补肾健脾化瘀方药对老年小鼠免疫功能、自由基代谢及全血粘度的影响
作者：李志新 王传社 李顺成
单位：北京医科大学中西医结合教研室，北京 100083
关键词：衰老；药物作用；自由基；代谢；免疫活性；药物作用；血液粘度；药物作用；补肾健脾化阏方药☆
北京医科大学学报990517 摘 要 目的：为验证“正虚挟瘀”是中医衰老的重要原因/机制的可靠性及合理性，观察了补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠免疫功能、自由基代谢及全血粘度的影响。方法：老年小鼠连续4周灌服天年安后，检测腹腔巨噬细胞产生的白细胞介素1( interleukin-1, IL-1)、脾淋巴细胞产生的白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)的活性、全血粘度的变化、肝脑的脂质过氧化(lipid peroxides, LPO)含量以及红细胞清除自由基酶的活性，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)。结果：老年小鼠IL-1、IL-2的产生以及SOD、CAT、GSH-Px均明显低于青年小鼠，而肝脑产生的LPO及全血粘度则明显增加。给药后，上述指标均可明显得到改善。结论：说明老年机体确“虚”和“瘀”并存，进一步为我们的观点提供了实验依据；同时也说明IL-2的产生能力降低除与T细胞本身有关外，还与巨噬细胞、自由基代谢等因素有关。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R255.7-332
Study on the effects of kidney-supplementing spleen-invigorating stasis-removing recipe on immune function, free radical metabolism and whole blood viscosity in old mice
LI Zhi-Xin， WANG Chuan-She， LI Shun-Cheng
(Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Beijing Medical University， Beijing 100083)
MeSH Aging/drug eff Free radicals/metab Immunocompetence/drug eff Blood viscosity/drug eff kidney-supplementing spleen-invigorating stasis-removing recipe☆
, 百拇医药
ABSTRACT Objective： In order to verify the reliability and reasonability of the theory that“deficiency of ZhengQi complicated with blood stasis” is the main cause/mechanism of aging. The effect of TianNianAn(TNA), a recipe of the kidney-supplementing spleen-invigorating blood stasis-removing on immune function 、free radical metabolism and whole blood viscosity in old mice was studied. Methods： After old mice were medicated with TNA for 4 weeks, interleukin-2(IL-2) production of splenic lymphocytes, interleukin-1(IL-1) production of peritoneal macrophages, SOD, CAT and glutathione peroxidase(GSH-Px) activities in erythrocytes, LPO contents in liver ( brain and the whole blood viscosity were detected. Results： The activities of IL-1， IL-2， SOD， CAT and GSH-Px in old mice were significantly lower than those in the young mice, and LPO contents in liver and brain and the whole blood viscosity were higher. After medication of TNA, the above-mentioned indices were obviously improved. Conclusion： The old organism really exists the constitution of “deficiency” and “stasis”, and further provides an experimental basis for our viewpoint. Meanwhile the decrease of IL-2 production was closely related with the function of macrophage and free radical metabolism, besides lower function of T lymphocyte.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:442-445)
当前，中医有关衰老的原因/机制尚无定论，但普遍认为“肾虚是中医衰老的主要原因/机制之一”。然而，中医还认为“肾为先天之本，脾为后天之本”、“先天生后天，后天养先天”，故脾胃不足亦是导致肾虚、进而促进衰老的重要因素。但虚久必瘀、瘀又加重虚，虚与瘀互为因果共同促进衰老进程。根据中西医衰老理论、临床实践及实验研究，我们提出了“正虚挟瘀(肾阴阳两虚、脾气虚挟瘀)是中医衰老的主要原因/机制，补肾健脾化瘀是延缓衰老的重要途径”的论点[1]，为了验证上述观点，我们观察了补肾健脾化瘀法对老年小鼠免疫分子白细胞介素1(interleukin-1, IL-1)和白细胞介素2(interleukin, IL-2)的产生、自由基代谢及全血粘度的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
, http://www.100md.com
C57BL/6健康雄性小鼠, 由北京医科大学实验动物部提供，本室饲养至老年(20月龄)，青年鼠为3月龄；实验分成3组，即青年对照组、老年对照组、老年天年安组。
1.2 中药
补肾健脾化瘀天年安主要由枸杞子、薏米、红花等组成，所用中药饮片均购自北京同仁堂药店， 并经过鉴定。 该方水煎2次，合并滤液，浓缩1.5 kg.L-1。灌胃给药，每天每只0.6 ml，持续4周，对照组喂同等量的自来水。
1.3 试剂
Hank's液: 临用前加50 ml.L-1灭活的新鲜小牛血清(new calf serum, NCS)及青链霉素各1万单位。 完全RPMI-1640培养液(GIBCO): 用前加入100 ml.L-1 NCS、1.00×105 u.L-1青霉素、100 mg.L-1链霉素、5×10-5 mol.L-1的2-巯基乙醇、367 mg.L-1 L-谷氨酰胺。刀豆素A(concanavalin A, ConA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 由Sigma公司生产。吲哚美辛购自北京医科大学实验药厂。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymodine, 3 H-TdR) 中国上海科学院原子核能研究所生产。闪烁液: 称取2,5-二硝基恶唑(2,5-diphenyloxazole, PPO, 美国MERK药厂) 2.5g、1，4-双(5-苯基恶唑-2)-苯[1,4-bis(5-phenyloxazoyl-2)benzene, POPOP](上海试剂一厂)0.25 g溶于500 ml二甲苯中。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)标准品购自中科院上海生物化学研究所，联大茴香胺购自Fluka AG CH-9470 Bucks，硫代巴比妥酸购自中国上海试剂二厂。
, 百拇医药
1.4 淋巴因子产生及测定方法
(1)IL-1上清: 腹腔巨噬细胞2×106 ml-1、加LPS(终质量浓度10 mg.L-1)和吲哚美辛(终浓度10 mol.L-1), 培养48 h后收集上清，检测参照文献[2]；(2)IL-2的产生及检测: 参考Andersson法[3]。淋巴母细胞的制备: 3月龄小鼠, 脾细胞悬液5×106 ml-1, 同时加ConA(终浓度7 mg.L-1), 培养72 h。IL-2上清的检测: 将上述淋巴母细胞配成2×106 ml-1,放入96孔板中，每孔0.1 ml(待测IL-2上清已倍比稀释于此板中，每分闪烁数0.1 ml)。培养24 h, 收集前6 h加入3H-TdR每孔20 μg(3.7×1011 Bq.L-1), 收集细胞, 液闪检测每分闪烁数(cpm)值。
, 百拇医药
1.5 自由基指标的检测
小鼠摘眼球取血，肝素抗凝，冰水中保存备用。断头处死动物，迅速取出约0.3 g肝组织并剥取全脑，用冷生理盐水制成100 mg.L-1组织匀浆，冰水中保存备用。同时迅速准确称取(25±5) mg肝组织，放入1 ml冷乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)三氯乙酸液中保存备用。采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)比色法测定肝、脑脂质过氧化(lipid peroxides, LPO)含量；过硼酸钠滴定法测定红细胞过氧化氢酶(catalase, CAT)活性；光化学扩增法测定红细胞SOD活性；5,5′-二硫对硝基苯[5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), DTNB]直接法测定红细胞谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性测定。
, http://www.100md.com 1.6 全血粘度的测定
取1.5 ml抗凝血测定其不同的切变率(1、5、50、100 s-1)下的全血粘度ηa。
1.7 统计学处理
所有数据均用
±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠免疫功能的影响(表1、2)
表1 天年安对老年小鼠IL-1产生的影响(±s)
Table 1 Effect of TNA on the production of IL-1 in old mice(±s)
, http://www.100md.com
A/Bq Group
n
φB
1∶5
1∶10
1∶20
1∶40
Young control
7
195±30
186±46
208±62
, 百拇医药 167±45
Old control
7
42±10***
71±22***
78±21***
79±24***
Old TNA
6
96±9＃＃＃
147±13＃＃＃
, http://www.100md.com
173±37＃＃＃
123±23＃＃*
*P<0.05, ***P<0.001, compared with young control; ＃＃P<0.01, ＃＃＃P<0.001, compared with old control.表2 天年安对老年小鼠IL-2产生的影响(±s)
Table 2 Effect of TNA on the production of IL-2 in old mice(±s)
A/Bq Group
, 百拇医药
n
φB
1∶2
1∶4
1∶8
Young control
7
541±112
357±77
203±74
Old control
7
, 百拇医药 274±57***
215±51**
138±32
Old TNA
8
437±86＃＃＃
296±111
197±88
**P<0.01 ***P<0.001， compared with young control ;＃＃＃P<0.001， compared with old control. 老年小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1及脾淋巴细胞产生IL-2的能力显著低于青年小鼠。给药后，老年小鼠IL-1的生成水平在各个稀释度均可显著提高，而IL-2仅在1∶2(体积比)的稀释度时最为明显，见表2。
, 百拇医药
2.2 补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠自由基代谢的影响(表3、4)
表3 天年安对老年小鼠红细胞GSH-Px、SOD及CAT产生的影响(±s)
Table 3 Effect of TNA on the production of SOD、CAT and GSH-Px in erythrocytes of old mice(±s) Group
n
CAT(U)
n
m(SDD)/μg
, 百拇医药
n
GSH-Px(U)
Young control
7
2.44±0.05
6
1 057±78
7
10.9±0.6
Old control
8
1.96±0.05***
, 百拇医药
8
801±40***
6
9.2±0.4***
Old TNA
8
2.20±0.05＃＃＃
8
1 125±36＃＃＃
8
14.3±0.9＃＃＃***
, 百拇医药
***P<0.001， compared with young control ;＃＃＃P<0.001， compared with old control.表4 天年安对老年小鼠肝脑LPO产生的影响(±s)
Table 4 Effect of TNA on the production of LPO in liver and brain of old mice (±s)
υ(LPO)/nmol Group
n
liver
n
, 百拇医药
brain
Young control
6
189±11
6
194±11
Old control
7
242±10***
8
241±6***
Old TNA
, 百拇医药
8
109±10＃＃＃***
8
107±8＃＃＃***
***P<0.001， compared with young control;＃＃＃P<0.001， compared with old control. 由表3、4可看出：老年小鼠红细胞产生GSH-Px、SOD及CAT的能力明显降低, 其肝、脑LPO的产生显著增加，与青年小鼠相比均有显著性差异。给药后，SOD、GSH-Px及CAT均明显提高，其中对GSH-Px的作用高于青年对照组；而LPO的产生则明显降低，甚至低于青年对照组。
2.3 补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠全血粘度的影响(表5)
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老年小鼠在各个切变率下，全血粘度均有所增加，其中在1、50及100 s-1切变率下和青年小鼠相比有显著性差异。给药后，在各个切变率下均能降低老年小鼠的全血粘度，且在低切变率(1、5 s-1)下，甚至低于青年对照组。
表5 天年安对老年小鼠全血粘度的影响(±s)
Table 5 Effect of TNA on the whole blood viscosity in old mice(±s) Group
n
1 s-1
, 百拇医药
5 s-1
50 s-1
100 s-1
Young control
6
10.42±0.53
8.12±0.29
4.49±0.13
3.87±0.11
Old control
4
, 百拇医药
13.11±1.22**
8.48±0.62
5.26±0.27***
4.63±0.25***
Old TNA
5
8.78±0.54＃＃＃***
7.34±0.59＃*
4.43±0.07＃＃＃
3.91±0.08＃＃＃
, 百拇医药
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with young control; ＃P<0.05, ＃＃＃P<0.001, compared with old control.
3 讨论
近来不少学者认为，“虚-瘀-衰老”密切相关。根据流行病学调查、临床观察及实验研究，我们认为老年机体确多存在脾肾两虚及痰浊血瘀的“体质”。脾肾两虚(正虚)挟瘀可能更接近于衰老本质，而补肾健脾化瘀法可能是理想的抗老方法。
在现代医学众多衰老学说中，衰老的免疫学理论占有重要的地位。随着年龄的增长，老年机体的免疫功能逐渐呈现低下/紊乱的表现，这也就是为什么老年机体易患感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的原因之一。在免疫衰老的过程中，T细胞的受损最为明显。大量研究表明，老年个体T细胞对有丝分裂原刺激的增殖反应能力明显下降，究其原因除了产生IL-2的CD4+CD45RA+naiveT细胞的减少外[4]，其本身产生IL-2的能力亦下降[5]。因此，目前对T细胞分泌的、对多种免疫细胞具有活化、增强作用的IL-2的研究越来越多，以至被认为是免疫衰老的主要分子机制之一。本实验结果亦证实，老年小鼠脾淋巴细胞IL-2的产生确实明显低于青年小鼠，给补肾健脾化瘀天年安后可显著促进其IL-2的产生。
, 百拇医药
除了老年机体本身T细胞功能受损，致使IL-2的产生降低外，是否还与其它因素有关,如IL-1。IL-1可由体内大部分细胞产生，尤以单核巨噬细胞为主。它具有广泛的生物学活性，除能作用于免疫细胞，诱导其活化、增殖及分化外，也能刺激骨髓和其它细胞而促进造血。有报道认为，老年机体IL-2产生能力降低的部分原因可能受到IL-1的影响，即由于IL-1产生减少，导致其刺激T细胞表面表达IL-2R及T细胞产生IL-2的能力下降。有研究证明，CD4细胞产生IL-2时必须有IL-1的存在。本实验结果也证实老年小鼠腹腔巨噬细胞IL-1的产生确有下降，给药后在显著提高IL-1产生的同时也增强了IL-2的产生。因此，推测本方药在增强IL-2产生的同时可能确与其促进巨噬细胞产生IL-1有关。
其次是自由基的影响。随着年龄的增长，机体代谢功能下降，其中自由基清除系统功能减弱，自由基产生增多是导致衰老的主要环节之一，而免疫衰老可能与此有密切关系。Chaudhri等[6，7]证明，自由基可作为阳性介质直接参与T淋巴细胞的激活，低浓度的H2O2与脾淋巴细胞共同培养可直接促进其IL-2的分泌，高浓度时则产生抑制作用。对O.-2的研究也有类似的结论，而且O.-2还可诱导单核巨噬细胞产生IL-1样的因子。陈丰等[8]证明无论体内还是体外，健脾补肾化瘀方药均可恢复自由基(臭氧及H2O2)对小鼠淋巴细胞IL-2的产生。本实验结果也证实老年小鼠确实存在自由基代谢紊乱的表现，即抗氧化酶系统SOD、CAT及GSH-Px含量减少，而自由基的代谢产物--脂质过氧化在肝脑明显增加，给药后则可得到纠正。因此，健脾补肾化瘀方药增强IL-2的产生的另一途径可能与其改善老年机体自由基代谢有关。
, 百拇医药
此外，现代医学研究还发现，随着年龄的增长，老年个体患心脑血管疾病的比率不断增加，以至有人认为，“瘀血-疾病-衰老”模式应是最常见的衰老模式。大量实验证明，老年机体在血液流变学、血液动力学及微循环等多方面均有明显改变。本实验结果亦显示，老年小鼠确有血液流变学的改变，在各个切变率下，全血粘度均有所增加，给药后可全面降低老年小鼠的全血粘度，而且在1、5 s-1的低切变率还优于青年对照组。说明健脾补肾化瘀方药还可能通过改善血液流变性或通过改善体内的微环境进而改善免疫细胞受体表达增强免疫细胞活性而达到延缓衰老的目的。
老年机体IL-2产生的降低除了T淋巴细胞本身的原因外，还与巨噬细胞、自由基代谢等有关。健脾补肾化瘀法可全面调整/恢复其紊乱或低下的功能，说明老年机体确“虚”和“瘀”并存，即多属“正虚挟瘀”。补肾健脾化瘀对免疫衰老等多方面的调整/恢复作用也进一步为衰老的“正虚挟瘀”观点提供了实验依据。
注：☆ 自由词。
, 百拇医药
参考文献
1 李顺成，蒋文跃，王传社，等. 正虚挟瘀是衰老的主要机制. 中国医药学报，1992,7(6):324-327
2 丁桂凤，尚红生，徐 晗，等. 单核因子的研究. 中国免疫学杂志， 1986,2(6):336-339
3 Andersson J, Gronvik KO, Larsson EL, et al. Studies on T lymphocyte activation. Eur J Immunol， 1979,9:581-587
4 Utsuyama M, Hirokawa K, Kurashima C, et al. Differential age-change in the number of CD4+29+ T cell subsets in the peripheral blood. Mech Ageing Dev, 1992,63:57-68
, http://www.100md.com
5 段震锋. 老年人白细胞介素2及其受体的研究. 中华老年医学杂志， 1993,(3):165-167
6 Chaudhric G, Clark IA, Hunt NH, et al. Effect of antioxidants on primary alloantigen induced Tcall activation and proliferation. J Immunol, 1986,137(8):2 646-2 652
7 胡四海，郭实士. 氧自由基对体外小鼠脾细胞产生IL-2的影响及机理初探. 中国实验临床免疫学杂志， 1995,7(5):10-13
8 陈 丰,李顺成. 补肾化瘀及补肾健脾化瘀调整小鼠免疫衰老的对比研究. 中国医药学报， 1997,12(2):5-10
(1999-10-29收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学中西医结合教研室，北京 100083
关键词：衰老；药物作用；自由基；代谢；免疫活性；药物作用；血液粘度；药物作用；补肾健脾化阏方药☆
北京医科大学学报990517 摘 要 目的：为验证“正虚挟瘀”是中医衰老的重要原因/机制的可靠性及合理性，观察了补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠免疫功能、自由基代谢及全血粘度的影响。方法：老年小鼠连续4周灌服天年安后，检测腹腔巨噬细胞产生的白细胞介素1( interleukin-1, IL-1)、脾淋巴细胞产生的白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)的活性、全血粘度的变化、肝脑的脂质过氧化(lipid peroxides, LPO)含量以及红细胞清除自由基酶的活性，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)。结果：老年小鼠IL-1、IL-2的产生以及SOD、CAT、GSH-Px均明显低于青年小鼠，而肝脑产生的LPO及全血粘度则明显增加。给药后，上述指标均可明显得到改善。结论：说明老年机体确“虚”和“瘀”并存，进一步为我们的观点提供了实验依据；同时也说明IL-2的产生能力降低除与T细胞本身有关外，还与巨噬细胞、自由基代谢等因素有关。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R255.7-332
Study on the effects of kidney-supplementing spleen-invigorating stasis-removing recipe on immune function, free radical metabolism and whole blood viscosity in old mice
LI Zhi-Xin， WANG Chuan-She， LI Shun-Cheng
(Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Beijing Medical University， Beijing 100083)
MeSH Aging/drug eff Free radicals/metab Immunocompetence/drug eff Blood viscosity/drug eff kidney-supplementing spleen-invigorating stasis-removing recipe☆
, 百拇医药
ABSTRACT Objective： In order to verify the reliability and reasonability of the theory that“deficiency of ZhengQi complicated with blood stasis” is the main cause/mechanism of aging. The effect of TianNianAn(TNA), a recipe of the kidney-supplementing spleen-invigorating blood stasis-removing on immune function 、free radical metabolism and whole blood viscosity in old mice was studied. Methods： After old mice were medicated with TNA for 4 weeks, interleukin-2(IL-2) production of splenic lymphocytes, interleukin-1(IL-1) production of peritoneal macrophages, SOD, CAT and glutathione peroxidase(GSH-Px) activities in erythrocytes, LPO contents in liver ( brain and the whole blood viscosity were detected. Results： The activities of IL-1， IL-2， SOD， CAT and GSH-Px in old mice were significantly lower than those in the young mice, and LPO contents in liver and brain and the whole blood viscosity were higher. After medication of TNA, the above-mentioned indices were obviously improved. Conclusion： The old organism really exists the constitution of “deficiency” and “stasis”, and further provides an experimental basis for our viewpoint. Meanwhile the decrease of IL-2 production was closely related with the function of macrophage and free radical metabolism, besides lower function of T lymphocyte.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:442-445)
当前，中医有关衰老的原因/机制尚无定论，但普遍认为“肾虚是中医衰老的主要原因/机制之一”。然而，中医还认为“肾为先天之本，脾为后天之本”、“先天生后天，后天养先天”，故脾胃不足亦是导致肾虚、进而促进衰老的重要因素。但虚久必瘀、瘀又加重虚，虚与瘀互为因果共同促进衰老进程。根据中西医衰老理论、临床实践及实验研究，我们提出了“正虚挟瘀(肾阴阳两虚、脾气虚挟瘀)是中医衰老的主要原因/机制，补肾健脾化瘀是延缓衰老的重要途径”的论点[1]，为了验证上述观点，我们观察了补肾健脾化瘀法对老年小鼠免疫分子白细胞介素1(interleukin-1, IL-1)和白细胞介素2(interleukin, IL-2)的产生、自由基代谢及全血粘度的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
, http://www.100md.com
C57BL/6健康雄性小鼠, 由北京医科大学实验动物部提供，本室饲养至老年(20月龄)，青年鼠为3月龄；实验分成3组，即青年对照组、老年对照组、老年天年安组。
1.2 中药
补肾健脾化瘀天年安主要由枸杞子、薏米、红花等组成，所用中药饮片均购自北京同仁堂药店， 并经过鉴定。 该方水煎2次，合并滤液，浓缩1.5 kg.L-1。灌胃给药，每天每只0.6 ml，持续4周，对照组喂同等量的自来水。
1.3 试剂
Hank's液: 临用前加50 ml.L-1灭活的新鲜小牛血清(new calf serum, NCS)及青链霉素各1万单位。 完全RPMI-1640培养液(GIBCO): 用前加入100 ml.L-1 NCS、1.00×105 u.L-1青霉素、100 mg.L-1链霉素、5×10-5 mol.L-1的2-巯基乙醇、367 mg.L-1 L-谷氨酰胺。刀豆素A(concanavalin A, ConA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 由Sigma公司生产。吲哚美辛购自北京医科大学实验药厂。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymodine, 3 H-TdR) 中国上海科学院原子核能研究所生产。闪烁液: 称取2,5-二硝基恶唑(2,5-diphenyloxazole, PPO, 美国MERK药厂) 2.5g、1，4-双(5-苯基恶唑-2)-苯[1,4-bis(5-phenyloxazoyl-2)benzene, POPOP](上海试剂一厂)0.25 g溶于500 ml二甲苯中。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)标准品购自中科院上海生物化学研究所，联大茴香胺购自Fluka AG CH-9470 Bucks，硫代巴比妥酸购自中国上海试剂二厂。
, 百拇医药
1.4 淋巴因子产生及测定方法
(1)IL-1上清: 腹腔巨噬细胞2×106 ml-1、加LPS(终质量浓度10 mg.L-1)和吲哚美辛(终浓度10 mol.L-1), 培养48 h后收集上清，检测参照文献[2]；(2)IL-2的产生及检测: 参考Andersson法[3]。淋巴母细胞的制备: 3月龄小鼠, 脾细胞悬液5×106 ml-1, 同时加ConA(终浓度7 mg.L-1), 培养72 h。IL-2上清的检测: 将上述淋巴母细胞配成2×106 ml-1,放入96孔板中，每孔0.1 ml(待测IL-2上清已倍比稀释于此板中，每分闪烁数0.1 ml)。培养24 h, 收集前6 h加入3H-TdR每孔20 μg(3.7×1011 Bq.L-1), 收集细胞, 液闪检测每分闪烁数(cpm)值。
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1.5 自由基指标的检测
小鼠摘眼球取血，肝素抗凝，冰水中保存备用。断头处死动物，迅速取出约0.3 g肝组织并剥取全脑，用冷生理盐水制成100 mg.L-1组织匀浆，冰水中保存备用。同时迅速准确称取(25±5) mg肝组织，放入1 ml冷乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)三氯乙酸液中保存备用。采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)比色法测定肝、脑脂质过氧化(lipid peroxides, LPO)含量；过硼酸钠滴定法测定红细胞过氧化氢酶(catalase, CAT)活性；光化学扩增法测定红细胞SOD活性；5,5′-二硫对硝基苯[5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), DTNB]直接法测定红细胞谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性测定。
, http://www.100md.com 1.6 全血粘度的测定
取1.5 ml抗凝血测定其不同的切变率(1、5、50、100 s-1)下的全血粘度ηa。
1.7 统计学处理
所有数据均用
±s表示，组间比较采用t检验。2 结果
2.1 补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠免疫功能的影响(表1、2)
表1 天年安对老年小鼠IL-1产生的影响(
±s)Table 1 Effect of TNA on the production of IL-1 in old mice(
±s), http://www.100md.com
A/Bq Group
n
φB
1∶5
1∶10
1∶20
1∶40
Young control
7
195±30
186±46
208±62
, 百拇医药 167±45
Old control
7
42±10***
71±22***
78±21***
79±24***
Old TNA
6
96±9＃＃＃
147±13＃＃＃
, http://www.100md.com
173±37＃＃＃
123±23＃＃*
*P<0.05, ***P<0.001, compared with young control; ＃＃P<0.01, ＃＃＃P<0.001, compared with old control.表2 天年安对老年小鼠IL-2产生的影响(
±s)Table 2 Effect of TNA on the production of IL-2 in old mice(
±s)A/Bq Group
, 百拇医药
n
φB
1∶2
1∶4
1∶8
Young control
7
541±112
357±77
203±74
Old control
7
, 百拇医药 274±57***
215±51**
138±32
Old TNA
8
437±86＃＃＃
296±111
197±88
**P<0.01 ***P<0.001， compared with young control ;＃＃＃P<0.001， compared with old control. 老年小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1及脾淋巴细胞产生IL-2的能力显著低于青年小鼠。给药后，老年小鼠IL-1的生成水平在各个稀释度均可显著提高，而IL-2仅在1∶2(体积比)的稀释度时最为明显，见表2。
, 百拇医药
2.2 补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠自由基代谢的影响(表3、4)
表3 天年安对老年小鼠红细胞GSH-Px、SOD及CAT产生的影响(
±s)Table 3 Effect of TNA on the production of SOD、CAT and GSH-Px in erythrocytes of old mice(
±s) Groupn
CAT(U)
n
m(SDD)/μg
, 百拇医药
n
GSH-Px(U)
Young control
7
2.44±0.05
6
1 057±78
7
10.9±0.6
Old control
8
1.96±0.05***
, 百拇医药
8
801±40***
6
9.2±0.4***
Old TNA
8
2.20±0.05＃＃＃
8
1 125±36＃＃＃
8
14.3±0.9＃＃＃***
, 百拇医药
***P<0.001， compared with young control ;＃＃＃P<0.001， compared with old control.表4 天年安对老年小鼠肝脑LPO产生的影响(
±s)Table 4 Effect of TNA on the production of LPO in liver and brain of old mice (
±s)υ(LPO)/nmol Group
n
liver
n
, 百拇医药
brain
Young control
6
189±11
6
194±11
Old control
7
242±10***
8
241±6***
Old TNA
, 百拇医药
8
109±10＃＃＃***
8
107±8＃＃＃***
***P<0.001， compared with young control;＃＃＃P<0.001， compared with old control. 由表3、4可看出：老年小鼠红细胞产生GSH-Px、SOD及CAT的能力明显降低, 其肝、脑LPO的产生显著增加，与青年小鼠相比均有显著性差异。给药后，SOD、GSH-Px及CAT均明显提高，其中对GSH-Px的作用高于青年对照组；而LPO的产生则明显降低，甚至低于青年对照组。
2.3 补肾健脾化瘀天年安对老年小鼠全血粘度的影响(表5)
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老年小鼠在各个切变率下，全血粘度均有所增加，其中在1、50及100 s-1切变率下和青年小鼠相比有显著性差异。给药后，在各个切变率下均能降低老年小鼠的全血粘度，且在低切变率(1、5 s-1)下，甚至低于青年对照组。
表5 天年安对老年小鼠全血粘度的影响(
±s)Table 5 Effect of TNA on the whole blood viscosity in old mice(
±s) Groupn
1 s-1
, 百拇医药
5 s-1
50 s-1
100 s-1
Young control
6
10.42±0.53
8.12±0.29
4.49±0.13
3.87±0.11
Old control
4
, 百拇医药
13.11±1.22**
8.48±0.62
5.26±0.27***
4.63±0.25***
Old TNA
5
8.78±0.54＃＃＃***
7.34±0.59＃*
4.43±0.07＃＃＃
3.91±0.08＃＃＃
, 百拇医药
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with young control; ＃P<0.05, ＃＃＃P<0.001, compared with old control.
3 讨论
近来不少学者认为，“虚-瘀-衰老”密切相关。根据流行病学调查、临床观察及实验研究，我们认为老年机体确多存在脾肾两虚及痰浊血瘀的“体质”。脾肾两虚(正虚)挟瘀可能更接近于衰老本质，而补肾健脾化瘀法可能是理想的抗老方法。
在现代医学众多衰老学说中，衰老的免疫学理论占有重要的地位。随着年龄的增长，老年机体的免疫功能逐渐呈现低下/紊乱的表现，这也就是为什么老年机体易患感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的原因之一。在免疫衰老的过程中，T细胞的受损最为明显。大量研究表明，老年个体T细胞对有丝分裂原刺激的增殖反应能力明显下降，究其原因除了产生IL-2的CD4+CD45RA+naiveT细胞的减少外[4]，其本身产生IL-2的能力亦下降[5]。因此，目前对T细胞分泌的、对多种免疫细胞具有活化、增强作用的IL-2的研究越来越多，以至被认为是免疫衰老的主要分子机制之一。本实验结果亦证实，老年小鼠脾淋巴细胞IL-2的产生确实明显低于青年小鼠，给补肾健脾化瘀天年安后可显著促进其IL-2的产生。
, 百拇医药
除了老年机体本身T细胞功能受损，致使IL-2的产生降低外，是否还与其它因素有关,如IL-1。IL-1可由体内大部分细胞产生，尤以单核巨噬细胞为主。它具有广泛的生物学活性，除能作用于免疫细胞，诱导其活化、增殖及分化外，也能刺激骨髓和其它细胞而促进造血。有报道认为，老年机体IL-2产生能力降低的部分原因可能受到IL-1的影响，即由于IL-1产生减少，导致其刺激T细胞表面表达IL-2R及T细胞产生IL-2的能力下降。有研究证明，CD4细胞产生IL-2时必须有IL-1的存在。本实验结果也证实老年小鼠腹腔巨噬细胞IL-1的产生确有下降，给药后在显著提高IL-1产生的同时也增强了IL-2的产生。因此，推测本方药在增强IL-2产生的同时可能确与其促进巨噬细胞产生IL-1有关。
其次是自由基的影响。随着年龄的增长，机体代谢功能下降，其中自由基清除系统功能减弱，自由基产生增多是导致衰老的主要环节之一，而免疫衰老可能与此有密切关系。Chaudhri等[6，7]证明，自由基可作为阳性介质直接参与T淋巴细胞的激活，低浓度的H2O2与脾淋巴细胞共同培养可直接促进其IL-2的分泌，高浓度时则产生抑制作用。对O.-2的研究也有类似的结论，而且O.-2还可诱导单核巨噬细胞产生IL-1样的因子。陈丰等[8]证明无论体内还是体外，健脾补肾化瘀方药均可恢复自由基(臭氧及H2O2)对小鼠淋巴细胞IL-2的产生。本实验结果也证实老年小鼠确实存在自由基代谢紊乱的表现，即抗氧化酶系统SOD、CAT及GSH-Px含量减少，而自由基的代谢产物--脂质过氧化在肝脑明显增加，给药后则可得到纠正。因此，健脾补肾化瘀方药增强IL-2的产生的另一途径可能与其改善老年机体自由基代谢有关。
, 百拇医药
此外，现代医学研究还发现，随着年龄的增长，老年个体患心脑血管疾病的比率不断增加，以至有人认为，“瘀血-疾病-衰老”模式应是最常见的衰老模式。大量实验证明，老年机体在血液流变学、血液动力学及微循环等多方面均有明显改变。本实验结果亦显示，老年小鼠确有血液流变学的改变，在各个切变率下，全血粘度均有所增加，给药后可全面降低老年小鼠的全血粘度，而且在1、5 s-1的低切变率还优于青年对照组。说明健脾补肾化瘀方药还可能通过改善血液流变性或通过改善体内的微环境进而改善免疫细胞受体表达增强免疫细胞活性而达到延缓衰老的目的。
老年机体IL-2产生的降低除了T淋巴细胞本身的原因外，还与巨噬细胞、自由基代谢等有关。健脾补肾化瘀法可全面调整/恢复其紊乱或低下的功能，说明老年机体确“虚”和“瘀”并存，即多属“正虚挟瘀”。补肾健脾化瘀对免疫衰老等多方面的调整/恢复作用也进一步为衰老的“正虚挟瘀”观点提供了实验依据。
注：☆ 自由词。
, 百拇医药
参考文献
1 李顺成，蒋文跃，王传社，等. 正虚挟瘀是衰老的主要机制. 中国医药学报，1992,7(6):324-327
2 丁桂凤，尚红生，徐 晗，等. 单核因子的研究. 中国免疫学杂志， 1986,2(6):336-339
3 Andersson J, Gronvik KO, Larsson EL, et al. Studies on T lymphocyte activation. Eur J Immunol， 1979,9:581-587
4 Utsuyama M, Hirokawa K, Kurashima C, et al. Differential age-change in the number of CD4+29+ T cell subsets in the peripheral blood. Mech Ageing Dev, 1992,63:57-68
, http://www.100md.com
5 段震锋. 老年人白细胞介素2及其受体的研究. 中华老年医学杂志， 1993,(3):165-167
6 Chaudhric G, Clark IA, Hunt NH, et al. Effect of antioxidants on primary alloantigen induced Tcall activation and proliferation. J Immunol, 1986,137(8):2 646-2 652
7 胡四海，郭实士. 氧自由基对体外小鼠脾细胞产生IL-2的影响及机理初探. 中国实验临床免疫学杂志， 1995,7(5):10-13
8 陈 丰,李顺成. 补肾化瘀及补肾健脾化瘀调整小鼠免疫衰老的对比研究. 中国医药学报， 1997,12(2):5-10
(1999-10-29收稿), http://www.100md.com