动脉粥样硬化血管平滑肌细胞中干细胞因子mRNA的表达水平增加
作者：张放鸣 周建新 李渝萍
单位：张放鸣：第三军医大学 细胞生物学教研室1 生物化学教研室；周建新 李渝萍：重庆400038
关键词：干细胞因子；血管平滑肌细胞；基因表达
高血压杂志990428
摘要 目的:分析比较干细胞因子(SCF)、TGF-α及某些膜蛋白、核蛋白基因在不同病理状态下血管平滑肌细胞中的表达水平，探讨这些基因产物在动脉粥样硬化及高血压发病过程中所起的作用。
方法:从维生素D3诱导动脉粥样硬化和一侧肾动脉结扎的高血压大鼠取出主动脉，在体外培养收集血管平滑肌细胞，抽提细胞总RNA，以同位素标 记的核酸探针作Northern blot分析。
结果：动脉粥样硬化及高血压血管平滑肌细胞中干细胞因子mRNA表达比正常时高出许多倍，TGFα在高血压血管平滑肌细胞中有较高表达，而erbB2表达无明显变化。
, 百拇医药
结论：生长因子在血管的损伤修复中起重要作用，实验提示SCF 参与了动脉粥样硬化和高血压时动脉平滑肌细胞的增殖调控过程，可能通过干细胞因子这一系统参与血管损伤修复。 这是干细胞因子除影响造血细胞等增殖外的又一重要功能。
要点：从动脉粥样硬化和肾性高血压大鼠的主动脉细胞培养中检测到干细胞因子(SCF)，TGF-α的mRNA表达异常增高，说明生长因子及干细胞因子(过去认为只和血细胞的增殖有关)在细胞增殖中的作用。还发现细胞膜受体erbB2基因的表达基本稳定。
中图分类号：R331;Q753;Q7 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0363-03
Increased Expression of Stem Cell Factor Gene in Atherosclerotic Vascular Smooth Muscle Cells
, 百拇医药
ZHANG Fangming1 ZHOU Jianxin2, LI Yuping2
(1. Cell Biology Department1,Biochemistry Department;2. Third Military Medical College)
ABSTRACT Aim:To explore factors influencing on atherosclerotic and hypertension progression,the mRNA expression levels of stem cell factor(SCF),transform growth factor-α(TGFα),some membrane proteins and nuclear proteins of vascular smooth muscle cells(VSMCs)in different pathologic conditions were analysed.
, 百拇医药
Methods:Atherosclerosis of rat was induced by vitamin D3 and hypertension model was prepared by patially obstraction of left renal artery. Total RNA were extracted from cultured vascular smooth muscle cells and analysed with Northern blot.
Results:The high level expression of two type of SCF mRNA and incremental TGF α mRNA were found in atherosclerotic and hypertensive vascular smooth muscle cells.
Conclusion:Growth factors play an important role in the repair of blood vessel. It is suggested that SCF involved the proliferation control of VSMCs in the atherosclerosis and hypertension by SCF pathway.
, 百拇医药
Key Words:stem cell factor;vascular smooth muscle cell;gene expression
动脉粥样硬化(AS)与钙、胆固醇代谢的关系已有很多研究[1,2]，但对这类疾病中所涉及的基因表达异常仍了解不多。目前较清楚的是家族性高脂血症所导致的动脉粥样硬化，其遗传背景估计与某些基因结构及其表达异常有关，动脉粥样硬化和高血压都有一个慢性发病过程，其间可能有许多基因的表达发生变化，其中某些基因的表达对血管疾病的发生可能起决定性的作用。了解这些过程中哪些基因的表达起了作用，可为这类疾病的防治提供新的认识。为此我们分离培养了维生素D3诱发大鼠动脉粥样硬化和结扎一侧肾动脉所致高血压的血管平滑肌细胞，分析比较这些细胞中SCF、TGFα、PCNA等基因的mRNA表达水平，以确定这些基因产物对心血管疾病的影响。
MATERALS AND METHODS
, http://www.100md.com
1 材料：α-32P-dCTP,γ-32P-dATP北京亚辉公司产品。随机引物标记试剂盒、3' 端寡核苷酸标记试剂盒和带正电荷尼龙膜均购自宝灵曼公司。异硫氰酸胍为GIBCO公司产品。干细胞因子探针为本实验室用RT-PCR获得人SCF的cDNA，经测序证实。探针erbB2来自质粒pSVneu，TGFα、PCNA等均系合成的寡核苷酸探针。 大片段的探针用随机引物法标记，合成的寡核苷酸探针用末端标记法。
2 实验动物模型：用健康雄性Wistar成年大鼠15只作实验动物，随机分为正常、高血压和AS三组：(a)高血压大鼠模型：无菌下结扎左肾动脉，手术前后测血压对照，术后4周左右取材，取材时用生理二道仪从颈动脉插管测动脉压，若血压高于19 kPa， 则确定为高血压大鼠模型;(b)AS动物模型：无菌下腹腔注射维生素D3(60万单位/kg)，4周后取材。取材时肉眼见主动脉有粥样硬化斑块者或经切片镜下见动脉壁有粥样硬化病灶者，确定为AS大鼠模型;(3)动脉血管平滑肌细胞的培养:将正常、AS和高血压大鼠击头致死，无菌下取出主动脉全长，在PBS 内小心去除外膜后，纵行将血管剖开，用含1%胶元酶Ⅱ的无血清DMEM-F12培养基37℃消化30 min(去除主动脉内皮细胞和外膜的成纤维细胞)后，将血管片剪成1 mm2左右的小段后放入培养瓶，加入含有20%胎牛血清的DMEM-F12培养基，置5%CO2，37℃的二氧化碳培养箱中培养，待血管平滑肌细胞长出后，去掉组织块，细胞传至第二代后，收集细胞用于实验。
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4 总RNA抽提和Northern blot分析：总RNA的纯化用异硫氰酸胍一步法进行[3]，纯化的RNA溶于水，测定OD260浓度。用0.9%琼脂糖甲醛变性胶按标准条件进行RNA 电泳，每孔加RNA 20 μg,RNA转移至带正电荷的尼龙膜上后，紫外线固定10 分钟， 杂交液含50%甲酰胺，杂交温度按各探针的Tm估计约低15℃。洗涤后对膜的X光片曝光。
RESULTS
1 动脉粥样硬化和高血压血管平滑肌细胞中干细胞因子的表达水平增加
RNA印渍杂交实验表明：与正常大鼠主动脉相比， 动脉粥样硬化和高血压血管平滑肌细胞中干细胞因子(SCF)的表达水平增加(图1)。 本实验采用的是人的膜结合型干细胞因子cDNA探针，杂交证实血管平滑肌细胞中有分子量不同的两类干细胞因子的mRNA，其大小分别约为4 kb和1 kb。膜受体erbB2基因表达水平稳定，各组间无明显差异， 这里与SCF水平分析用的是同一杂交膜上的RNA样品，同时也证实了RNA上样量的一致性。
, 百拇医药
Fig 1 mRNA expression of SCF and erb B2
A:SCF mRNA;B:erbB2 mRNA;N:nomal VSMCs;AS:atherosclerotic VSMCs;H：hypertensive VSMCs
2 实验还分别检测了转化生长因子α(TGFα)和增殖细胞核抗原(PCNA) 等基因在动脉粥样硬化和高血压大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达水平，从量上看高血压时TGFα表达水平较高,PCNA的表达水平在动脉粥样硬化和高血压时也有升高(图2)。
Fig 2 mRNA expression of SCF,TGFα and PCNA in VSMCs of atherosclerotic and hypertensive rats.
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A:TGFα mRNA;B:PCNA mRNA;N:nomal VSMCs;AS:atherosclerotic VSMCs;H:hypertensive VSMCs;SHR:spontaneous hypertensive rat
DISCUSSION
干细胞因子(SCF)对造血系统的细胞有很强的生物活性， 能刺激血细胞的生成，使肥大细胞活化。近来有文献报道该因子在正常血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中有低水平表达[5,6]，炎症过程可促进血管内皮细胞中SCF上升。异常情况下血管平滑肌细胞中SCF的表达情况未见报道。 本研究发现在动脉粥样硬化和高血压大鼠血管平滑肌中SCF的表达水平显著升高，提示该因子在血管的损伤及修复过程中 起重要作用。此处也显示了同时比较动脉粥样硬化和高血压时VSMCs 基因表达谱的优点，如单独将AS或高血压与正常状态的VSMC比较，在发现SCF 表达增加时有可能误认为是与致病过程直接相关的，同时比较则证明，这种表达增加是在两种病理情况均可出现的现象。
, 百拇医药
实验证明在大鼠血管平滑肌细胞中存在有分子量不同的两类干细胞因子mRNA，其大小分别约为4 kb和1 kb，这是否为文献常提到游离型(可溶型)干细胞因子和膜结合型干细胞因子仍有待进一步研究。
本实验采用的动物模型是用过量维生素D3注射诱发的动脉粥样硬化大鼠，因维生素D3作为一种激素，可能影响基因的开放和关闭，因此维生素D3亦可能诱导SCF基因表达。本实验中采用的动脉粥样硬化血管细胞均来自维生素D3诱导的大鼠主动脉血管，在体外将血管平滑肌细胞培养至第二代开始实验，细胞培养基中没有加维生素D3，因此可以排除维生素D3对血管平滑肌细胞中干细胞生长因子基因的直接诱导作用。同理血压升高也不是刺激干细胞因子表达增加的直接因素。
干细胞因子与其受体c-Kit结合刺激细胞的增殖，因此， 在血管平滑肌细胞中应存在有一套完整的活化系统。有趣的是，这些血管平滑肌细胞经体外培养脱离了最初的原始刺激如高血压的作用之后，仍保留着表达高水平SCF的能力。
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其他一些基因的表达各不相同，erbB2的表达各组基本一致，没有受到什么影响，但TGF、PCNA的表达有差异。我们原推测动脉粥样硬化因细胞脂质代谢受到影响， 可能会影响膜受体基因表达，实验结果证明象erbB2这样的膜受体基因表达受影响很小，而生长因子基因的表达都出现明显改变[7]， 因此在血管疾病中应高度重视生长因子的作用。这些基因表达的变化说明在两种疾病状态下获得的VSMCs 已处于一种病态，且在短期内难以恢复，利用这些培养细胞进行的研究是有价值的。
REFERENCES
1 Chatelaiu P,et al. Vascular calcium overload produced by vitamin D3,in rats.Effect of treatment with SR 33805,a novel calcium entry blocker[J] Cardiovasc Res 1995;30(6):1038
, http://www.100md.com
2 Kang S.,et al:The retinoid X receptor agonist 9-cis-retinoic acid and the 24-hydroxylase inhibitor ketoconazde increase activity of 1.25-dinydroxy vitamin D3 in human skin in vivo[J] Invest Dermatol 1997;108(4):513
3 Chomczynski,P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J] Anal Biochem 1987；162:156
4 Sambrook J,et al. Molecular Cloning[M] second edi.Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989,7
, 百拇医药
5 Miyamoto T.,et al. Expression of stem cell factor in human aortic endothelial and smooth muscle cell[J] Atherosclerosis 1997；129(2):207
6 Konig A, et al. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cell by inflammatory stimuli[J] Blood 1997,90(1):148
7 Febb DC, et al. Transforming growth factorβ1 induces IL-1 receptor antagonist production and gene expression in rat vascular smooth muscle cells[J] Atherosclerosis
收稿日期：1999-04-06, http://www.100md.com
单位：张放鸣：第三军医大学 细胞生物学教研室1 生物化学教研室；周建新 李渝萍：重庆400038
关键词：干细胞因子；血管平滑肌细胞；基因表达
高血压杂志990428
摘要 目的:分析比较干细胞因子(SCF)、TGF-α及某些膜蛋白、核蛋白基因在不同病理状态下血管平滑肌细胞中的表达水平，探讨这些基因产物在动脉粥样硬化及高血压发病过程中所起的作用。
方法:从维生素D3诱导动脉粥样硬化和一侧肾动脉结扎的高血压大鼠取出主动脉，在体外培养收集血管平滑肌细胞，抽提细胞总RNA，以同位素标 记的核酸探针作Northern blot分析。
结果：动脉粥样硬化及高血压血管平滑肌细胞中干细胞因子mRNA表达比正常时高出许多倍，TGFα在高血压血管平滑肌细胞中有较高表达，而erbB2表达无明显变化。
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结论：生长因子在血管的损伤修复中起重要作用，实验提示SCF 参与了动脉粥样硬化和高血压时动脉平滑肌细胞的增殖调控过程，可能通过干细胞因子这一系统参与血管损伤修复。 这是干细胞因子除影响造血细胞等增殖外的又一重要功能。
要点：从动脉粥样硬化和肾性高血压大鼠的主动脉细胞培养中检测到干细胞因子(SCF)，TGF-α的mRNA表达异常增高，说明生长因子及干细胞因子(过去认为只和血细胞的增殖有关)在细胞增殖中的作用。还发现细胞膜受体erbB2基因的表达基本稳定。
中图分类号：R331;Q753;Q7 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0363-03
Increased Expression of Stem Cell Factor Gene in Atherosclerotic Vascular Smooth Muscle Cells
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ZHANG Fangming1 ZHOU Jianxin2, LI Yuping2
(1. Cell Biology Department1,Biochemistry Department;2. Third Military Medical College)
ABSTRACT Aim:To explore factors influencing on atherosclerotic and hypertension progression,the mRNA expression levels of stem cell factor(SCF),transform growth factor-α(TGFα),some membrane proteins and nuclear proteins of vascular smooth muscle cells(VSMCs)in different pathologic conditions were analysed.
, 百拇医药
Methods:Atherosclerosis of rat was induced by vitamin D3 and hypertension model was prepared by patially obstraction of left renal artery. Total RNA were extracted from cultured vascular smooth muscle cells and analysed with Northern blot.
Results:The high level expression of two type of SCF mRNA and incremental TGF α mRNA were found in atherosclerotic and hypertensive vascular smooth muscle cells.
Conclusion:Growth factors play an important role in the repair of blood vessel. It is suggested that SCF involved the proliferation control of VSMCs in the atherosclerosis and hypertension by SCF pathway.
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Key Words:stem cell factor;vascular smooth muscle cell;gene expression
动脉粥样硬化(AS)与钙、胆固醇代谢的关系已有很多研究[1,2]，但对这类疾病中所涉及的基因表达异常仍了解不多。目前较清楚的是家族性高脂血症所导致的动脉粥样硬化，其遗传背景估计与某些基因结构及其表达异常有关，动脉粥样硬化和高血压都有一个慢性发病过程，其间可能有许多基因的表达发生变化，其中某些基因的表达对血管疾病的发生可能起决定性的作用。了解这些过程中哪些基因的表达起了作用，可为这类疾病的防治提供新的认识。为此我们分离培养了维生素D3诱发大鼠动脉粥样硬化和结扎一侧肾动脉所致高血压的血管平滑肌细胞，分析比较这些细胞中SCF、TGFα、PCNA等基因的mRNA表达水平，以确定这些基因产物对心血管疾病的影响。
MATERALS AND METHODS
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1 材料：α-32P-dCTP,γ-32P-dATP北京亚辉公司产品。随机引物标记试剂盒、3' 端寡核苷酸标记试剂盒和带正电荷尼龙膜均购自宝灵曼公司。异硫氰酸胍为GIBCO公司产品。干细胞因子探针为本实验室用RT-PCR获得人SCF的cDNA，经测序证实。探针erbB2来自质粒pSVneu，TGFα、PCNA等均系合成的寡核苷酸探针。 大片段的探针用随机引物法标记，合成的寡核苷酸探针用末端标记法。
2 实验动物模型：用健康雄性Wistar成年大鼠15只作实验动物，随机分为正常、高血压和AS三组：(a)高血压大鼠模型：无菌下结扎左肾动脉，手术前后测血压对照，术后4周左右取材，取材时用生理二道仪从颈动脉插管测动脉压，若血压高于19 kPa， 则确定为高血压大鼠模型;(b)AS动物模型：无菌下腹腔注射维生素D3(60万单位/kg)，4周后取材。取材时肉眼见主动脉有粥样硬化斑块者或经切片镜下见动脉壁有粥样硬化病灶者，确定为AS大鼠模型;(3)动脉血管平滑肌细胞的培养:将正常、AS和高血压大鼠击头致死，无菌下取出主动脉全长，在PBS 内小心去除外膜后，纵行将血管剖开，用含1%胶元酶Ⅱ的无血清DMEM-F12培养基37℃消化30 min(去除主动脉内皮细胞和外膜的成纤维细胞)后，将血管片剪成1 mm2左右的小段后放入培养瓶，加入含有20%胎牛血清的DMEM-F12培养基，置5%CO2，37℃的二氧化碳培养箱中培养，待血管平滑肌细胞长出后，去掉组织块，细胞传至第二代后，收集细胞用于实验。
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4 总RNA抽提和Northern blot分析：总RNA的纯化用异硫氰酸胍一步法进行[3]，纯化的RNA溶于水，测定OD260浓度。用0.9%琼脂糖甲醛变性胶按标准条件进行RNA 电泳，每孔加RNA 20 μg,RNA转移至带正电荷的尼龙膜上后，紫外线固定10 分钟， 杂交液含50%甲酰胺，杂交温度按各探针的Tm估计约低15℃。洗涤后对膜的X光片曝光。
RESULTS
1 动脉粥样硬化和高血压血管平滑肌细胞中干细胞因子的表达水平增加
RNA印渍杂交实验表明：与正常大鼠主动脉相比， 动脉粥样硬化和高血压血管平滑肌细胞中干细胞因子(SCF)的表达水平增加(图1)。 本实验采用的是人的膜结合型干细胞因子cDNA探针，杂交证实血管平滑肌细胞中有分子量不同的两类干细胞因子的mRNA，其大小分别约为4 kb和1 kb。膜受体erbB2基因表达水平稳定，各组间无明显差异， 这里与SCF水平分析用的是同一杂交膜上的RNA样品，同时也证实了RNA上样量的一致性。
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Fig 1 mRNA expression of SCF and erb B2
A:SCF mRNA;B:erbB2 mRNA;N:nomal VSMCs;AS:atherosclerotic VSMCs;H：hypertensive VSMCs
2 实验还分别检测了转化生长因子α(TGFα)和增殖细胞核抗原(PCNA) 等基因在动脉粥样硬化和高血压大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达水平，从量上看高血压时TGFα表达水平较高,PCNA的表达水平在动脉粥样硬化和高血压时也有升高(图2)。
Fig 2 mRNA expression of SCF,TGFα and PCNA in VSMCs of atherosclerotic and hypertensive rats.
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A:TGFα mRNA;B:PCNA mRNA;N:nomal VSMCs;AS:atherosclerotic VSMCs;H:hypertensive VSMCs;SHR:spontaneous hypertensive rat
DISCUSSION
干细胞因子(SCF)对造血系统的细胞有很强的生物活性， 能刺激血细胞的生成，使肥大细胞活化。近来有文献报道该因子在正常血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中有低水平表达[5,6]，炎症过程可促进血管内皮细胞中SCF上升。异常情况下血管平滑肌细胞中SCF的表达情况未见报道。 本研究发现在动脉粥样硬化和高血压大鼠血管平滑肌中SCF的表达水平显著升高，提示该因子在血管的损伤及修复过程中 起重要作用。此处也显示了同时比较动脉粥样硬化和高血压时VSMCs 基因表达谱的优点，如单独将AS或高血压与正常状态的VSMC比较，在发现SCF 表达增加时有可能误认为是与致病过程直接相关的，同时比较则证明，这种表达增加是在两种病理情况均可出现的现象。
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实验证明在大鼠血管平滑肌细胞中存在有分子量不同的两类干细胞因子mRNA，其大小分别约为4 kb和1 kb，这是否为文献常提到游离型(可溶型)干细胞因子和膜结合型干细胞因子仍有待进一步研究。
本实验采用的动物模型是用过量维生素D3注射诱发的动脉粥样硬化大鼠，因维生素D3作为一种激素，可能影响基因的开放和关闭，因此维生素D3亦可能诱导SCF基因表达。本实验中采用的动脉粥样硬化血管细胞均来自维生素D3诱导的大鼠主动脉血管，在体外将血管平滑肌细胞培养至第二代开始实验，细胞培养基中没有加维生素D3，因此可以排除维生素D3对血管平滑肌细胞中干细胞生长因子基因的直接诱导作用。同理血压升高也不是刺激干细胞因子表达增加的直接因素。
干细胞因子与其受体c-Kit结合刺激细胞的增殖，因此， 在血管平滑肌细胞中应存在有一套完整的活化系统。有趣的是，这些血管平滑肌细胞经体外培养脱离了最初的原始刺激如高血压的作用之后，仍保留着表达高水平SCF的能力。
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其他一些基因的表达各不相同，erbB2的表达各组基本一致，没有受到什么影响，但TGF、PCNA的表达有差异。我们原推测动脉粥样硬化因细胞脂质代谢受到影响， 可能会影响膜受体基因表达，实验结果证明象erbB2这样的膜受体基因表达受影响很小，而生长因子基因的表达都出现明显改变[7]， 因此在血管疾病中应高度重视生长因子的作用。这些基因表达的变化说明在两种疾病状态下获得的VSMCs 已处于一种病态，且在短期内难以恢复，利用这些培养细胞进行的研究是有价值的。
REFERENCES
1 Chatelaiu P,et al. Vascular calcium overload produced by vitamin D3,in rats.Effect of treatment with SR 33805,a novel calcium entry blocker[J] Cardiovasc Res 1995;30(6):1038
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2 Kang S.,et al:The retinoid X receptor agonist 9-cis-retinoic acid and the 24-hydroxylase inhibitor ketoconazde increase activity of 1.25-dinydroxy vitamin D3 in human skin in vivo[J] Invest Dermatol 1997;108(4):513
3 Chomczynski,P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J] Anal Biochem 1987；162:156
4 Sambrook J,et al. Molecular Cloning[M] second edi.Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989,7
, 百拇医药
5 Miyamoto T.,et al. Expression of stem cell factor in human aortic endothelial and smooth muscle cell[J] Atherosclerosis 1997；129(2):207
6 Konig A, et al. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cell by inflammatory stimuli[J] Blood 1997,90(1):148
7 Febb DC, et al. Transforming growth factorβ1 induces IL-1 receptor antagonist production and gene expression in rat vascular smooth muscle cells[J] Atherosclerosis
收稿日期：1999-04-06, http://www.100md.com