UV改性DACRON材料抗细菌粘附研究
作者：万昌秀 段友容 张尔永 吴刚 乐以伦 黄云超
单位：万昌秀(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；段友容(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；吴刚(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；乐以伦(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；张尔永(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；黄云超(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)
关键词：紫外接枝；表面改性；细菌粘附
生物医学工程学杂志000103 摘 要：介绍了对人工心瓣植入用涤纶布(Dacron)表面以紫外辐照为主进行接枝改性的方法，在其材料表面引入聚乙二醇(Polyethlene glycol, PEG)，利用PEG的“化学放大”作用再引入肝素(Heparin, Hep)，改性后的材料抗细菌粘附效果显著，与未改性材料相比，细菌粘附减少90%。
, 百拇医药
Modification of Surface of Dacron Materials by UV Irradiation
for Prevention of Microbial Adhesion
Wan Changxiu Duan Yourong Wu Gang Yue Yilun
(Sichuan University, Chengdu 610065)
Zhang Eryong Huang Yunchao
(First Affiliated Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
, 百拇医药
Abstract：UV irradiation grafting method was used to modify the surface of Prosthetic Valve materials(Dacron) for prevention of bacteria-adhesion, and PEG was introduced to the surface of Dacron by this method. The result showed that the chemical magnifying effect of PEG improved the grafting of heparin on the material surface. This method can obviously reduce the number of adherent bacteria.
Key words：Graft polymerization by UV irradiation Microbial adhesion Surface modification▲
, http://www.100md.com
1 前 言
生物材料为中心的感染(Biomaterial Centered Infection, BCI)已成为常见的并令人棘手的植入材料临床感染。Stamm统计BCI已占美国医院内感染的45%，死亡率为5%～60%[1]，植入物遭到细菌的侵入，经常是手术失败的主要原因。感染的优势菌种一般为表皮葡萄球菌(Staphylococci Epidermatie, SE)、金黄葡萄球菌(Staphylococci aureus, SA)、大肠杆菌(Escherichia coli, EC)、绿脓杆菌(Pseudommonas aeuriginosa,PA)等[2]。至今由于缺少有效的抗感染手段，常不得不再进行手术，取出已感染的植入物。这不仅使患者饱受痛苦，而且严重时危及生命。因此植入物的感染问题，已成为制约人工器官植入成败和发展的严重问题。无疑，一种兼顾植入生物材料对本体力学性能和表面血液相容性及抗细菌粘附的需要，用紫外辐照对生物材料表面接枝改性是很有希望的方法。本文研究了PEG在人工心瓣用Dacron改性中的作用，通过改性后材料的细菌粘附同位素计数结果，比较了材料改性前后的抗细菌粘附效果。
, 百拇医药
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
Dacron，G型，批号DR-9786，苏州织布厂人造血管研究室；PEG-400，AR，上海浦东高南化工厂；丙烯酰胺(AAm)，CR，中国临海化工厂；二环乙基碳二亚胺(DCCI)，CR，余山化工厂；肝素(Hep.)，本实验室自制(效价：112国际单位/mg)；3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，上海原子核研究所；紫外发生装置，MODEL：TEGE-1/9.5国产；接触角仪，Erma 209B型，日本光学株式会社；FJ-2107 P液体闪烁计数器，西安二六二厂。
2.2 实验方法
2.2.1 试样预处理 将试样剪成1 cm×1 cm的正方形小片，依次分别用三氯甲烷、甲醇、丙酮超声波洗涤10 min，用蒸馏水冲洗干净，烘干浸入苯甲醇中溶胀10 h，取出样品，洗净备用。
, 百拇医药
2.2.2 紫外辐照接枝AAm或PEG 将预处理过的试样分别放在PEG-400、PEG-4000或AAm溶液中，紫外辐照数小时，然后取出试样，除去表面未反应的单体及均聚物，干燥、消毒后备用。将接枝后的材料测其表面水接触角，将接枝PEG的材料做红外衰减全反射。
2.2.3 化学方法接枝Hep 将已辐照接枝PEG-400的材料加入DCCI的THF溶液中，再加入pH 4.2的肝素水溶液，室温搅拌24 h，取出试样，除去未反应单体及均聚物，干燥、消毒后备用。
2.2.4 细菌动态粘附实验 将PET-g-PEG-Hep消毒处理后的材料，加入用3H-TDR标记的SE细菌悬液中，分别在0、6、12、18、24、30 h等时间点各取出材料4片，用相当于中等血管中血流剪切速率15 dyne/cm2的PBS 20 ml冲洗材料表面，去除未粘附的细菌和附着在材料上游离的3H-TDR，作对材料30 h以上的动态粘附实验，然后同位素闪烁计数。
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3 结果与讨论
3.1 表面改性试剂的选择
3.1.1 聚乙二醇和丙烯酰胺的选择 据有关文献报道，AAm为高分子材料表面改性常用单体之一，具有良好的水溶性，用以增加含水量或减少材料表面与血液间的界面自由能[3]。目前已知的各类水溶性高分子链结构中，分子间作用最小的应属聚乙二醇链[4]，PEG是一种理想的增加材料表面亲水性的表面活性试剂。本实验尝试过接枝AAm和PEG-400，对接枝后的试样分别测其表面的水接触角(0.1 μl水滴)如下：
表1 辐照时间与接触角的变化
Table 1 Changes in contact angle with UV treated time 辐照时间(hr)
0
, http://www.100md.com
4
8
12
16
20
24
28
32
接触角(°)
接枝AAm
65
43
54
55
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58
54
53
55
54
接枝PEG-400
65
35
29
28
29
36
34
, http://www.100md.com 30
35
结果表明：在本实验条件下改善材料亲水性方面，PEG-400比AAm效果明显。从文献上的反应条件看，接枝AAm需加光敏剂NalO4等，如不添加光敏剂，则实验过程需密封和排除反应过程中产生的氧气，对设备要求较高。而接枝PEG影响因素少，易于在涤纶布上接枝，所以PEG是首选试剂。
3.1.2 不同分子量聚乙二醇的选择 PEG具有类似海藻的链结构，分子间作用力很小，对水具有低界面能、水溶性、柔顺性及高运动性，它可以很好地增加材料表面亲水性，也可以增加材料的抗凝血性[4]。但常温下PEG-400液态，在单位面积内PEG浓度较高，对接枝有利，而PEG-4000是固态，如用PEG-4000作为接枝物，需将PEG-4000配成溶液，其中的水分子占据了材料表面的部分空间，将在PEG与材料表面的反应基团之间形成屏障，不利于接枝。
, 百拇医药
3.1.3 肝素的选择 Wang等人[5]研究表明，抗凝血性能好的材料，可阻止细菌的粘附。肝素是一种线性阴离子多糖，其含有的多种-OH、-COOH、-SO3H、-NH2等官能团，均能用于高分子材料的肝素化反应，能与许多凝血因子如凝血酶、凝血酶原、因子Ⅸ-Ⅹ Ⅱ等形成很强的复合物，从而中和它们的活性，显示出优良的抗凝血性能。
3.2 材料的编织情况对紫外接枝改性的影响
用于改性的人工心瓣涤纶布，一种厚度是0.264 mm，编织较疏松，另一种厚度是0.784 mm，且编织紧密，无论哪种厚度，编织物其内部孔隙面积比外表面积大几倍至几十倍，随厚度的增加内表面积的增大，该比值明显增大。加上较厚的编织物因结构更密实，紫外线很难照射入内部，因而在涤纶布内部很难发生接枝反应，使产生接枝的面积仅为总面积很少一部分。而较薄的织布相对来说编织较疏松，产生接枝的面积与总面积之比较大，所以接枝效果较好一些。
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3.3 表面分析
3.3.1 接触角 为了准确测定Dacron的静态接触角，试样采用与Dacron化学组成相同的薄膜。测试结果表明，最初随辐照时间的增加，其接触角减小，在12 h左右水接触角达最小值，此后水接触角变化趋缓，且略增大，可能是因为有部分接枝发生降解或随碳链的空间转动进入材料内部。接触角较小，说明材料表面亲水性提高，表面自由能减小，血液相容性相应提高。经5次测定结果表明，材料改性前的接触角是65°±3°(n=5)，材料—PEG接枝共聚物表面的接触角是28°±3°(n=5)(辐照时间12 h)。
3.3.2 衰减全反射 将PET-g-PEG和PET的红外衰减全反射(ATR)谱图进行比较，PET-g-PEG谱图在1091 cm-1和943 cm-1处出现PEG的特征峰。这是因为：紫外辐射引起聚合物表面大分子降解生成自由基，参与接枝单体同时受辐射引发，与大分子链上的自由基发生接枝反应，形成了Dacron与PEG的接枝共聚物。
, 百拇医药
3.4 细菌粘附实验
生长曲线就是细菌在体外液体培养过程中定时测量计数，以时间为横坐标，细菌数为纵坐标绘制的曲线(图1)。该图为4种常见感染菌的生长曲线。
图1 细菌的生长曲线
Fig 1 Bacterial growth curves
图2 SE对PET编织材料的粘附曲线
Fig 2 The SE adhesive curves to Dacron CPM(count per minute)
, 百拇医药 细菌对植入材料Dacron的粘附与细菌的生长曲线关系密切，处于生长曲线不同时期的细菌，粘附能力不同。从图2看出，细菌对材料的粘附与细菌生长曲线基本同步，是一个动态变化过程。图2是SE对Dacron材料改性前后的动态粘附情况的比较。结果表明，对Dacron材料紫外辐照接枝PEG-400，再用化学方法接枝Hep抗细菌的粘附能力大为增强，与未改性材料比较，细菌粘附减少90%。
4 结 论
PEG-400接枝到Dacron表面后，可以很大程度上提高材料表面亲水性；在表面改性试剂方面，在本实验条件下，PEG-400比常用的AAm对PET薄膜亲水性改变为更明显，且具有影响因素少，反应过程简单等优点，更适于进行表面接枝；紫外辐照接枝PEG-400因是液态，比PEG-4000水溶液接枝效果更好；先紫外接枝PEG-400后用化学方法接枝肝素的改性材料可以使其表面细菌粘附量大大减少，与未改性材料比较，细菌粘附减少90%。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670717)
参考文献：
[1]Stamm WE. Infections related to medical devices. ANN Inter Med, 1978; 89∶784
[2]Sugarman B, Young EJ. Infections associated with prosthetic devices:Magnitude of problem Infec. Dis Clin N Am, 1989; 3∶187
[3]Emiko Uchida et al.Jounal of Applied Polymer Science, 1990; 41∶677
[4]Lin Sichong. Molecular engineering researches on polymeric. Biomaterials, Polymer Bulletin, 1997; 1∶1
[5]Wang IW, Anderson JM, Marchant RE.J Biomed Mater Res, 1993; 27∶1119
收稿日期：1998-08-31
修改日期：1998-12-04, http://www.100md.com
单位：万昌秀(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；段友容(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；吴刚(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；乐以伦(四川大学 高分子材料系，成都 610065)；张尔永(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)；黄云超(华西医科大学附属第一医院，成都 610041)
关键词：紫外接枝；表面改性；细菌粘附
生物医学工程学杂志000103 摘 要：介绍了对人工心瓣植入用涤纶布(Dacron)表面以紫外辐照为主进行接枝改性的方法，在其材料表面引入聚乙二醇(Polyethlene glycol, PEG)，利用PEG的“化学放大”作用再引入肝素(Heparin, Hep)，改性后的材料抗细菌粘附效果显著，与未改性材料相比，细菌粘附减少90%。
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Modification of Surface of Dacron Materials by UV Irradiation
for Prevention of Microbial Adhesion
Wan Changxiu Duan Yourong Wu Gang Yue Yilun
(Sichuan University, Chengdu 610065)
Zhang Eryong Huang Yunchao
(First Affiliated Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
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Abstract：UV irradiation grafting method was used to modify the surface of Prosthetic Valve materials(Dacron) for prevention of bacteria-adhesion, and PEG was introduced to the surface of Dacron by this method. The result showed that the chemical magnifying effect of PEG improved the grafting of heparin on the material surface. This method can obviously reduce the number of adherent bacteria.
Key words：Graft polymerization by UV irradiation Microbial adhesion Surface modification▲
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1 前 言
生物材料为中心的感染(Biomaterial Centered Infection, BCI)已成为常见的并令人棘手的植入材料临床感染。Stamm统计BCI已占美国医院内感染的45%，死亡率为5%～60%[1]，植入物遭到细菌的侵入，经常是手术失败的主要原因。感染的优势菌种一般为表皮葡萄球菌(Staphylococci Epidermatie, SE)、金黄葡萄球菌(Staphylococci aureus, SA)、大肠杆菌(Escherichia coli, EC)、绿脓杆菌(Pseudommonas aeuriginosa,PA)等[2]。至今由于缺少有效的抗感染手段，常不得不再进行手术，取出已感染的植入物。这不仅使患者饱受痛苦，而且严重时危及生命。因此植入物的感染问题，已成为制约人工器官植入成败和发展的严重问题。无疑，一种兼顾植入生物材料对本体力学性能和表面血液相容性及抗细菌粘附的需要，用紫外辐照对生物材料表面接枝改性是很有希望的方法。本文研究了PEG在人工心瓣用Dacron改性中的作用，通过改性后材料的细菌粘附同位素计数结果，比较了材料改性前后的抗细菌粘附效果。
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2 实验部分
2.1 试剂与仪器
Dacron，G型，批号DR-9786，苏州织布厂人造血管研究室；PEG-400，AR，上海浦东高南化工厂；丙烯酰胺(AAm)，CR，中国临海化工厂；二环乙基碳二亚胺(DCCI)，CR，余山化工厂；肝素(Hep.)，本实验室自制(效价：112国际单位/mg)；3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，上海原子核研究所；紫外发生装置，MODEL：TEGE-1/9.5国产；接触角仪，Erma 209B型，日本光学株式会社；FJ-2107 P液体闪烁计数器，西安二六二厂。
2.2 实验方法
2.2.1 试样预处理 将试样剪成1 cm×1 cm的正方形小片，依次分别用三氯甲烷、甲醇、丙酮超声波洗涤10 min，用蒸馏水冲洗干净，烘干浸入苯甲醇中溶胀10 h，取出样品，洗净备用。
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2.2.2 紫外辐照接枝AAm或PEG 将预处理过的试样分别放在PEG-400、PEG-4000或AAm溶液中，紫外辐照数小时，然后取出试样，除去表面未反应的单体及均聚物，干燥、消毒后备用。将接枝后的材料测其表面水接触角，将接枝PEG的材料做红外衰减全反射。
2.2.3 化学方法接枝Hep 将已辐照接枝PEG-400的材料加入DCCI的THF溶液中，再加入pH 4.2的肝素水溶液，室温搅拌24 h，取出试样，除去未反应单体及均聚物，干燥、消毒后备用。
2.2.4 细菌动态粘附实验 将PET-g-PEG-Hep消毒处理后的材料，加入用3H-TDR标记的SE细菌悬液中，分别在0、6、12、18、24、30 h等时间点各取出材料4片，用相当于中等血管中血流剪切速率15 dyne/cm2的PBS 20 ml冲洗材料表面，去除未粘附的细菌和附着在材料上游离的3H-TDR，作对材料30 h以上的动态粘附实验，然后同位素闪烁计数。
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3 结果与讨论
3.1 表面改性试剂的选择
3.1.1 聚乙二醇和丙烯酰胺的选择 据有关文献报道，AAm为高分子材料表面改性常用单体之一，具有良好的水溶性，用以增加含水量或减少材料表面与血液间的界面自由能[3]。目前已知的各类水溶性高分子链结构中，分子间作用最小的应属聚乙二醇链[4]，PEG是一种理想的增加材料表面亲水性的表面活性试剂。本实验尝试过接枝AAm和PEG-400，对接枝后的试样分别测其表面的水接触角(0.1 μl水滴)如下：
表1 辐照时间与接触角的变化
Table 1 Changes in contact angle with UV treated time 辐照时间(hr)
0
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4
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接触角(°)
接枝AAm
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接枝PEG-400
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35
结果表明：在本实验条件下改善材料亲水性方面，PEG-400比AAm效果明显。从文献上的反应条件看，接枝AAm需加光敏剂NalO4等，如不添加光敏剂，则实验过程需密封和排除反应过程中产生的氧气，对设备要求较高。而接枝PEG影响因素少，易于在涤纶布上接枝，所以PEG是首选试剂。
3.1.2 不同分子量聚乙二醇的选择 PEG具有类似海藻的链结构，分子间作用力很小，对水具有低界面能、水溶性、柔顺性及高运动性，它可以很好地增加材料表面亲水性，也可以增加材料的抗凝血性[4]。但常温下PEG-400液态，在单位面积内PEG浓度较高，对接枝有利，而PEG-4000是固态，如用PEG-4000作为接枝物，需将PEG-4000配成溶液，其中的水分子占据了材料表面的部分空间，将在PEG与材料表面的反应基团之间形成屏障，不利于接枝。
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3.1.3 肝素的选择 Wang等人[5]研究表明，抗凝血性能好的材料，可阻止细菌的粘附。肝素是一种线性阴离子多糖，其含有的多种-OH、-COOH、-SO3H、-NH2等官能团，均能用于高分子材料的肝素化反应，能与许多凝血因子如凝血酶、凝血酶原、因子Ⅸ-Ⅹ Ⅱ等形成很强的复合物，从而中和它们的活性，显示出优良的抗凝血性能。
3.2 材料的编织情况对紫外接枝改性的影响
用于改性的人工心瓣涤纶布，一种厚度是0.264 mm，编织较疏松，另一种厚度是0.784 mm，且编织紧密，无论哪种厚度，编织物其内部孔隙面积比外表面积大几倍至几十倍，随厚度的增加内表面积的增大，该比值明显增大。加上较厚的编织物因结构更密实，紫外线很难照射入内部，因而在涤纶布内部很难发生接枝反应，使产生接枝的面积仅为总面积很少一部分。而较薄的织布相对来说编织较疏松，产生接枝的面积与总面积之比较大，所以接枝效果较好一些。
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3.3 表面分析
3.3.1 接触角 为了准确测定Dacron的静态接触角，试样采用与Dacron化学组成相同的薄膜。测试结果表明，最初随辐照时间的增加，其接触角减小，在12 h左右水接触角达最小值，此后水接触角变化趋缓，且略增大，可能是因为有部分接枝发生降解或随碳链的空间转动进入材料内部。接触角较小，说明材料表面亲水性提高，表面自由能减小，血液相容性相应提高。经5次测定结果表明，材料改性前的接触角是65°±3°(n=5)，材料—PEG接枝共聚物表面的接触角是28°±3°(n=5)(辐照时间12 h)。
3.3.2 衰减全反射 将PET-g-PEG和PET的红外衰减全反射(ATR)谱图进行比较，PET-g-PEG谱图在1091 cm-1和943 cm-1处出现PEG的特征峰。这是因为：紫外辐射引起聚合物表面大分子降解生成自由基，参与接枝单体同时受辐射引发，与大分子链上的自由基发生接枝反应，形成了Dacron与PEG的接枝共聚物。
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3.4 细菌粘附实验
生长曲线就是细菌在体外液体培养过程中定时测量计数，以时间为横坐标，细菌数为纵坐标绘制的曲线(图1)。该图为4种常见感染菌的生长曲线。
图1 细菌的生长曲线
Fig 1 Bacterial growth curves
图2 SE对PET编织材料的粘附曲线
Fig 2 The SE adhesive curves to Dacron CPM(count per minute)
, 百拇医药 细菌对植入材料Dacron的粘附与细菌的生长曲线关系密切，处于生长曲线不同时期的细菌，粘附能力不同。从图2看出，细菌对材料的粘附与细菌生长曲线基本同步，是一个动态变化过程。图2是SE对Dacron材料改性前后的动态粘附情况的比较。结果表明，对Dacron材料紫外辐照接枝PEG-400，再用化学方法接枝Hep抗细菌的粘附能力大为增强，与未改性材料比较，细菌粘附减少90%。
4 结 论
PEG-400接枝到Dacron表面后，可以很大程度上提高材料表面亲水性；在表面改性试剂方面，在本实验条件下，PEG-400比常用的AAm对PET薄膜亲水性改变为更明显，且具有影响因素少，反应过程简单等优点，更适于进行表面接枝；紫外辐照接枝PEG-400因是液态，比PEG-4000水溶液接枝效果更好；先紫外接枝PEG-400后用化学方法接枝肝素的改性材料可以使其表面细菌粘附量大大减少，与未改性材料比较，细菌粘附减少90%。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670717)
参考文献：
[1]Stamm WE. Infections related to medical devices. ANN Inter Med, 1978; 89∶784
[2]Sugarman B, Young EJ. Infections associated with prosthetic devices:Magnitude of problem Infec. Dis Clin N Am, 1989; 3∶187
[3]Emiko Uchida et al.Jounal of Applied Polymer Science, 1990; 41∶677
[4]Lin Sichong. Molecular engineering researches on polymeric. Biomaterials, Polymer Bulletin, 1997; 1∶1
[5]Wang IW, Anderson JM, Marchant RE.J Biomed Mater Res, 1993; 27∶1119
收稿日期：1998-08-31
修改日期：1998-12-04, http://www.100md.com