下接种肿瘤匀浆0.2ml，接种后第5～6天皮下移植瘤生长可触及，随机分组：对照组9只，实验组11只，并开始治疗。对照组用NS 0.5ml，实验组用博来霉素A5，每鼠每次0.6mg，每5天注射1次，共3次，在肿瘤周围及基底部多处局部注射。接种后第25天颈椎脱臼处死动物，结束实验。观察指标：①在解剖镜下观察两组皮下移植瘤的血管生成抑制情况；②博来霉素A5抑瘤作用，称瘤重；③博来霉素A5抗转移作用，肺表转移灶数目、大小及肺重，并进行统计学处理。
, 百拇医药
2 结果
2.1 鸡胚CAM血管生成抑制实验
结果见表1。
2.2 小鼠皮下移植瘤血管生成抑制情况
对照组肿瘤颜色红润，毛细血管丰富，且扩张和迂曲，易出血，坏死较少，肿瘤体积大；博来霉素A5瘤周注射组肿瘤颜色苍白，毛细血管稀少，很少出血，坏死多，体积小。
2.3 博来霉素A5抑瘤作用
结果见表2。
表1 鸡胚CAM血管生成抑制实验结果 药 物
剂量
, http://www.100md.com
(μg)
鸡胚数
血管生成抑制作用及鸡胚数
-
+
++
+++
甲基纤维素
100
10
10
氢化考的松
100
, 百拇医药
16
3
10
3
加肝素
博来霉素A5
0.5
32
6
26
：载体周围毛细血管完全消失； +：毛细血管轻度减少；
：毛细血管明显减少，但不消失； -无作用。表2 博来霉素瘤周注射对Lewis肺癌皮下移植瘤抑制作用 组 别
, 百拇医药
动物数
(只)
瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
备 注
对照组
9
2.26±2.09
其中2只在接种24d
时死于肺广泛转移
实验组
, 百拇医药
11
0.59±0.54
73.89
2.4 博来霉素A5抗转移作用
结果见表3。
对照组肺转移数目多，转移结节大，有3只小鼠肺转移结节直径>3mm，其中2只死于肺转移，而博来霉素A5治疗组肺转移结节小，直径≤1mm，转移数目少(P<0.01)。
2.5 博来霉素A5毒副反应
两组小鼠治疗前后体重均有增加，对照组小鼠体重增加24%，实验组增加15%。另外未见明显副反应(如脱毛、腹泻等)，在整个治疗过程中实验组小鼠活动良好。表3 博来霉素A5瘤周注射抗Lewis肺癌转移作用 组 别
, 百拇医药
肺表转移数
平均肺重
(g)
转移抑制率
(%)
对照组
5.00±2.58
0.20±0.02
实验组
1.00±1.12
0.17±0.02
80
3 讨论
, 百拇医药
抑制肿瘤血管生成、抑制Ⅳ型胶原酶分泌或活性、抑制信号传递通路是人们普遍看好的3个抗转移方向[9]。新生血管形成在原发灶的增殖和转移瘤的生长中起重要作用。因此，血管生长抑制剂抗转移有两方面的意义，它不仅可抑制原发瘤血管生成，减少瘤细胞进入血液形成转移的机会，同时还可抑制转移瘤的生长。
结果显示，博来霉素A5可强烈抑制鸡胚CAM的血管生成，对皮下移植瘤Lewis肺癌的血管生成也有明显抑制作用，预示博来霉素A5是一很有前途的血管生长抑制剂。
本研究采用博来霉素A5在肿瘤周围局部注射法，主要考虑肿瘤血管生成时，宿主小静脉和毛细血管向肿瘤生长，使肿瘤周围微血管密度增高，博来霉素A5可直接抑制肿瘤周围血管生成，阻止瘤细胞进入血循环，达到抗转移目的。本实验单独使用博来霉素A5瘤周注射对皮下移植瘤抑瘤率达73.89%，对Lewis肺癌自发性肺转移抑制率为80%。
, 百拇医药
博来霉素A5是一细胞毒类抗肿瘤抗生素，通常为静脉、肌肉或瘤内注射。作者发现的抑制血管生成这一新的药理作用，在瘤周注射可使肿瘤缩小并有显著抗转移作用，因此扩大了博来霉素A5的临床使用范围，可望用于体表转移灶或转移淋巴结、体表肿瘤如乳癌术后复发，甚至不排除某些早期乳癌采用此法免遭手术的可能性。
博来霉素A5抑制血管生成的机制是抑制血管内皮细胞的移动和增殖[10]。另外，郑勤田等在局部注射博来霉素A5治疗小儿血管瘤和淋巴管瘤这两种内皮细胞增殖性肿瘤临床实践中已取得了满意的疗效[11，12]。
本课题受山东省科委资助，文号 961226702
武利存，男，生于1962年，硕士，助理研究员。
, http://www.100md.com 参考文献
1，Folkman J. Tumor angiogenesis: Therapeutic implication. New England J Med，1971；852：1182
2，Bikfalvi A. Significance of angiogenesis in tumor progression and metastasis. Eur J Cancer，1995；31A(7/8)：1101
3，Beverly A T. Angiogenesis and cancer metastases: therapeu-tic approaches. Critical Reviews in Oncology/Hematology，1995；20：9
4，王贵齐. VEGF抗体对实验性肿瘤的抑制作用. 中华肿瘤杂志，1997；19(3)：163
, http://www.100md.com
5，夏景林，杨秉辉. TNP-470抑制Lewis肺癌生长和转移的实验研究. 中华肿瘤杂志，1997；19(5)：333
6，Hiroshi K, Hiromifsu S, Michio F, et al. Inhibition of metastasis of Lewis lung carcinoma by urinary trypsin inhibitor in experimental and spontaneous metastasis models. Int J Cancer，1995；63：455
7，武利存，孙公甲. 鸡胚绒毛尿囊膜法检测血管生长抑制剂的研究. 山东省医学科学院学报，1992；1：16
8，Crum R, Sazabo S, Folkman J. A new class of steriods inhibits angiogenesis in the presence of heparin or a heparin fragment. Science，1985；230：1375
9，高进主编. 癌的侵袭与转移. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995：195
10，待发表资料
11，郑勤田，伍连康，容文星，等. 平阳霉素局部注射治疗小儿血管瘤. 中华外科杂志，1991；29(3)：290
12，蒋嘉萍，易军，容文星. 平阳霉素注射治疗新生儿淋巴管瘤8例. 临床儿科杂志，1991；9(1)：55
1998年11月10日收稿, http://www.100md.com
单位：武利存 孙公甲 张维东(山东省医学科学院基础医学研究所， 济南250062)；张庆慧(山东医科大学基础医学院， 济南250014)
关键词：博来霉素A5；鸡胚绒毛尿囊膜；血管生长抑制剂；Lewis肺癌；抗转移
中国抗生素杂志000118 摘 要 目的：证实博来霉素A5抑制血管生成和抗肿瘤转移作用。方法：将含有0.5μg博来霉素A5的载体置于胚龄7d的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上，48h后观察抑制血管生成情况。Lewis肺癌皮下接种C57BL/6小鼠6d后，在移植瘤周围及其基底部多处局部注射博来霉素A5，每鼠每次0.6mg，每5天1次，共3次，接种后25d处死小鼠，观察皮下移植瘤血管生成抑制情况和对肺转移的抑制作用。结果：博来霉素A5可使载体周围CAM新生血管明显减少甚至消失。Lewis肺癌皮下移植瘤体积小，颜色苍白，毛细血管稀少，很少出血，坏死常见。肺转移抑制率为80%。结论：博来霉素A5能强烈抑制鸡胚CAM和Lewis肺癌皮下移植瘤的血管生成，瘤周局注具有抗转移作用。提示博来霉素A5是一有潜力的血管生长抑制剂。
, 百拇医药
Antimetastasis of Lewis lung carcinoma by a novel angiogenesis lnhibitor
bleomycin A5 in a spontaneous metastasis model
Wu Licun， Sun Gongjia and Zhang Weidong
(Institute of Basic Medical Sciences, Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250062)
Zhang Qinghui
(Preclinical Medical College, Shandong Medical University， Jinan 250014)
, http://www.100md.com
ABSTRACT To determine whether bleomycin A5 can inhibit angiogenesis and cancer metastasis. Methods: 1.The pellet contained 0.5μg bleomycin A5 was placed onto the 7th day chick embryo chorioallantoic membrane, and antiangiogenesis activity was to be observed 48d later, 2.At the 6th day after Lewis lung carcinoma was inoculated s.c. into the right flank of C57BL/6 mice, bleomycin A5 was topically injected around and beneath the inoculum, 0.6mg per mouse, once every 5 days, and 3 times totally. All mice were sacrificed on the 25th day after tumor implantation. Tumor angiogenesis and lung metastatic foci were examined. Results: 1.A vessel-decreased or avascular zone appeared on the chick CAM around the pellet which contained bleomycin A5. 2. After administration of bleomycin A5, subcutaneously inoculated tumors were smaller than those of controls, and looked pale with sparse capillaries. Necrosis could be seen commonly. The percent inhibition of lung metastatic foci was 80%. Conclusion: Bleomycin A5 can inhibit angiogenesis both on the chick CAM assay and in s.c. Lewis lung carcinoma model. Furthermore, it has a markedly antimetastatic effect.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Bleomycin A5； CAM； Angiogenesis inhibitor； Lewis lung carcinoma； Antime-tastasis
原发肿瘤的生长必须依赖血管生成，同时原发灶血管数量的增多增加了转移的可能性，即新生血管形成与肿瘤的转移倾向呈正相关[1～3]。因此，抑制肿瘤血管生成已成为近年来控制肿瘤生长和抗转移研究中的热点之一[4～6]，而寻找高效、低毒、价廉、易得的血管生长抑制剂是该领域的关键问题。博来霉素A5是作者采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法筛选出的一种血管生长抑制剂，能强烈抑制CAM的血管生成。本文主要对其抑制血管生成和抗肿瘤转移作用进行探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药 1.1.1 动物 Leghorn鸡胚由山东省农科院家禽研究所提供，C57BL/6小鼠由山东医科大学实验动物中心提供，雌雄兼有，体重10～14g；Lewis肺癌瘤种由中国医学科学院药物研究所提供。
1.1.2 实验药品 甲基纤维素由英国进口，上海化学试剂厂分装；氢化考的松系山东新华制药厂生产；肝素由上海生化制药厂生产；盐酸博来霉素A5由天津河北制药厂生产，又称平阳霉素。
1.2 方法
1.2.1 鸡胚CAM法[7] 采用假气室法在蛋壳上开一小窗，暴露CAM，将吸附有待测药物的滤纸载体(Φ0.5cm)置于7d胚龄的CAM上，孵育48h后，在解剖镜下观察血管生成抑制情况；对照组用1%甲基纤维素，氢化考的松加肝素为阳性对照。
1.2.2 小鼠腋下接种Lewis肺癌后用博来霉素A5治疗实验 从荷瘤小鼠上剥离Lewis肺癌，选取良好的瘤块，按肿瘤(g)∶生理盐水(ml)为1∶3比例研磨成匀浆，给每只C57 BL/6小鼠腋窝皮下接种肿瘤匀浆0.2ml，接种后第5～6天皮下移植瘤生长可触及，随机分组：对照组9只，实验组11只，并开始治疗。对照组用NS 0.5ml，实验组用博来霉素A5，每鼠每次0.6mg，每5天注射1次，共3次，在肿瘤周围及基底部多处局部注射。接种后第25天颈椎脱臼处死动物，结束实验。观察指标：①在解剖镜下观察两组皮下移植瘤的血管生成抑制情况；②博来霉素A5抑瘤作用，称瘤重；③博来霉素A5抗转移作用，肺表转移灶数目、大小及肺重，并进行统计学处理。
, 百拇医药
2 结果
2.1 鸡胚CAM血管生成抑制实验
结果见表1。
2.2 小鼠皮下移植瘤血管生成抑制情况
对照组肿瘤颜色红润，毛细血管丰富，且扩张和迂曲，易出血，坏死较少，肿瘤体积大；博来霉素A5瘤周注射组肿瘤颜色苍白，毛细血管稀少，很少出血，坏死多，体积小。
2.3 博来霉素A5抑瘤作用
结果见表2。
表1 鸡胚CAM血管生成抑制实验结果 药 物
剂量
, http://www.100md.com
(μg)
鸡胚数
血管生成抑制作用及鸡胚数
-
+
++
+++
甲基纤维素
100
10
10
氢化考的松
100
, 百拇医药
16
3
10
3
加肝素
博来霉素A5
0.5
32
6
26
：载体周围毛细血管完全消失； +：毛细血管轻度减少；
：毛细血管明显减少，但不消失； -无作用。表2 博来霉素瘤周注射对Lewis肺癌皮下移植瘤抑制作用 组 别
, 百拇医药
动物数
(只)
瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
备 注
对照组
9
2.26±2.09
其中2只在接种24d
时死于肺广泛转移
实验组
, 百拇医药
11
0.59±0.54
73.89
2.4 博来霉素A5抗转移作用
结果见表3。
对照组肺转移数目多，转移结节大，有3只小鼠肺转移结节直径>3mm，其中2只死于肺转移，而博来霉素A5治疗组肺转移结节小，直径≤1mm，转移数目少(P<0.01)。
2.5 博来霉素A5毒副反应
两组小鼠治疗前后体重均有增加，对照组小鼠体重增加24%，实验组增加15%。另外未见明显副反应(如脱毛、腹泻等)，在整个治疗过程中实验组小鼠活动良好。表3 博来霉素A5瘤周注射抗Lewis肺癌转移作用 组 别
, 百拇医药
肺表转移数
平均肺重
(g)
转移抑制率
(%)
对照组
5.00±2.58
0.20±0.02
实验组
1.00±1.12
0.17±0.02
80
3 讨论
, 百拇医药
抑制肿瘤血管生成、抑制Ⅳ型胶原酶分泌或活性、抑制信号传递通路是人们普遍看好的3个抗转移方向[9]。新生血管形成在原发灶的增殖和转移瘤的生长中起重要作用。因此，血管生长抑制剂抗转移有两方面的意义，它不仅可抑制原发瘤血管生成，减少瘤细胞进入血液形成转移的机会，同时还可抑制转移瘤的生长。
结果显示，博来霉素A5可强烈抑制鸡胚CAM的血管生成，对皮下移植瘤Lewis肺癌的血管生成也有明显抑制作用，预示博来霉素A5是一很有前途的血管生长抑制剂。
本研究采用博来霉素A5在肿瘤周围局部注射法，主要考虑肿瘤血管生成时，宿主小静脉和毛细血管向肿瘤生长，使肿瘤周围微血管密度增高，博来霉素A5可直接抑制肿瘤周围血管生成，阻止瘤细胞进入血循环，达到抗转移目的。本实验单独使用博来霉素A5瘤周注射对皮下移植瘤抑瘤率达73.89%，对Lewis肺癌自发性肺转移抑制率为80%。
, 百拇医药
博来霉素A5是一细胞毒类抗肿瘤抗生素，通常为静脉、肌肉或瘤内注射。作者发现的抑制血管生成这一新的药理作用，在瘤周注射可使肿瘤缩小并有显著抗转移作用，因此扩大了博来霉素A5的临床使用范围，可望用于体表转移灶或转移淋巴结、体表肿瘤如乳癌术后复发，甚至不排除某些早期乳癌采用此法免遭手术的可能性。
博来霉素A5抑制血管生成的机制是抑制血管内皮细胞的移动和增殖[10]。另外，郑勤田等在局部注射博来霉素A5治疗小儿血管瘤和淋巴管瘤这两种内皮细胞增殖性肿瘤临床实践中已取得了满意的疗效[11，12]。
本课题受山东省科委资助，文号 961226702
武利存，男，生于1962年，硕士，助理研究员。
, http://www.100md.com 参考文献
1，Folkman J. Tumor angiogenesis: Therapeutic implication. New England J Med，1971；852：1182
2，Bikfalvi A. Significance of angiogenesis in tumor progression and metastasis. Eur J Cancer，1995；31A(7/8)：1101
3，Beverly A T. Angiogenesis and cancer metastases: therapeu-tic approaches. Critical Reviews in Oncology/Hematology，1995；20：9
4，王贵齐. VEGF抗体对实验性肿瘤的抑制作用. 中华肿瘤杂志，1997；19(3)：163
, http://www.100md.com
5，夏景林，杨秉辉. TNP-470抑制Lewis肺癌生长和转移的实验研究. 中华肿瘤杂志，1997；19(5)：333
6，Hiroshi K, Hiromifsu S, Michio F, et al. Inhibition of metastasis of Lewis lung carcinoma by urinary trypsin inhibitor in experimental and spontaneous metastasis models. Int J Cancer，1995；63：455
7，武利存，孙公甲. 鸡胚绒毛尿囊膜法检测血管生长抑制剂的研究. 山东省医学科学院学报，1992；1：16
8，Crum R, Sazabo S, Folkman J. A new class of steriods inhibits angiogenesis in the presence of heparin or a heparin fragment. Science，1985；230：1375
9，高进主编. 癌的侵袭与转移. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995：195
10，待发表资料
11，郑勤田，伍连康，容文星，等. 平阳霉素局部注射治疗小儿血管瘤. 中华外科杂志，1991；29(3)：290
12，蒋嘉萍，易军，容文星. 平阳霉素注射治疗新生儿淋巴管瘤8例. 临床儿科杂志，1991；9(1)：55
1998年11月10日收稿, http://www.100md.com