大蒜及双氧水降解内毒素的作用机理研究
作者：李德懿 焦炳华 朱玉平 汪俊
单位：李德懿(上海第二医科大学口腔医学院口腔内科 200011)；焦炳华(第二军医大学微生物教研室)；朱玉平(第二军医大学微生物教研室)；汪俊(上海第二医科大学口腔医学院口腔内科 200011)
关键词：内毒素类；生物降解；大蒜
中华口腔医学杂志000504 【摘要】 目的 阐明大蒜及双氧水降解内毒素(lipopolysaccharide, LPS) 的作用机理。 方法 采用热酚水法、苯酚-氯仿-石油醚法、鲎试验、Lowry灰迹光谱法及气相色谱等方法，分析大蒜、双氧水降解LPS的量效与时效关系及结构变化。结果 30%双氧水降解作用最大，其余依次为大蒜原汁、大蒜1∶1稀释液及3%双氧水，作用具浓度依赖性，大蒜组还有时间依赖性。实验证实30%双氧水能裂解LPS类脂A还原端C1位上的磷酸基团，而大蒜作用机理较复杂，除水解作用外，还能螯合LPS分子，影响LPS单体发挥作用。结论 各种药物降解LPS的部位和机理不同。
, 百拇医药
Effect and mechanism of garlic juice and hydrogen peroxide on the degradation of lipopolysaccharide
LI Deyi
(Department of Oral Medicine, School of Stomatology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011, China)
JIAO Binghua，ZHU Yuping，et al.
【Abstract】 Objective To elucidate the effect and mechanism of garlic juice and hydrogen peroxide on the degradation of lipopolysaccharide (LPS).Methods Hot phenol-water method, phenol-chloroform-petroleum ether procedure, limulus lysate test, lowry′s ash spetrographical examination and gas-liquid chromatography etc. were used in this study. Results The sequence of degradation effect was 30% hydrogen peroxide (H), the most powerful,followed by garlic juice (G), 1∶1 diluted G and 3% H, their effects were dose dependent and G group was time dependent. The mechanism of H on LPS degradation was fractionization of phosphoryl in position 1 from lipid A, while that of G was complex, it could bound LPS molecule and influenced its effect besides LPS hydrolysis. Conclusion The study may imply that the degradation position and mechanism on LPS are different and remain to be elucidated.
, 百拇医药
【Key words】 Endotoxins； Biodegradation； Garlic
内毒素是G菌外膜中特有的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)成分，其活性部分主要在类脂A，在临床G菌感染中起重要作用。70年代后，随着厌氧培养技术的进展，逐步明确G厌氧菌是口腔感染性疾病的重要致病菌，它们释放的LPS普遍存在于菌斑、牙石、龈沟液和牙周袋中，具多种生物活性，引起科研工作者的广泛兴趣[1，2]。口腔中LPS的持续存在，无疑对控制和消除疾病不利，降解LPS是需要解决的关键问题和目的所在，有助于牙周病及根尖周病的防治。有些药物如大蒜素和双氧水对LPS的作用已有实验证实[3，4]，但作用机理尚不清楚。我们在原有实验研究的基础上，采用鲎试验、气相色谱及Lowry灰迹光谱法等技术，继续深入研究其机理，旨在为临床口腔G菌感染的防治提供实用方法和科学依据，提高牙周病的防治水平。
, http://www.100md.com
材料和方法
1.细菌培养和内毒素制备：具核梭杆菌(Fusobacteria nucleatum, Fn) ATCC 10953，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg) ATCC132，在厌氧手套箱中37℃培养72～120 h，收集细菌，蒸馏水洗涤3次，干燥后用热酚水法提取内毒素，用苯酚-氯仿-石油醚法(2∶5∶8, V/V)纯化内毒素[5]。
2.药物和仪器：①大蒜原液：取去皮新鲜大蒜(山东省龙口市复发中记工业园)1 000 g，双蒸水洗2次，粉碎机榨汁，过滤得pH 5.5淡黄色澄清的大蒜原液，放入4℃冰箱中备用。②30%双氧水和3%双氧水(上海桃浦化工厂)。③鲎试剂盒(Ⅱ)定量检测微量内毒素(上海市医学化验所，批号970101)。④721分光光度剂(上海第二分析仪器厂)。
3.降解LPS的量效与时效分析：根据预初实验，在Fn和Pg LPS 200 mg/L中，分别加入不同浓度的大蒜汁和双氧水2 ml，在体外37℃孵育15 s、30 s，分别放入透析袋，双蒸水透析3 d，透去药物，以避免药物对鲎试验干扰而产生假阳性或假阴性，以无热原水同样处理Fn和Pg LPS作为阳性对照，另设无热原水的阴性对照。每种混合液稀释1×106，使LPS最终浓度为100 ng/L，采用鲎试验(偶氮显色法)活性变化，研究药物作用的量效、时效关系。
, http://www.100md.com
4.降解LPS的结构分析：将大蒜、双氧水处理前、后的LPS，用改进的光谱法测定氨基葡萄糖[6]，按Lowry等[7]的灰迹光谱法测定总磷量，用气相色谱进行脂肪酸分析，比较药物处理前后的LPS结构变化。
结果
1.大蒜、双氧水对LPS的降解率： 药物对LPS降解率计算公式为：降解率(%)＝[(1-药物处理后LPS(100 ng/L)活性/无热原水处理LPS(100 ng/L)活性)]×100%。无热原水处理Fn和Pg LPS(100 ng/L)，于波长545 nm处测得的吸光度(A)值分别为0.31和0.37(15 s和30 s测出的值无明显差别)。大蒜和双氧水处理Fn和Pg LPS的降解率见表1，2。
表1 大蒜汁对具核酸杆菌及牙龈卟啉
单胞菌内毒素的降解率(%) 内毒素来源
, http://www.100md.com
作用时间
(min)
大蒜汁
大蒜汁1∶1稀释液
A值
降解率(%)
A值
降解率(%)
具核梭杆菌
15
0.15
51.6
0.21
, 百拇医药
32.3
30
0.09
71.0
0.08
74.2
牙龈卟啉单胞菌
15
0.17
54.1
0.23
37.8
30
, 百拇医药
0.14
62.2
0.18
51.4
表2 双氧水对具核酸杆菌及牙龈卟啉
单胞菌内毒素的降解率(%) 内毒素来源
作用时间
(min)
30%双氧水
3%双氧水
A值
降解率(%)
, http://www.100md.com
A值
降解率(%)
具核梭杆菌
15
0.01
96.8
0.24
22.6
30
0.02
93.5
0.21
32.3
, http://www.100md.com
牙龈卟啉单胞菌
15
<0.01
>99.0
0.25
32.4
30
<0.01
>99.0
0.26
29.7
2.LPS降解产物结构分析：将大蒜、双氧水处理前后的LPS，经过气相色谱和Lowry灰迹光谱法分析后，LPS的脂肪酸变化不大，双氧水处理的LPS磷含量明显下降(表3)，而大蒜能促使LPS凝聚沉淀，从而影响LPS单体发挥作用。表3 大蒜及双氧水处理内毒素的氨基
, http://www.100md.com
葡萄糖和总磷测定(mg/g) 处理方法
内毒素来源
氨基葡萄糖
总磷
大蒜处理
Fn
118.94
30.53
Pg
208.11
27.32
30%双氧水处理
, 百拇医药 Fn
148.52
8.38
Pg
224.32
13.24
对照(不作处理)
Fn
165.21
20.24
Pg
217.69
31.46
, 百拇医药
注：Fn：具核梭杆菌； Pg：牙龈卟啉单胞菌讨论
一、大蒜、双氧水降解LPS的量效、时效分析
上述实验结果证实：①降解LPS作用以30%双氧水最大，其余依次为大蒜原汁、大蒜1∶1稀释液和3%双氧水；②它们降解LPS的作用有浓度依赖性，浓度高降解作用强；③大蒜汁作用30 min的降解作用明显高于15 min组，具有时间依赖性；④双氧水组作用15 min与30 min，其降解作用无明显差别，说明双氧水作用快，降解作用主要在前15 min。
二、大蒜、双氧水降解LPS的结构分析
本实验采用改良的光谱法测定氨基葡萄糖量，用Lowry灰迹光谱法分析总磷量，从表3结果来看，30%双氧水处理组磷含量明显下降，如将它们化成以 mol/mg为单位，可发现正好每个分子的LPS少1个磷酸基因，这充分说明双氧水主要裂解LPS类脂A还原端C1位的磷酸基团，据文献报道单磷酸类脂A的毒性明显下降，与双氧水降解LPS后生物活性下降结果相符。大蒜成分复杂，使LPS生物活性下降的机理也较复杂，实验中推测大蒜有些成分能与LPS发生结合，或螯合LPS分子，使LPS凝聚沉淀，从而影响LPS单体发挥作用。
, 百拇医药
三、大蒜、双氧水降解内毒素的可能机理
大蒜系百合科葱属植物，是我国民间常用中药之一，味辛、性温，有杀虫、消肿、抗菌及消炎等作用，因此大蒜被誉为“天然广谱抗生素”。大蒜汁pH值为5.5，偏酸性，能水解类脂A的一些基团；加之大蒜中含有蒜酶、过氧化酶、磷酸酯酶及一些水解酶[8]，均有可能与LPS分子中的基团作用，降解LPS；本实验还证实大蒜的有些成分能螯合LPS，使之凝聚沉淀，从而影响LPS单体发挥作用。
双氧水是一种强氧化剂，是非特异性的抗菌物质，具有防腐、灭菌、除臭及清洁等作用。它分解能释放大量新生态氧，可氧化分解LPS大分子。本实验结果表明，双氧水主要裂解LPS类脂A还原端C1位上的磷酸基团，因此毒性和生物活性明显下降。
实验结果提示，大蒜和双氧水降解LPS的机理不同，特别是大蒜中有效成分的不同作用，值得进一步研究阐明。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39510763)
参考文献
1，Shelburne CE, Sandberg GP, Binsfeld CA, et al. Monoclonal antibodies to lipopolysaccharide of four oral bacterial associated with periodontal disease. J Periodontal Res, 1993, 28:1-9.
2，李德懿. 牙周病微生物学. 第1版. 天津: 天津科技翻译出版公司，1994. 114-130, 245-251.
3，李德懿, 刘正, 焦炳华. 六种常见口腔厌氧菌内毒素的生物化学特性研究. 中华口腔医学杂志，1993,28:332-335.
, 百拇医药
4，李德懿, 黄宗仁. 病变牙骨质内毒素的研究. 中华口腔医学杂志，1985,20:193-195.
5，Galanos C, Luderitz O, Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. Eur J Biochem, 1969,9:245-249.
6，Strominger J, Park JT, Thompson RE. Composition of the cell wall of staphylococcus aureas: Its relation to the mechanism of action of penicillin. J Biol Chem, 1959, 234:3 263-3 265.
7，Lowry H, Roberts NR, Leiner KY ,et al. The quantitative histochemistry of brain 1 chemical methods.J Biol Chem, 1954,207:1.
8，阴健, 郭力弓,主编.中药现代研究与临床应用.第1版.北京:学苑出版社,1994. 86-91.
(收稿日期：1999-12-29), http://www.100md.com
单位：李德懿(上海第二医科大学口腔医学院口腔内科 200011)；焦炳华(第二军医大学微生物教研室)；朱玉平(第二军医大学微生物教研室)；汪俊(上海第二医科大学口腔医学院口腔内科 200011)
关键词：内毒素类；生物降解；大蒜
中华口腔医学杂志000504 【摘要】 目的 阐明大蒜及双氧水降解内毒素(lipopolysaccharide, LPS) 的作用机理。 方法 采用热酚水法、苯酚-氯仿-石油醚法、鲎试验、Lowry灰迹光谱法及气相色谱等方法，分析大蒜、双氧水降解LPS的量效与时效关系及结构变化。结果 30%双氧水降解作用最大，其余依次为大蒜原汁、大蒜1∶1稀释液及3%双氧水，作用具浓度依赖性，大蒜组还有时间依赖性。实验证实30%双氧水能裂解LPS类脂A还原端C1位上的磷酸基团，而大蒜作用机理较复杂，除水解作用外，还能螯合LPS分子，影响LPS单体发挥作用。结论 各种药物降解LPS的部位和机理不同。
, 百拇医药
Effect and mechanism of garlic juice and hydrogen peroxide on the degradation of lipopolysaccharide
LI Deyi
(Department of Oral Medicine, School of Stomatology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011, China)
JIAO Binghua，ZHU Yuping，et al.
【Abstract】 Objective To elucidate the effect and mechanism of garlic juice and hydrogen peroxide on the degradation of lipopolysaccharide (LPS).Methods Hot phenol-water method, phenol-chloroform-petroleum ether procedure, limulus lysate test, lowry′s ash spetrographical examination and gas-liquid chromatography etc. were used in this study. Results The sequence of degradation effect was 30% hydrogen peroxide (H), the most powerful,followed by garlic juice (G), 1∶1 diluted G and 3% H, their effects were dose dependent and G group was time dependent. The mechanism of H on LPS degradation was fractionization of phosphoryl in position 1 from lipid A, while that of G was complex, it could bound LPS molecule and influenced its effect besides LPS hydrolysis. Conclusion The study may imply that the degradation position and mechanism on LPS are different and remain to be elucidated.
, 百拇医药
【Key words】 Endotoxins； Biodegradation； Garlic
内毒素是G菌外膜中特有的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)成分，其活性部分主要在类脂A，在临床G菌感染中起重要作用。70年代后，随着厌氧培养技术的进展，逐步明确G厌氧菌是口腔感染性疾病的重要致病菌，它们释放的LPS普遍存在于菌斑、牙石、龈沟液和牙周袋中，具多种生物活性，引起科研工作者的广泛兴趣[1，2]。口腔中LPS的持续存在，无疑对控制和消除疾病不利，降解LPS是需要解决的关键问题和目的所在，有助于牙周病及根尖周病的防治。有些药物如大蒜素和双氧水对LPS的作用已有实验证实[3，4]，但作用机理尚不清楚。我们在原有实验研究的基础上，采用鲎试验、气相色谱及Lowry灰迹光谱法等技术，继续深入研究其机理，旨在为临床口腔G菌感染的防治提供实用方法和科学依据，提高牙周病的防治水平。
, http://www.100md.com
材料和方法
1.细菌培养和内毒素制备：具核梭杆菌(Fusobacteria nucleatum, Fn) ATCC 10953，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg) ATCC132，在厌氧手套箱中37℃培养72～120 h，收集细菌，蒸馏水洗涤3次，干燥后用热酚水法提取内毒素，用苯酚-氯仿-石油醚法(2∶5∶8, V/V)纯化内毒素[5]。
2.药物和仪器：①大蒜原液：取去皮新鲜大蒜(山东省龙口市复发中记工业园)1 000 g，双蒸水洗2次，粉碎机榨汁，过滤得pH 5.5淡黄色澄清的大蒜原液，放入4℃冰箱中备用。②30%双氧水和3%双氧水(上海桃浦化工厂)。③鲎试剂盒(Ⅱ)定量检测微量内毒素(上海市医学化验所，批号970101)。④721分光光度剂(上海第二分析仪器厂)。
3.降解LPS的量效与时效分析：根据预初实验，在Fn和Pg LPS 200 mg/L中，分别加入不同浓度的大蒜汁和双氧水2 ml，在体外37℃孵育15 s、30 s，分别放入透析袋，双蒸水透析3 d，透去药物，以避免药物对鲎试验干扰而产生假阳性或假阴性，以无热原水同样处理Fn和Pg LPS作为阳性对照，另设无热原水的阴性对照。每种混合液稀释1×106，使LPS最终浓度为100 ng/L，采用鲎试验(偶氮显色法)活性变化，研究药物作用的量效、时效关系。
, http://www.100md.com
4.降解LPS的结构分析：将大蒜、双氧水处理前、后的LPS，用改进的光谱法测定氨基葡萄糖[6]，按Lowry等[7]的灰迹光谱法测定总磷量，用气相色谱进行脂肪酸分析，比较药物处理前后的LPS结构变化。
结果
1.大蒜、双氧水对LPS的降解率： 药物对LPS降解率计算公式为：降解率(%)＝[(1-药物处理后LPS(100 ng/L)活性/无热原水处理LPS(100 ng/L)活性)]×100%。无热原水处理Fn和Pg LPS(100 ng/L)，于波长545 nm处测得的吸光度(A)值分别为0.31和0.37(15 s和30 s测出的值无明显差别)。大蒜和双氧水处理Fn和Pg LPS的降解率见表1，2。
表1 大蒜汁对具核酸杆菌及牙龈卟啉
单胞菌内毒素的降解率(%) 内毒素来源
, http://www.100md.com
作用时间
(min)
大蒜汁
大蒜汁1∶1稀释液
A值
降解率(%)
A值
降解率(%)
具核梭杆菌
15
0.15
51.6
0.21
, 百拇医药
32.3
30
0.09
71.0
0.08
74.2
牙龈卟啉单胞菌
15
0.17
54.1
0.23
37.8
30
, 百拇医药
0.14
62.2
0.18
51.4
表2 双氧水对具核酸杆菌及牙龈卟啉
单胞菌内毒素的降解率(%) 内毒素来源
作用时间
(min)
30%双氧水
3%双氧水
A值
降解率(%)
, http://www.100md.com
A值
降解率(%)
具核梭杆菌
15
0.01
96.8
0.24
22.6
30
0.02
93.5
0.21
32.3
, http://www.100md.com
牙龈卟啉单胞菌
15
<0.01
>99.0
0.25
32.4
30
<0.01
>99.0
0.26
29.7
2.LPS降解产物结构分析：将大蒜、双氧水处理前后的LPS，经过气相色谱和Lowry灰迹光谱法分析后，LPS的脂肪酸变化不大，双氧水处理的LPS磷含量明显下降(表3)，而大蒜能促使LPS凝聚沉淀，从而影响LPS单体发挥作用。表3 大蒜及双氧水处理内毒素的氨基
, http://www.100md.com
葡萄糖和总磷测定(mg/g) 处理方法
内毒素来源
氨基葡萄糖
总磷
大蒜处理
Fn
118.94
30.53
Pg
208.11
27.32
30%双氧水处理
, 百拇医药 Fn
148.52
8.38
Pg
224.32
13.24
对照(不作处理)
Fn
165.21
20.24
Pg
217.69
31.46
, 百拇医药
注：Fn：具核梭杆菌； Pg：牙龈卟啉单胞菌讨论
一、大蒜、双氧水降解LPS的量效、时效分析
上述实验结果证实：①降解LPS作用以30%双氧水最大，其余依次为大蒜原汁、大蒜1∶1稀释液和3%双氧水；②它们降解LPS的作用有浓度依赖性，浓度高降解作用强；③大蒜汁作用30 min的降解作用明显高于15 min组，具有时间依赖性；④双氧水组作用15 min与30 min，其降解作用无明显差别，说明双氧水作用快，降解作用主要在前15 min。
二、大蒜、双氧水降解LPS的结构分析
本实验采用改良的光谱法测定氨基葡萄糖量，用Lowry灰迹光谱法分析总磷量，从表3结果来看，30%双氧水处理组磷含量明显下降，如将它们化成以 mol/mg为单位，可发现正好每个分子的LPS少1个磷酸基因，这充分说明双氧水主要裂解LPS类脂A还原端C1位的磷酸基团，据文献报道单磷酸类脂A的毒性明显下降，与双氧水降解LPS后生物活性下降结果相符。大蒜成分复杂，使LPS生物活性下降的机理也较复杂，实验中推测大蒜有些成分能与LPS发生结合，或螯合LPS分子，使LPS凝聚沉淀，从而影响LPS单体发挥作用。
, 百拇医药
三、大蒜、双氧水降解内毒素的可能机理
大蒜系百合科葱属植物，是我国民间常用中药之一，味辛、性温，有杀虫、消肿、抗菌及消炎等作用，因此大蒜被誉为“天然广谱抗生素”。大蒜汁pH值为5.5，偏酸性，能水解类脂A的一些基团；加之大蒜中含有蒜酶、过氧化酶、磷酸酯酶及一些水解酶[8]，均有可能与LPS分子中的基团作用，降解LPS；本实验还证实大蒜的有些成分能螯合LPS，使之凝聚沉淀，从而影响LPS单体发挥作用。
双氧水是一种强氧化剂，是非特异性的抗菌物质，具有防腐、灭菌、除臭及清洁等作用。它分解能释放大量新生态氧，可氧化分解LPS大分子。本实验结果表明，双氧水主要裂解LPS类脂A还原端C1位上的磷酸基团，因此毒性和生物活性明显下降。
实验结果提示，大蒜和双氧水降解LPS的机理不同，特别是大蒜中有效成分的不同作用，值得进一步研究阐明。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39510763)
参考文献
1，Shelburne CE, Sandberg GP, Binsfeld CA, et al. Monoclonal antibodies to lipopolysaccharide of four oral bacterial associated with periodontal disease. J Periodontal Res, 1993, 28:1-9.
2，李德懿. 牙周病微生物学. 第1版. 天津: 天津科技翻译出版公司，1994. 114-130, 245-251.
3，李德懿, 刘正, 焦炳华. 六种常见口腔厌氧菌内毒素的生物化学特性研究. 中华口腔医学杂志，1993,28:332-335.
, 百拇医药
4，李德懿, 黄宗仁. 病变牙骨质内毒素的研究. 中华口腔医学杂志，1985,20:193-195.
5，Galanos C, Luderitz O, Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. Eur J Biochem, 1969,9:245-249.
6，Strominger J, Park JT, Thompson RE. Composition of the cell wall of staphylococcus aureas: Its relation to the mechanism of action of penicillin. J Biol Chem, 1959, 234:3 263-3 265.
7，Lowry H, Roberts NR, Leiner KY ,et al. The quantitative histochemistry of brain 1 chemical methods.J Biol Chem, 1954,207:1.
8，阴健, 郭力弓,主编.中药现代研究与临床应用.第1版.北京:学苑出版社,1994. 86-91.
(收稿日期：1999-12-29), http://www.100md.com