MTT法测定肿瘤细胞体外药物敏感性的临床应用
作者：陈晓文 孙达华 李允武
单位：上海第二医科大学附属第九人民医院药剂科，上海市200011
关键词：MTT法；化疗；药敏
中国药房000608
摘要：目的：评价MTT法测定肿瘤细胞体外药物敏感性的临床应用。方法：对75例胃癌、55例肠癌、55例膀胱癌及6例舌癌进行肿瘤细胞分离、培养，以MTT法对其体外药物敏感性进行检测。结果：对胃癌、肠癌、膀胱癌敏感度较高的药物与临床经验用药基本相符。75例胃癌病人体外药敏结果和体内疗效总符合率为77.3%，其中MTT敏感组病人总有效率与经验化疗组相比有显著性差异.(P<0.01)。MTT法对新药的临床应用也有较好的指导作用。结论：MTT法对于临床合理用药，实现肿瘤病人的个体化化疗具有重要的价值。
中图分类号：R979.1文献标识码：A文章编号：1001-0408(2000)06-0254-02
, http://www.100md.com
Clinical Application of in Vitro Drug Sensitivity for Tumor Cells Using MTT Assay
CHEN Xiaowen SUN Dahua LI Yunwu
(Dept.of Pharmacy,Shanghai N0.9 People's Hospital,Shanghai 200011)
ABSTRACT： OBJECTIVE： To evaluate the in vitro MTT assay for determining the drug sensitivity in fresh human tumors.METHODS： We tested the samples from 75 patients with gastric cancer,55 patients with colorectal carcinoma,55 patients with bladder cancer and 6 patients with carcinoma of tongue.RESULTS： On the average,the MTT sensitive drug in the above- mentioned first three kinds of solid tumors corresponded with the drug used by clinican experience.The response rate in MTT sensitive group was 73.8% (48/65)while only 34.0% (17/50)in the control group and 0% (0/10)in MTT resistant group.CONCLUSION： MTT assay appears to be useful in exploring the possible anticancer effect of arsenic trioxide on tongue cancer.This test demonstrats that the MTT assay is clinically useful on an individual basis to optimize chemotherapy.
, 百拇医药
KEY WORDS： MTT assay； chemotherapy； drug sensitivity test
近年来，通过肿瘤体外药物敏感性实验指导抗癌药物的个体化治疗已愈来愈受到重视，主要有3H-TdR掺入法、肾囊下接种法及MTT法[1]，其中MTT法快速、简便，代表了所有肿瘤细胞(增殖期及静止期)对药物的反应，已被广泛应用[2～4]。我院临床药学室自1997年建立了MTT法检测肿瘤细胞体外药物敏感性，采用原代培养和药物持续作用法，为临床用药方案选择提供依据，取得了较好的临床效果。
1 材料和方法
1.1 肿瘤细胞：手术中切除新鲜、无污染肿瘤原发灶标本，取自细胞生长旺盛的肿瘤边缘组织，大小约为1.5cm×1.5cm，去除结缔、脂肪、坏死及血污组织，生理盐水冲洗，机械粉碎，用培养液配成一定浓度的细胞悬液[5]。
, 百拇医药
1.2 试剂：培养液(RPMI1640+10%小牛血清+青霉素100IU/ml+链霉素100μg/ml)；MTT(Sigma，5mg/ml)；甲溶解液(10%十二烷基硫酸钠)。
1.3 药物：选取目前常用敏感化疗药物16种，按体内血峰浓度10倍用生理盐水配制：阿霉素(ADR)10μg/ml；甲氨蝶呤(MTX)10μg/ml；丝裂霉素(MMC)10μg/ml；长春新碱(VCR)10μg/ml；氮芥(HN2)10μg/ml；顺铂(DDP)100μg/ml；5-氟尿嘧啶(5-Fu)100μg/ml；阿糖胞苷(Ara-C)250μg/ml；卡铂(CDDCA)50μg/ml；表鬼霉素(VP-16)100μg/ml；环磷酰胺(CTX)300μg/ml；柔红霉素(DNR)4μg/ml；平阳霉素(BLM)30μg/ml；噻替哌(TESPA)2000μg/ml；羟基喜树碱(OPT)500μg/ml；长春地辛(VDS)40μg/ml，—20℃保存。特殊药物再行配制。
, 百拇医药 1.4 方法：(1)取肿瘤细胞悬液，接种于96孔培养板，加抗肿瘤药物，每组药物设3个复孔，并设一组不加药物的癌细胞悬液为对照组，3孔只加培养液作调零孔。37℃、5%CO2饱合湿度培养48h后，各孔加MTT20μl，培养4h后，加甲溶解液，置酶标仪上测定各孔在570nm波长处吸光度值。(2)抑制率=(1—OD用药组/OD对照组)×100%。(3)参考文献的结果[6]，16种化疗药的敏感标准除CTX、CDDCA、BLM定为大于50%，其余均为大于30%。(4)随机选择临床“手术+化疗”患者191例做MTT法测定，其中胃癌75例、肠癌55例、膀胱癌55例、舌癌6例，指导选择用药，并观察临床近期疗效。
2 结果
2.1 16种抗癌药对3种肿瘤的抑制率见表1。
表1 16种抗癌药对3种肿瘤的抑制率(%，
±s)
, http://www.100md.com
胃癌(75例)
肠癌(55例)
膀胱癌(55例)
MMC
41.75±20.04▲
74.21±28.79▲
36.3±16.21▲
CTX*
13.49±6.94
9.35±8.70
9.58±9.20
, 百拇医药
CDDCA*
47.27±17.09
20.31±10.43
44.43±18.53
MTX
11.27±5.36
18.17±6.40
10.8±7.19
Ara-C
18.06±7.60
8.87±6.85
, http://www.100md.com 12.69±2.37
VCR
13.15±5.41
10.03±5.47
14.92±2.43
VP-16
29.06±14.60
22.64±7.10
21.84±2.72
5-Fu
52.16±18.33▲
75.08±17.06▲
, http://www.100md.com
43.52±16.23▲
DNR
20.74±12.70
20.87±12.50
17.73±2.51
ADR
21.86±3.02
18.21±9.15
14.52±2.23
HN2
26.95±11.89
, 百拇医药
19.38±14.45
28.61±12.78
DDP
39.23±17.00▲
23.33±6.71
55.69±15.87▲
BLM*
47.16±18.86
41.77±17.58
35.52±16.00
OPT
, 百拇医药
43.14±13.95▲
31.3±12.61▲
28.41±9.41
TESPA
22.13±16.34
33.62±21.34▲
33.54±13.02▲
VDS
17.66±7.72
9.25±6.15
12.14±10.23
, 百拇医药
*药抑制率>50%为有效；▲为敏感药物
从统计结果看，胃癌对5-Fu、OPT、MMC、DDP敏感性较高，肠癌对5-Fu、MMC、TESPA、OPT敏感性较高，膀胱癌对DDP、5-Fu、MMC、TESPA敏感性较高，与临床经验化疗基本相符。
2.2 75例胃癌病人中，MTT敏感病人65例，其中CR7例，PR41例，总有效率73.8%(48/65)。随机抽取本院同期胃癌病人，未做MTT实验，凭经验化疗。其中，CR3例，PR14例，总有效率34.0%(17/50)。两组病人临床疗效比较采用四格表X2检验，总有效率的差异有非常显著意义(P<0.01)。
2.3 75例胃癌病人中，MTT敏感组病人65例，耐药10例，其中体外敏感和体内有效的符合率为73.8%(48/65)，体外耐药和体内无效的符合率100%(0/10)，体外测定结果和体内疗效总符合率为77.3%〔(48+10)/75〕。
, http://www.100md.com
2.4 对临床应用新药的指导：三氧化二砷临床治疗实体肿瘤未有取得明显进展的报道，在常规的急性早幼粒细胞白血病治疗方案中，血液的砷浓度平均在1μmol/L，峰值在4.8μmol/L，参考此浓度，分别配制三氧化二砷2、4、6、8μmol/L，测定舌癌的体外药物敏感性，结果见图1。
图1 6例舌癌病人对三氧化二砷的剂量效应曲线
由图1可见，抑制率随药物浓度增加而增加，但不同个体的癌组织之间的抑制率差异较大，表明MTT法可反映三氧化二砷作用的强弱，以及不同个体的癌组织对三氧化二砷的敏感性所存在差异。
我们采用三氧化二砷4μmol/L为临界浓度鉴别舌癌对三氧化二砷的敏感性，并作了进一步的临床相关性研究，见表2。
表2 3例敏感舌癌病人治疗情况
, 百拇医药
性别
年龄
抑制率
治疗方案
疗效
存活时间
女
78岁
80.00%
经动脉导管介入三氧化二砷治疗,三氧化二刊注射液100μmol/L,微量输液泵80ml/h,250ml/次,每d2次输入,每5d1个疗程,治疗2个疗程
CR
>24mo
, 百拇医药
男
59岁
84.10%
CR
>12mo
男
75岁
30.65%
PR
>18mo
3 讨论
3.1 MTT法的基本原理是存在于活细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子，而黄色的MTT接受氢原子，被还原成蓝紫色的甲。在波长570nm下，用酶标仪测定反映甲量的吸收度值，就能定量地反映细胞数和细胞活性的变化。实验结果显示，MTT法可反映不同病人对各抗肿瘤药物的敏感性差别，其结果与临床疗效有较好的吻合性，帮助临床进行药敏结果预见下的化疗，取得了较好的临床效果。同时，MTT法对临床新药应用的指导、参考作用，有较高的临床价值。
, 百拇医药
3.2 通过实验，也发现存在如下几个问题：(1)体外药物敏感性实验中，药物直接作用，而体内存在肝、肾等脏器对药物的修饰作用，使药物疗效增强或减弱，且前体药物的疗效无法体现，如环磷酰胺为潜伏化型氮芥类药物，在体外无抗肿瘤活性，进入体内后需先经肝脏微粒体的氧化酶代谢，生成活性代谢物，然后通过体循环到达肿瘤部位，起到抑制肿瘤生长的作用。体外药物敏感性实验中可见该药对胃肠癌、膀胱癌均不敏感。(2)原代培养有癌及非癌细胞等因素，其生物学特性等各方面要比单一的传代细胞株复杂。有学者建立了双琼脂MTT法，将集落法和MTT法结合起来，用双琼脂培养癌细胞，抑制其中的杂质细胞如成纤维细胞的生长，从而提高准确性[6]。(3)本实验采用单层细胞培养，也有学者认为肿瘤组织结构、细胞外基质成分以及不同细胞群体之间的相互作用均对药物的作用有影响，因而提出改进肿瘤细胞暴露于药物的条件，采用组织块培养，保持实体瘤的组织结构，模拟体内实体瘤内细胞的环境，减少药敏实验中细胞生存环境与体内实体瘤中的环境差别[7]。
, 百拇医药 参考文献：
1，鱼达.抗癌药物敏感试验进展[J].肿瘤防治研究，1991，18(1)：57.
2，刘宇军，王国民，贾永锋，等.MTT法在榄香烯乳对人膀胱癌T24细胞体外实验中的应用[J].上海医科大学学报，1997，24(2)：127.
3，徐建民，宋三泰，汤仲明，等.MTT体外药敏试验指导下的乳癌预见性化疗[J].中华肿瘤杂志，1997，19(2)：153.
4，尤迎春，丛文铭，王一，等.MTT比色分析法快速测定肝癌细胞株对化疗药物敏感性的方法研究[J].癌症1996，15(3)：219.
5，鄂征.组织培养在实验研究中的应用.见：鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术[M].第1版.北京：北京出版社，1994：202.
6，翟晓波，李炳生，张毅，等.MTT法和双琼脂MTT法测肿瘤药敏及其临床应用[J].中国临床药学杂志，1996，5(3)：102.
7，梁永锯，潘启超，麦伟源，等.鼻咽癌体外药物敏感性试验方法的初步研究[J].癌症，1996，15(3)：216.
(收稿日期：2000-06-20修回日期：2000-08-15), 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属第九人民医院药剂科，上海市200011
关键词：MTT法；化疗；药敏
中国药房000608
摘要：目的：评价MTT法测定肿瘤细胞体外药物敏感性的临床应用。方法：对75例胃癌、55例肠癌、55例膀胱癌及6例舌癌进行肿瘤细胞分离、培养，以MTT法对其体外药物敏感性进行检测。结果：对胃癌、肠癌、膀胱癌敏感度较高的药物与临床经验用药基本相符。75例胃癌病人体外药敏结果和体内疗效总符合率为77.3%，其中MTT敏感组病人总有效率与经验化疗组相比有显著性差异.(P<0.01)。MTT法对新药的临床应用也有较好的指导作用。结论：MTT法对于临床合理用药，实现肿瘤病人的个体化化疗具有重要的价值。
中图分类号：R979.1文献标识码：A文章编号：1001-0408(2000)06-0254-02
, http://www.100md.com
Clinical Application of in Vitro Drug Sensitivity for Tumor Cells Using MTT Assay
CHEN Xiaowen SUN Dahua LI Yunwu
(Dept.of Pharmacy,Shanghai N0.9 People's Hospital,Shanghai 200011)
ABSTRACT： OBJECTIVE： To evaluate the in vitro MTT assay for determining the drug sensitivity in fresh human tumors.METHODS： We tested the samples from 75 patients with gastric cancer,55 patients with colorectal carcinoma,55 patients with bladder cancer and 6 patients with carcinoma of tongue.RESULTS： On the average,the MTT sensitive drug in the above- mentioned first three kinds of solid tumors corresponded with the drug used by clinican experience.The response rate in MTT sensitive group was 73.8% (48/65)while only 34.0% (17/50)in the control group and 0% (0/10)in MTT resistant group.CONCLUSION： MTT assay appears to be useful in exploring the possible anticancer effect of arsenic trioxide on tongue cancer.This test demonstrats that the MTT assay is clinically useful on an individual basis to optimize chemotherapy.
, 百拇医药
KEY WORDS： MTT assay； chemotherapy； drug sensitivity test
近年来，通过肿瘤体外药物敏感性实验指导抗癌药物的个体化治疗已愈来愈受到重视，主要有3H-TdR掺入法、肾囊下接种法及MTT法[1]，其中MTT法快速、简便，代表了所有肿瘤细胞(增殖期及静止期)对药物的反应，已被广泛应用[2～4]。我院临床药学室自1997年建立了MTT法检测肿瘤细胞体外药物敏感性，采用原代培养和药物持续作用法，为临床用药方案选择提供依据，取得了较好的临床效果。
1 材料和方法
1.1 肿瘤细胞：手术中切除新鲜、无污染肿瘤原发灶标本，取自细胞生长旺盛的肿瘤边缘组织，大小约为1.5cm×1.5cm，去除结缔、脂肪、坏死及血污组织，生理盐水冲洗，机械粉碎，用培养液配成一定浓度的细胞悬液[5]。
, 百拇医药
1.2 试剂：培养液(RPMI1640+10%小牛血清+青霉素100IU/ml+链霉素100μg/ml)；MTT(Sigma，5mg/ml)；甲溶解液(10%十二烷基硫酸钠)。
1.3 药物：选取目前常用敏感化疗药物16种，按体内血峰浓度10倍用生理盐水配制：阿霉素(ADR)10μg/ml；甲氨蝶呤(MTX)10μg/ml；丝裂霉素(MMC)10μg/ml；长春新碱(VCR)10μg/ml；氮芥(HN2)10μg/ml；顺铂(DDP)100μg/ml；5-氟尿嘧啶(5-Fu)100μg/ml；阿糖胞苷(Ara-C)250μg/ml；卡铂(CDDCA)50μg/ml；表鬼霉素(VP-16)100μg/ml；环磷酰胺(CTX)300μg/ml；柔红霉素(DNR)4μg/ml；平阳霉素(BLM)30μg/ml；噻替哌(TESPA)2000μg/ml；羟基喜树碱(OPT)500μg/ml；长春地辛(VDS)40μg/ml，—20℃保存。特殊药物再行配制。
, 百拇医药 1.4 方法：(1)取肿瘤细胞悬液，接种于96孔培养板，加抗肿瘤药物，每组药物设3个复孔，并设一组不加药物的癌细胞悬液为对照组，3孔只加培养液作调零孔。37℃、5%CO2饱合湿度培养48h后，各孔加MTT20μl，培养4h后，加甲溶解液，置酶标仪上测定各孔在570nm波长处吸光度值。(2)抑制率=(1—OD用药组/OD对照组)×100%。(3)参考文献的结果[6]，16种化疗药的敏感标准除CTX、CDDCA、BLM定为大于50%，其余均为大于30%。(4)随机选择临床“手术+化疗”患者191例做MTT法测定，其中胃癌75例、肠癌55例、膀胱癌55例、舌癌6例，指导选择用药，并观察临床近期疗效。
2 结果
2.1 16种抗癌药对3种肿瘤的抑制率见表1。
表1 16种抗癌药对3种肿瘤的抑制率(%，
±s), http://www.100md.com
胃癌(75例)
肠癌(55例)
膀胱癌(55例)
MMC
41.75±20.04▲
74.21±28.79▲
36.3±16.21▲
CTX*
13.49±6.94
9.35±8.70
9.58±9.20
, 百拇医药
CDDCA*
47.27±17.09
20.31±10.43
44.43±18.53
MTX
11.27±5.36
18.17±6.40
10.8±7.19
Ara-C
18.06±7.60
8.87±6.85
, http://www.100md.com 12.69±2.37
VCR
13.15±5.41
10.03±5.47
14.92±2.43
VP-16
29.06±14.60
22.64±7.10
21.84±2.72
5-Fu
52.16±18.33▲
75.08±17.06▲
, http://www.100md.com
43.52±16.23▲
DNR
20.74±12.70
20.87±12.50
17.73±2.51
ADR
21.86±3.02
18.21±9.15
14.52±2.23
HN2
26.95±11.89
, 百拇医药
19.38±14.45
28.61±12.78
DDP
39.23±17.00▲
23.33±6.71
55.69±15.87▲
BLM*
47.16±18.86
41.77±17.58
35.52±16.00
OPT
, 百拇医药
43.14±13.95▲
31.3±12.61▲
28.41±9.41
TESPA
22.13±16.34
33.62±21.34▲
33.54±13.02▲
VDS
17.66±7.72
9.25±6.15
12.14±10.23
, 百拇医药
*药抑制率>50%为有效；▲为敏感药物
从统计结果看，胃癌对5-Fu、OPT、MMC、DDP敏感性较高，肠癌对5-Fu、MMC、TESPA、OPT敏感性较高，膀胱癌对DDP、5-Fu、MMC、TESPA敏感性较高，与临床经验化疗基本相符。
2.2 75例胃癌病人中，MTT敏感病人65例，其中CR7例，PR41例，总有效率73.8%(48/65)。随机抽取本院同期胃癌病人，未做MTT实验，凭经验化疗。其中，CR3例，PR14例，总有效率34.0%(17/50)。两组病人临床疗效比较采用四格表X2检验，总有效率的差异有非常显著意义(P<0.01)。
2.3 75例胃癌病人中，MTT敏感组病人65例，耐药10例，其中体外敏感和体内有效的符合率为73.8%(48/65)，体外耐药和体内无效的符合率100%(0/10)，体外测定结果和体内疗效总符合率为77.3%〔(48+10)/75〕。
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2.4 对临床应用新药的指导：三氧化二砷临床治疗实体肿瘤未有取得明显进展的报道，在常规的急性早幼粒细胞白血病治疗方案中，血液的砷浓度平均在1μmol/L，峰值在4.8μmol/L，参考此浓度，分别配制三氧化二砷2、4、6、8μmol/L，测定舌癌的体外药物敏感性，结果见图1。
图1 6例舌癌病人对三氧化二砷的剂量效应曲线
由图1可见，抑制率随药物浓度增加而增加，但不同个体的癌组织之间的抑制率差异较大，表明MTT法可反映三氧化二砷作用的强弱，以及不同个体的癌组织对三氧化二砷的敏感性所存在差异。
我们采用三氧化二砷4μmol/L为临界浓度鉴别舌癌对三氧化二砷的敏感性，并作了进一步的临床相关性研究，见表2。
表2 3例敏感舌癌病人治疗情况
, 百拇医药
性别
年龄
抑制率
治疗方案
疗效
存活时间
女
78岁
80.00%
经动脉导管介入三氧化二砷治疗,三氧化二刊注射液100μmol/L,微量输液泵80ml/h,250ml/次,每d2次输入,每5d1个疗程,治疗2个疗程
CR
>24mo
, 百拇医药
男
59岁
84.10%
CR
>12mo
男
75岁
30.65%
PR
>18mo
3 讨论
3.1 MTT法的基本原理是存在于活细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子，而黄色的MTT接受氢原子，被还原成蓝紫色的甲。在波长570nm下，用酶标仪测定反映甲量的吸收度值，就能定量地反映细胞数和细胞活性的变化。实验结果显示，MTT法可反映不同病人对各抗肿瘤药物的敏感性差别，其结果与临床疗效有较好的吻合性，帮助临床进行药敏结果预见下的化疗，取得了较好的临床效果。同时，MTT法对临床新药应用的指导、参考作用，有较高的临床价值。
, 百拇医药
3.2 通过实验，也发现存在如下几个问题：(1)体外药物敏感性实验中，药物直接作用，而体内存在肝、肾等脏器对药物的修饰作用，使药物疗效增强或减弱，且前体药物的疗效无法体现，如环磷酰胺为潜伏化型氮芥类药物，在体外无抗肿瘤活性，进入体内后需先经肝脏微粒体的氧化酶代谢，生成活性代谢物，然后通过体循环到达肿瘤部位，起到抑制肿瘤生长的作用。体外药物敏感性实验中可见该药对胃肠癌、膀胱癌均不敏感。(2)原代培养有癌及非癌细胞等因素，其生物学特性等各方面要比单一的传代细胞株复杂。有学者建立了双琼脂MTT法，将集落法和MTT法结合起来，用双琼脂培养癌细胞，抑制其中的杂质细胞如成纤维细胞的生长，从而提高准确性[6]。(3)本实验采用单层细胞培养，也有学者认为肿瘤组织结构、细胞外基质成分以及不同细胞群体之间的相互作用均对药物的作用有影响，因而提出改进肿瘤细胞暴露于药物的条件，采用组织块培养，保持实体瘤的组织结构，模拟体内实体瘤内细胞的环境，减少药敏实验中细胞生存环境与体内实体瘤中的环境差别[7]。
, 百拇医药 参考文献：
1，鱼达.抗癌药物敏感试验进展[J].肿瘤防治研究，1991，18(1)：57.
2，刘宇军，王国民，贾永锋，等.MTT法在榄香烯乳对人膀胱癌T24细胞体外实验中的应用[J].上海医科大学学报，1997，24(2)：127.
3，徐建民，宋三泰，汤仲明，等.MTT体外药敏试验指导下的乳癌预见性化疗[J].中华肿瘤杂志，1997，19(2)：153.
4，尤迎春，丛文铭，王一，等.MTT比色分析法快速测定肝癌细胞株对化疗药物敏感性的方法研究[J].癌症1996，15(3)：219.
5，鄂征.组织培养在实验研究中的应用.见：鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术[M].第1版.北京：北京出版社，1994：202.
6，翟晓波，李炳生，张毅，等.MTT法和双琼脂MTT法测肿瘤药敏及其临床应用[J].中国临床药学杂志，1996，5(3)：102.
7，梁永锯，潘启超，麦伟源，等.鼻咽癌体外药物敏感性试验方法的初步研究[J].癌症，1996，15(3)：216.
(收稿日期：2000-06-20修回日期：2000-08-15), 百拇医药