阿尔茨海默病与α1-抗糜蛋白酶基因微卫星多态性的相关研究
作者：江三多 林嗣萃 汤国梅 钱伊萍 汪栋祥 陈美娣 金通观 张明园
单位：200030 上海市精神卫生研究所
关键词：阿尔茨海默病；载脂蛋白E；糜蛋白酶
中华医学杂志990818 【摘要】 目的 探讨上海地区汉族人中α1抗糜蛋白酶(AACT)基因微卫星多态性与阿尔茨海默病(AD)之间的相互关系及ApoE*ε4基因的影响。方法 应用扩增片段长度多态性技术(Amp-FLP)，在63例AD患者和62例健康老人中观察了AACT基因微卫星和ApoE基因多态性的分布，并对AACT基因微卫星多态性与AD进行关联分析，探讨ApoE基因ε4等位基因对微卫星多态性的影响。结果 (1)AD患者中AACT基因微卫星多态性共观察到8种等位基因，其片段大小范围在149 bp～167 bp,A6、A10等位基因频率显著降低(ZA6=2.2357，ZA10=1.9668，P<0.05)，但仅有A6等位基因与AD显著负关联(RR=0.4,χ2=4.683，P<0.05)；(2)按有无ApoE ε4等位基因分型后，仅非ApoE ε4型AD与AACT*A6等位基因负关联(RR=0.29，χ2=3.917,P<0.05)。结论 上海地区人群中AACT基因微卫星多态性A6等位基因与AD关联，这种关联仅出现于非ApoE ε4型人群中。
, 百拇医药
The association between microsatellite polymorphism of α1-antichymotrypsin gene and Alzheimer's disease
JIANG Sanduo LIN Sicui TANG Guomei et al.
(Shanghai Institute of Mental Health，Shanghai 200030，China)
【Abstract】 Objectives To examine the relation between the microsatellite polymorphism of α1-antichy-motrypsin (AACT) gene and Alzheimer's disease (AD) in Han population of Shanghai area，and to detect the influences of apolipoprotein E (ApoE) gene ε4 allele on this relation.Methods The polymorphism of AACT and ApoE gene were genotyped in 63 AD cases，62 controls with amplified fragment length polymorphism typing (Amp-FLP).Results The frequencies of A6 and A10 alleles of the microsatellite polymorphism of AACT gene polymorphism were decreased markedly (ZA6=2.235 7，ZA10=1.966 8，P<0.05)，but only A6 allele was negatively associated with AD (RR=0.4，χ2=4.683,P<0.05).When the data were split into ApoE*ε4-positive and ApoE*ε4-negative groups，the drop of AACT*A6 allele frequency was only associated with AD with non-ApoEε4 (RR=0.29，χ2=3.197，P<0.05).Conclusion AACT*A6 allele may be associated with AD negatively in Shanghai area，and this effect only exits in non-ApoE*ε4 AD.
, 百拇医药
【Key words】 Alzheimer's，disease Apolipoprotein E Chymotrypsin
近来研究表明，阿尔茨海默病(AD)患者脑中的一些病理性伴侣蛋白如载脂蛋白E(ApoE)、早老素(PS)、α1-抗糜蛋白酶(AACT)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)等，可能在AD的病理和发生中发挥重要作用。其中AACT基因与AD的关系已成为AD病因学研究的一大热点。1993年Byth等[1]首先报道，AACT基因5′端UTR区域存在(CT)n(AT)n微卫星多态性，由A1～A17共17种等位基因构成。1997年Morgan等[2]研究证实，AACT基因A10等位基因可能与ApoE*ε4基因共同构成AD的可疑风险因素，但这还需要在不同的人群及人种中加以证实。为此，我们在上海地区汉族人群中进行了AACT基因微卫星和ApoE基因多态性分析，以探讨AACT基因与AD关系以及AD患者中ApoEε4等位基因对该多态性的影响。
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对象与方法
一、对象
AD病例均由上海精神卫生中心提供，诊断标准参照美国精神疾病诊断统计手册第3版修订版(DSM-Ⅲ-R)。AD患者共63例，男24例，女39例，平均年龄(71±11)岁；对照组为健康老人共62例，男27例，女35例，平均年龄(66±6)岁。以上研究对象均为随机选择，无血缘关系。
二、基因多态性检测
1.DNA的提取：抽取静脉血2 ml，EDTA抗凝，分离白细胞，采用常规法提取DNA。
2.AACT基因微卫星多态性分型[1]:引物为5′-ATA CAT ATA TAC GTA TAC ACA T-3′和5′-GTA AGC AAT GAG CAA TGA TT-3′。PCR反应体积10 μl，内含50 ng基因组DNA，10 mmol/L Tris-HCl，1.5 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTPs，5 pmol引物，0.1 μl α-32P-dCTP 11 100 MBq/mmol/L，1U Taq酶。反应程序为32周期(94 ℃ 30秒，50 ℃ 30秒，72 ℃3秒)。PCR产物在7 mol/L尿素的6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上作垂直电泳。电泳完毕后真空干燥凝胶，室温放射自显影。
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3.ApoE基因型检测：参照文献[3]。
4.数据处理：χ2检验各组等位基因频率分布的差异，采用Woolf's公式[4]通过相对风险率(RR)的计算，对AD与AACT微卫星多态性进行关联分析。
结果
1.AACT微卫星多态性各等位基因频率的分布：AACT基因微卫星多态性结果：共观察到8种等位基因，其片段大小范围为149～167 bp，AD患者和健康老人的各等位基因的频率分布(表1)。Z检验结果表明，AD患者中A6、A10等位基因频率显著降低(ZA6=2.235 7，ZA10=1.966 8，P<0.05)，但经Woolf公式计算，仅有A6等位基因与AD显著负关联(RR=0.4，χ2=4.683，P<0.05)。
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表1 AACT微卫星多态性各等位基因的频率分布(频率) 组别
AACT等位基因(bp)
A4(167)
A5(165)
A6(163)
A7(161)
A8(159)
A9(157)
A10(155)
A13(149)
健康组
-
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0.0242(3)
0.1613(20)
0.0968(12)
0.4032(50)
0.2339(29)
0.0645(8)
0.0161(2)
AD组
0.0079(1)
0.0556(7)
0.0714(9)*
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0.1746(22)
0.4365(55)
0.2381(30)
0.0159(2)**
-
注：经吻合度检验，均符合Hardy-Weinberg平衡定律。与健康老人相比，*Z=2.2357;**Z=1.9668,P值均<0.05，-：未测；括号内为例数
2.ApoE ε4基因对AACT基因与AD关系的影响：按有无ApoE ε4等位基因对AD患者分型后，ApoE ε4型和非ApoE ε4型患者中AACT微卫星多态性的分布(表2)。结果表明，仅非ApoE ε4型AD患者中出现AACT*A6等位基因的显著降低(Z=2.239 6，P<0.05)，并与AD负关联(RR=0.29，χ2=3.917,P<0.05)。
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表2 伴或不伴ApoE ε4的AD患者和健康老人中AACT基因微卫星多态性分布(频率) 组别
AACT等位基因(bp)
A4(167)
A5(165)
A6(163)
A7(161)
A8(159)
A9(157)
A10(155)
A13(149)
ApoE*ε4
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健康组
-
-
0.0417(1)
0.1250(3)
0.5416(13)
0.2500(6)
0.0417(1)
-
AD组
0.0167(1)
0.0167(1)
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0.0667(4)
0.1832(11)
0.4000(24)
0.3000(18)
0.0167(1)
-
非ApoE*ε4
健康组
-
0.0300(3)
0.1900(19)
0.0900(9)
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0.3800(38)
0.2300(23)
0.0600(6)
0.0200(2)
AD组
-
0.0909(6)
0.0758(5)*
0.1667(11)
0.4696(31)
0.1818(12)
0.0152(1)
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-
注：与健康组比较，*Z=2.239 6,P<0.05；括号内为例数；“-”未测
讨论
研究证实，α1-抗糜蛋白酶(AACT)大量存在于AD患者的病理特征老年斑和脑脊液中，并可促进淀粉样蛋白(Aβ)生成难溶的淀粉样纤维沉积。因此，AACT在AD的病理过程中具有重要意义[5]。1995年Kamboh等[6]发现，在AACT的信号肽基因中存在多态性，并改变ApoE ε4基因所致AD的发病风险率，此后，绝大多数却未能重复此结果。Morgan等从微卫星角度观察了AACT基因与AD的关系，发现AD患者与正常人间不存在AACT基因5′端UTR区域微卫星多态性分布的差异。但按ApoE基因型将AD患者分为ε4型和非ε4型两组后，ε4型患者中A10等位基因的频率显著高于ε4型正常对照。因此认为，AACT*A10等位基因与ApoE ε4等位基因显著关联，并增强ApoE ε4所致AD的发病风险率。
, 百拇医药
我们发现，AD患者中A10、A6等位基因的频率较正常人均明显降低，但经关联分析后，仅A6等位基因表现出与AD的负关联，但这种关联仅存在于非ApoE ε4型人群中。这与Morgan等的结果大相径庭。我们认为，种族差别可能是导致这种差异的主要原因。在我们的健康老人对照中，AACT*A8的频率最高(0.40)，其次为A9(0.23)、A6(0.16)，A10基因的频率较低(0.06)；而在Morgan等所采用的正常人中，AACT*A10的频率最高(0.45)，其次为A8(0.20)、A7(0.13)，A6的频率却相当低(0.02)。其次AD分类的异质性和诊断标准的不统一也可能是导致这些差异的原因。当然这种差异也可能是由于环境因子如饮食习惯、地理环境、人的生长状态等，改变了AACT的作用效果所致。
综上所述，进一步探寻与AACT基因多态性相关联的其它遗传因素或环境因素，也许能找到AD的新的可靠的生物学标记。
本课题为上海市卫生局科技发展基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1 Byth BC，Cox DW.Two secutive dinucleotide repeats constitute an informative marker at the α1-antichymotrypsin locus.Hum Mol Genet，1993，2:1085.
2 Morgan K，Morgan L，Carpenter K，et al.Microsatellite polymorphism of the α1-antichymotrypsin gene locus associated with sporadic Alzheimer's disease.Hum Genet，1997，99:27-31.
3 江三多，冯国鄞，吴晓东，等.Alzheimer病与载脂蛋白Eε4等位基因的关联分析.中华精神科杂志，1996，29：15-18.
, 百拇医药
4 Woolf B.On estimating the relation between blood group and disease.Am Hum Genet，1995，19:251-253.
5 Eriksson S，Janciauskiene S，Lannfelt L.α1-Antichymotrypsin regulates Alzheimer β-amyloid peptide fibril formation.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:2 313-2 317.
6 Kamboh MI，Sanghera DK，Ferrell RE，et al.ApoE*ε4 associated Alzheimer's disease risk is modified by alpha α1-antichymotrypsin polymorphism.Nat Genet，1994，10:486-488.
(收稿：1998-08-24 修回：1998-11-27), http://www.100md.com
单位：200030 上海市精神卫生研究所
关键词：阿尔茨海默病；载脂蛋白E；糜蛋白酶
中华医学杂志990818 【摘要】 目的 探讨上海地区汉族人中α1抗糜蛋白酶(AACT)基因微卫星多态性与阿尔茨海默病(AD)之间的相互关系及ApoE*ε4基因的影响。方法 应用扩增片段长度多态性技术(Amp-FLP)，在63例AD患者和62例健康老人中观察了AACT基因微卫星和ApoE基因多态性的分布，并对AACT基因微卫星多态性与AD进行关联分析，探讨ApoE基因ε4等位基因对微卫星多态性的影响。结果 (1)AD患者中AACT基因微卫星多态性共观察到8种等位基因，其片段大小范围在149 bp～167 bp,A6、A10等位基因频率显著降低(ZA6=2.2357，ZA10=1.9668，P<0.05)，但仅有A6等位基因与AD显著负关联(RR=0.4,χ2=4.683，P<0.05)；(2)按有无ApoE ε4等位基因分型后，仅非ApoE ε4型AD与AACT*A6等位基因负关联(RR=0.29，χ2=3.917,P<0.05)。结论 上海地区人群中AACT基因微卫星多态性A6等位基因与AD关联，这种关联仅出现于非ApoE ε4型人群中。
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The association between microsatellite polymorphism of α1-antichymotrypsin gene and Alzheimer's disease
JIANG Sanduo LIN Sicui TANG Guomei et al.
(Shanghai Institute of Mental Health，Shanghai 200030，China)
【Abstract】 Objectives To examine the relation between the microsatellite polymorphism of α1-antichy-motrypsin (AACT) gene and Alzheimer's disease (AD) in Han population of Shanghai area，and to detect the influences of apolipoprotein E (ApoE) gene ε4 allele on this relation.Methods The polymorphism of AACT and ApoE gene were genotyped in 63 AD cases，62 controls with amplified fragment length polymorphism typing (Amp-FLP).Results The frequencies of A6 and A10 alleles of the microsatellite polymorphism of AACT gene polymorphism were decreased markedly (ZA6=2.235 7，ZA10=1.966 8，P<0.05)，but only A6 allele was negatively associated with AD (RR=0.4，χ2=4.683,P<0.05).When the data were split into ApoE*ε4-positive and ApoE*ε4-negative groups，the drop of AACT*A6 allele frequency was only associated with AD with non-ApoEε4 (RR=0.29，χ2=3.197，P<0.05).Conclusion AACT*A6 allele may be associated with AD negatively in Shanghai area，and this effect only exits in non-ApoE*ε4 AD.
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【Key words】 Alzheimer's，disease Apolipoprotein E Chymotrypsin
近来研究表明，阿尔茨海默病(AD)患者脑中的一些病理性伴侣蛋白如载脂蛋白E(ApoE)、早老素(PS)、α1-抗糜蛋白酶(AACT)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)等，可能在AD的病理和发生中发挥重要作用。其中AACT基因与AD的关系已成为AD病因学研究的一大热点。1993年Byth等[1]首先报道，AACT基因5′端UTR区域存在(CT)n(AT)n微卫星多态性，由A1～A17共17种等位基因构成。1997年Morgan等[2]研究证实，AACT基因A10等位基因可能与ApoE*ε4基因共同构成AD的可疑风险因素，但这还需要在不同的人群及人种中加以证实。为此，我们在上海地区汉族人群中进行了AACT基因微卫星和ApoE基因多态性分析，以探讨AACT基因与AD关系以及AD患者中ApoEε4等位基因对该多态性的影响。
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对象与方法
一、对象
AD病例均由上海精神卫生中心提供，诊断标准参照美国精神疾病诊断统计手册第3版修订版(DSM-Ⅲ-R)。AD患者共63例，男24例，女39例，平均年龄(71±11)岁；对照组为健康老人共62例，男27例，女35例，平均年龄(66±6)岁。以上研究对象均为随机选择，无血缘关系。
二、基因多态性检测
1.DNA的提取：抽取静脉血2 ml，EDTA抗凝，分离白细胞，采用常规法提取DNA。
2.AACT基因微卫星多态性分型[1]:引物为5′-ATA CAT ATA TAC GTA TAC ACA T-3′和5′-GTA AGC AAT GAG CAA TGA TT-3′。PCR反应体积10 μl，内含50 ng基因组DNA，10 mmol/L Tris-HCl，1.5 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTPs，5 pmol引物，0.1 μl α-32P-dCTP 11 100 MBq/mmol/L，1U Taq酶。反应程序为32周期(94 ℃ 30秒，50 ℃ 30秒，72 ℃3秒)。PCR产物在7 mol/L尿素的6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上作垂直电泳。电泳完毕后真空干燥凝胶，室温放射自显影。
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3.ApoE基因型检测：参照文献[3]。
4.数据处理：χ2检验各组等位基因频率分布的差异，采用Woolf's公式[4]通过相对风险率(RR)的计算，对AD与AACT微卫星多态性进行关联分析。
结果
1.AACT微卫星多态性各等位基因频率的分布：AACT基因微卫星多态性结果：共观察到8种等位基因，其片段大小范围为149～167 bp，AD患者和健康老人的各等位基因的频率分布(表1)。Z检验结果表明，AD患者中A6、A10等位基因频率显著降低(ZA6=2.235 7，ZA10=1.966 8，P<0.05)，但经Woolf公式计算，仅有A6等位基因与AD显著负关联(RR=0.4，χ2=4.683，P<0.05)。
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表1 AACT微卫星多态性各等位基因的频率分布(频率) 组别
AACT等位基因(bp)
A4(167)
A5(165)
A6(163)
A7(161)
A8(159)
A9(157)
A10(155)
A13(149)
健康组
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0.0242(3)
0.1613(20)
0.0968(12)
0.4032(50)
0.2339(29)
0.0645(8)
0.0161(2)
AD组
0.0079(1)
0.0556(7)
0.0714(9)*
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0.1746(22)
0.4365(55)
0.2381(30)
0.0159(2)**
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注：经吻合度检验，均符合Hardy-Weinberg平衡定律。与健康老人相比，*Z=2.2357;**Z=1.9668,P值均<0.05，-：未测；括号内为例数
2.ApoE ε4基因对AACT基因与AD关系的影响：按有无ApoE ε4等位基因对AD患者分型后，ApoE ε4型和非ApoE ε4型患者中AACT微卫星多态性的分布(表2)。结果表明，仅非ApoE ε4型AD患者中出现AACT*A6等位基因的显著降低(Z=2.239 6，P<0.05)，并与AD负关联(RR=0.29，χ2=3.917,P<0.05)。
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表2 伴或不伴ApoE ε4的AD患者和健康老人中AACT基因微卫星多态性分布(频率) 组别
AACT等位基因(bp)
A4(167)
A5(165)
A6(163)
A7(161)
A8(159)
A9(157)
A10(155)
A13(149)
ApoE*ε4
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健康组
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0.0417(1)
0.1250(3)
0.5416(13)
0.2500(6)
0.0417(1)
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AD组
0.0167(1)
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0.0667(4)
0.1832(11)
0.4000(24)
0.3000(18)
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非ApoE*ε4
健康组
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0.0300(3)
0.1900(19)
0.0900(9)
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0.3800(38)
0.2300(23)
0.0600(6)
0.0200(2)
AD组
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0.0909(6)
0.0758(5)*
0.1667(11)
0.4696(31)
0.1818(12)
0.0152(1)
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注：与健康组比较，*Z=2.239 6,P<0.05；括号内为例数；“-”未测
讨论
研究证实，α1-抗糜蛋白酶(AACT)大量存在于AD患者的病理特征老年斑和脑脊液中，并可促进淀粉样蛋白(Aβ)生成难溶的淀粉样纤维沉积。因此，AACT在AD的病理过程中具有重要意义[5]。1995年Kamboh等[6]发现，在AACT的信号肽基因中存在多态性，并改变ApoE ε4基因所致AD的发病风险率，此后，绝大多数却未能重复此结果。Morgan等从微卫星角度观察了AACT基因与AD的关系，发现AD患者与正常人间不存在AACT基因5′端UTR区域微卫星多态性分布的差异。但按ApoE基因型将AD患者分为ε4型和非ε4型两组后，ε4型患者中A10等位基因的频率显著高于ε4型正常对照。因此认为，AACT*A10等位基因与ApoE ε4等位基因显著关联，并增强ApoE ε4所致AD的发病风险率。
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我们发现，AD患者中A10、A6等位基因的频率较正常人均明显降低，但经关联分析后，仅A6等位基因表现出与AD的负关联，但这种关联仅存在于非ApoE ε4型人群中。这与Morgan等的结果大相径庭。我们认为，种族差别可能是导致这种差异的主要原因。在我们的健康老人对照中，AACT*A8的频率最高(0.40)，其次为A9(0.23)、A6(0.16)，A10基因的频率较低(0.06)；而在Morgan等所采用的正常人中，AACT*A10的频率最高(0.45)，其次为A8(0.20)、A7(0.13)，A6的频率却相当低(0.02)。其次AD分类的异质性和诊断标准的不统一也可能是导致这些差异的原因。当然这种差异也可能是由于环境因子如饮食习惯、地理环境、人的生长状态等，改变了AACT的作用效果所致。
综上所述，进一步探寻与AACT基因多态性相关联的其它遗传因素或环境因素，也许能找到AD的新的可靠的生物学标记。
本课题为上海市卫生局科技发展基金资助项目
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参考文献
1 Byth BC，Cox DW.Two secutive dinucleotide repeats constitute an informative marker at the α1-antichymotrypsin locus.Hum Mol Genet，1993，2:1085.
2 Morgan K，Morgan L，Carpenter K，et al.Microsatellite polymorphism of the α1-antichymotrypsin gene locus associated with sporadic Alzheimer's disease.Hum Genet，1997，99:27-31.
3 江三多，冯国鄞，吴晓东，等.Alzheimer病与载脂蛋白Eε4等位基因的关联分析.中华精神科杂志，1996，29：15-18.
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4 Woolf B.On estimating the relation between blood group and disease.Am Hum Genet，1995，19:251-253.
5 Eriksson S，Janciauskiene S，Lannfelt L.α1-Antichymotrypsin regulates Alzheimer β-amyloid peptide fibril formation.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:2 313-2 317.
6 Kamboh MI，Sanghera DK，Ferrell RE，et al.ApoE*ε4 associated Alzheimer's disease risk is modified by alpha α1-antichymotrypsin polymorphism.Nat Genet，1994，10:486-488.
(收稿：1998-08-24 修回：1998-11-27), http://www.100md.com