LACA小鼠骨髓辐射损伤后干细胞因子受体表达的免疫组化研究
作者：彭瑞云 王德文 熊呈琦 李延平 高亚兵 汪宝珍 崔玉芳 杨 红 杨瑞彪 崔雪梅
单位：100850 北京，北京放射医学研究所
关键词：辐射；骨髓；细胞凋亡；C\|kit；免疫组化
中华放射医学与防护杂志980305.htm
目的 至今，尚未见到采用免疫组化技术研究骨髓辐射损伤后干细胞因子受体(C-kit)表达及其在造血重建中的意义。方法 本文经60Coγ射线全身照射IACA小鼠，于照射后4周内分批活杀动物，采用光镜、电镜及LSAB免疫组化方法，研究了辐射诱导的造血细胞凋亡信C\|kit的表达及意义。结果 全身照射LA\|CA小鼠时，5.5Gy为其亚致死剂量，此剂量照射小鼠可导致外周血白细胞及骨髓有核细胞减少；骨髓明显损伤及损伤后重建现象；在照后1天内可使骨髓造血细胞发生凋亡；5.5Gy照射后6小时，C\|kit蛋白于造血细胞浆内明显增多，呈强阳性；照后10天，骨髓造血细胞增生、恢复，C\|kit蛋白于造血细胞膜表达明显增多，呈强阳性。结论 C\|kit表达与造血功能重建有关，在早期造血功能重建中起重要调节作用。
, 百拇医药
Immunohistochemical studiews on expression of c\|kit in LACA mouse bone marrow after irradiation Peng Ruiyun,Wang Dewen,Xiong Chengqi,et al.Department of Experimental Pathology,Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.
Objective To study the expression and significance of c\|kit in irradiated bone marrow,Methods LACA mice were irradiated with 60Coγ\|rays,and sacrificed within 4 weeks,after irradiation.By means of light microscopy,electron microscopy and immunohistochemical method of LSAB,the authors studied radiation\|induced apoptosis of hemapoietic cells and the expression of c\|kit.Results A dose of 5.5Gy total body irradiation was a sublethal dose for LACA mouse,and induced decrease of WBC in blood and nucleated cells in bone marrow.The bone marrow was obviously injured and then reconstructed.C\|kit protein was strongly positive in cyto plasma of hematopoietic cells 6 hours after radiation,while it was strong positive at the membrane of hematopoietic cells 10 days after irradiation.Conclusion The hemopoietic cells developed apoptosis within 1 day after irradiation.The expression of c\|kit was related to the reconstruction of hematopoiesis,and played an important role in the early hematopoiesis.
, 百拇医药
Key words Radiation Bone marrow Apoptoisi c\|kit Immunohistochemistry
骨髓对射线极为敏感，在病理形态上，对骨髓辐射损伤进行了大量的研究，但大都采用经典的病理手段。迄今，尚水见到将免疫组织(细胞)化学技术应用到骨髓辐射损伤的病理上来。弄清造血生长因子受体的分布规律为造血生长因子的合理应用，阐明其机制开避一条新的途径。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与照射方法：LACA小鼠70只，体重16～20g，随机分为对照组20只及照射组50只。照射组动物采用60Coγ射线全身照射，剂量为5.5Gy，照射量率为91.1×10-4C*kg-1*min-1。
1.2 外周血白细胞及骨髓有核细胞计数：动物于照射后6小时，1，3，6，10，15，21天和4周，尾静脉采外周血进行白细胞计数，并将左股骨骨髓用生理盐水冲出，并进行有核细胞计数。
, 百拇医药
1.3 病理检查及凋亡细胞检测：将各时间点活杀动物骨髓入Helly's液及3%戊二醛、1%锇酸固定，分别制作石蜡切片及半簿切片，H*E染色；在光镜下观察其病理改变和凋亡的细胞。并将骨髓细胞涂片BFA(缓冲辐尔马林丙酮)液固定，-20℃保存备做免疫组化染色。
1.4 免疫组化染色(LSAB法)：染色方法参考梁英杰[1]等方法并进行改进。不同之处是将HRP\|SA改为AP\|SA,，显色剂用坚固红而不是DAB，甘油明胶封片。阳性结果为玫瑰红色。
2 结果
2.1 照射剂量与动物死亡的关系：照射后4周内对照组动物未见死亡，照射组动物仅见2例动物死亡，可见5.5Gy照射对LACA小鼠来说，为其亚致死剂量。
2.2 外周血白细胞及骨髓有核细胞的检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 5.5Gy照后4周内小鼠外周血白细胞及骨髓有核细胞变化 照后时间
(d)
白细胞
(×109/L)
骨髓有核细胞计数
(个/股骨)
对照组
13.1±2.2
463±0.1
6小时
7.6±2.3**
, 百拇医药
3.4±0.3*
1
4.1±0.9**
1.2±0.3**
3
1.8±0.5**
0.5±0.2**
6
1.7±0.7**
0.7±0.3**
, 百拇医药 10
2.2±0.8**
1.1±0.5**
15
4.1±1.9**
1.5±0.4**
21
7.8±3.3**
2.6±0.4**
4周
17.1±5.0**
, 百拇医药
4.1±0.9**
2.3 病理形态改变：在照后4周内骨髓出现明显损伤，并出现损伤后重建现象，将此过程分为造血细胞减少期、骨髓空虚期、再生恢复期和基本恢复期。照后6小时，造血细胞出现凋亡的典型改变：核浓缩、边移，呈半月形、环状、戒指状及不规则形，并见核碎裂，凋亡小体形成，或游离或被邻近细胞吞噬(图1)。
2.4 免疫组化染色结果：正常小鼠骨髓仅少数造血细胞浆内和胞膜，部分软骨细胞和成骨细胞内c\|kit蛋白阳性。5.5Gy照后6小时，c\|kit蛋白胞浆内阳性的造血细胞明显增多，呈强阳性；照后1～6天，成骨细胞及软骨细胞浆内c\|kit蛋白阳性的细胞明显增多；照后10天，c\|kit蛋白胞膜阳性的造血细胞明显增多(图2)，成骨细胞及软骨细胞浆内较6天时有所减少；照射15天后，c\|kit蛋白胞膜阳性的造血细胞逐渐减少，胞浆阳性的细胞逐渐增多，至照射后4周，c\|kit蛋白表达基本恢复至正常水平。
, 百拇医药
3 讨论
文献对骨髓辐射损伤后的病理改变已有诸多描述，但尚未见到辐射诱导骨髓造血细胞“凋亡”这一概念的提出。本文研究发现5.5Gy照后6小时，凋亡的造血细胞明显增多，并对其形态进行了较详尽地描述，比以往的病理研究前进了一步。
干细胞因子(SCF)又称肥大细胞生长因子(MGF)kit配体(KL)或steel因子(SF)，最初是Zsebo等[2]从Buffalo大鼠肝细胞系中cDNA克隆成功。在小鼠其基因位于第10号染色体SL位点，它主要由肝细胞产生，骨髓腔内的某些基质细胞如纤维样细胞、内皮细胞等亦表达SCF[3]。SCF具有多种生物学功能，在骨髓移植、造血功能障碍以及干细胞基因治疗中有潜在的应用价值。而SCF首先必须和其受体即c\|kit蛋白结合，才能发挥其生物学效应。
SCF受体即是C\|kit，在小鼠编码于5号染色体W位点[4]，如该位点发生突变，将会引起多潜能造血干细胞减少、贫血等。成熟SCF受体分子由胞膜区和胞浆区组成，表达于多种干细胞、集落形成细胞和肥大细胞等[5]。C\|kit/SCF信号传导途径在多种造血细胞增殖和分化中起重要作用，也就是增殖细胞首先表达c\|kit蛋白，然后与SCF结合而促进细胞增殖和分化[6]。原始干细胞c\|kit蛋白分子的表达在造血早期阶段起重要作用[7]。
, http://www.100md.com
本研究发现：在照射后6小时，c\|kit蛋白于造血细胞浆内表达明显增多，而照后1～6天，其表达均明显减少，这可能是因为在骨髓损伤较早期(1天内)，c\|kit蛋白于造血细胞浆内反应性增多，而当造血细胞损伤严重时，其表达则明显减少，而此时成骨细胞及软骨细胞表达C\|kit增多，可能是因为辐射促进造血细胞表达c\|kit蛋白减少，而骨髓辐射损伤后急待重建，SCF要想促进造血重建，亦需更多的C\|kit与之相结合，这就需要成骨细胞及软骨细胞表达较多的干细胞因子受体以供需求。照后10天，较多的幼稚细胞胞膜c\|kit蛋白阳性，这样c\|kit蛋白阳性的造血细胞即可与SCF结合，加速造血重建。
本实验首次采用免疫组织(细胞)化学技术，研究了c\|kit蛋白在辐射损伤后骨髓造血细胞、成骨细胞及软骨细胞等的变化规律，这在国内外同类文献中尚未见到，填补了在此领域的研究资料，为C\|kit参与辐射后造血功能重建提供直接依据。但C\|kit究竟如何参与造血重建，尚待今后深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 梁英杰，凌启波.一种快速高敏感的免疫组织化学染色法—LSAB法.中华病理杂志，1993，22：369.
2 Zsebo KM,Wyoych J,Mcniece IK,et al.Identification,purification,and boilogical characterization of hematopoietic stem cell factor from buffalo rat liver\|conditioned medium.Cell,1990,63:195.
3 Huss R,Hong DS,Beckham C,et al.Ultrastructural location of stem cell factor in canine marrow\|derived stromal cell.Exp Hemat,1995,23:33.
, 百拇医药
4 Chabot B,Stephesson DA,Chapqen VM,et al.The proto—oncogene c\|kit encoding a transmembrane tyrosine receptor maps to the mouse W locus.Nature,1988,55:185.
5 金伯泉主编.细胞及分子免疫学.第一版，北京：人民卫生出版社，1995.
6 Aye,MT,Leclair HB,Trudel ZE,et al.Expression of stem cell factor and c\|kit mRNA in cultured endothelial cells,monocytes and cloned human bone marrow stronal cells(cFU\|RF).Exp Hemat,1992,20:523.
7 Okada S,Nakauch H,Nagayoshi K,et al.Enrichment and characterization of murine hematopoietic stem cells that express c\|kit molecule.Blood,1991,78:1706
(收稿：1996-07-15 修回：1996-10-03), 百拇医药
单位：100850 北京，北京放射医学研究所
关键词：辐射；骨髓；细胞凋亡；C\|kit；免疫组化
中华放射医学与防护杂志980305.htm
目的 至今，尚未见到采用免疫组化技术研究骨髓辐射损伤后干细胞因子受体(C-kit)表达及其在造血重建中的意义。方法 本文经60Coγ射线全身照射IACA小鼠，于照射后4周内分批活杀动物，采用光镜、电镜及LSAB免疫组化方法，研究了辐射诱导的造血细胞凋亡信C\|kit的表达及意义。结果 全身照射LA\|CA小鼠时，5.5Gy为其亚致死剂量，此剂量照射小鼠可导致外周血白细胞及骨髓有核细胞减少；骨髓明显损伤及损伤后重建现象；在照后1天内可使骨髓造血细胞发生凋亡；5.5Gy照射后6小时，C\|kit蛋白于造血细胞浆内明显增多，呈强阳性；照后10天，骨髓造血细胞增生、恢复，C\|kit蛋白于造血细胞膜表达明显增多，呈强阳性。结论 C\|kit表达与造血功能重建有关，在早期造血功能重建中起重要调节作用。
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Immunohistochemical studiews on expression of c\|kit in LACA mouse bone marrow after irradiation Peng Ruiyun,Wang Dewen,Xiong Chengqi,et al.Department of Experimental Pathology,Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.
Objective To study the expression and significance of c\|kit in irradiated bone marrow,Methods LACA mice were irradiated with 60Coγ\|rays,and sacrificed within 4 weeks,after irradiation.By means of light microscopy,electron microscopy and immunohistochemical method of LSAB,the authors studied radiation\|induced apoptosis of hemapoietic cells and the expression of c\|kit.Results A dose of 5.5Gy total body irradiation was a sublethal dose for LACA mouse,and induced decrease of WBC in blood and nucleated cells in bone marrow.The bone marrow was obviously injured and then reconstructed.C\|kit protein was strongly positive in cyto plasma of hematopoietic cells 6 hours after radiation,while it was strong positive at the membrane of hematopoietic cells 10 days after irradiation.Conclusion The hemopoietic cells developed apoptosis within 1 day after irradiation.The expression of c\|kit was related to the reconstruction of hematopoiesis,and played an important role in the early hematopoiesis.
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Key words Radiation Bone marrow Apoptoisi c\|kit Immunohistochemistry
骨髓对射线极为敏感，在病理形态上，对骨髓辐射损伤进行了大量的研究，但大都采用经典的病理手段。迄今，尚水见到将免疫组织(细胞)化学技术应用到骨髓辐射损伤的病理上来。弄清造血生长因子受体的分布规律为造血生长因子的合理应用，阐明其机制开避一条新的途径。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与照射方法：LACA小鼠70只，体重16～20g，随机分为对照组20只及照射组50只。照射组动物采用60Coγ射线全身照射，剂量为5.5Gy，照射量率为91.1×10-4C*kg-1*min-1。
1.2 外周血白细胞及骨髓有核细胞计数：动物于照射后6小时，1，3，6，10，15，21天和4周，尾静脉采外周血进行白细胞计数，并将左股骨骨髓用生理盐水冲出，并进行有核细胞计数。
, 百拇医药
1.3 病理检查及凋亡细胞检测：将各时间点活杀动物骨髓入Helly's液及3%戊二醛、1%锇酸固定，分别制作石蜡切片及半簿切片，H*E染色；在光镜下观察其病理改变和凋亡的细胞。并将骨髓细胞涂片BFA(缓冲辐尔马林丙酮)液固定，-20℃保存备做免疫组化染色。
1.4 免疫组化染色(LSAB法)：染色方法参考梁英杰[1]等方法并进行改进。不同之处是将HRP\|SA改为AP\|SA,，显色剂用坚固红而不是DAB，甘油明胶封片。阳性结果为玫瑰红色。
2 结果
2.1 照射剂量与动物死亡的关系：照射后4周内对照组动物未见死亡，照射组动物仅见2例动物死亡，可见5.5Gy照射对LACA小鼠来说，为其亚致死剂量。
2.2 外周血白细胞及骨髓有核细胞的检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 5.5Gy照后4周内小鼠外周血白细胞及骨髓有核细胞变化 照后时间
(d)
白细胞
(×109/L)
骨髓有核细胞计数
(个/股骨)
对照组
13.1±2.2
463±0.1
6小时
7.6±2.3**
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3.4±0.3*
1
4.1±0.9**
1.2±0.3**
3
1.8±0.5**
0.5±0.2**
6
1.7±0.7**
0.7±0.3**
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2.2±0.8**
1.1±0.5**
15
4.1±1.9**
1.5±0.4**
21
7.8±3.3**
2.6±0.4**
4周
17.1±5.0**
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4.1±0.9**
2.3 病理形态改变：在照后4周内骨髓出现明显损伤，并出现损伤后重建现象，将此过程分为造血细胞减少期、骨髓空虚期、再生恢复期和基本恢复期。照后6小时，造血细胞出现凋亡的典型改变：核浓缩、边移，呈半月形、环状、戒指状及不规则形，并见核碎裂，凋亡小体形成，或游离或被邻近细胞吞噬(图1)。
2.4 免疫组化染色结果：正常小鼠骨髓仅少数造血细胞浆内和胞膜，部分软骨细胞和成骨细胞内c\|kit蛋白阳性。5.5Gy照后6小时，c\|kit蛋白胞浆内阳性的造血细胞明显增多，呈强阳性；照后1～6天，成骨细胞及软骨细胞浆内c\|kit蛋白阳性的细胞明显增多；照后10天，c\|kit蛋白胞膜阳性的造血细胞明显增多(图2)，成骨细胞及软骨细胞浆内较6天时有所减少；照射15天后，c\|kit蛋白胞膜阳性的造血细胞逐渐减少，胞浆阳性的细胞逐渐增多，至照射后4周，c\|kit蛋白表达基本恢复至正常水平。
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3 讨论
文献对骨髓辐射损伤后的病理改变已有诸多描述，但尚未见到辐射诱导骨髓造血细胞“凋亡”这一概念的提出。本文研究发现5.5Gy照后6小时，凋亡的造血细胞明显增多，并对其形态进行了较详尽地描述，比以往的病理研究前进了一步。
干细胞因子(SCF)又称肥大细胞生长因子(MGF)kit配体(KL)或steel因子(SF)，最初是Zsebo等[2]从Buffalo大鼠肝细胞系中cDNA克隆成功。在小鼠其基因位于第10号染色体SL位点，它主要由肝细胞产生，骨髓腔内的某些基质细胞如纤维样细胞、内皮细胞等亦表达SCF[3]。SCF具有多种生物学功能，在骨髓移植、造血功能障碍以及干细胞基因治疗中有潜在的应用价值。而SCF首先必须和其受体即c\|kit蛋白结合，才能发挥其生物学效应。
SCF受体即是C\|kit，在小鼠编码于5号染色体W位点[4]，如该位点发生突变，将会引起多潜能造血干细胞减少、贫血等。成熟SCF受体分子由胞膜区和胞浆区组成，表达于多种干细胞、集落形成细胞和肥大细胞等[5]。C\|kit/SCF信号传导途径在多种造血细胞增殖和分化中起重要作用，也就是增殖细胞首先表达c\|kit蛋白，然后与SCF结合而促进细胞增殖和分化[6]。原始干细胞c\|kit蛋白分子的表达在造血早期阶段起重要作用[7]。
, http://www.100md.com
本研究发现：在照射后6小时，c\|kit蛋白于造血细胞浆内表达明显增多，而照后1～6天，其表达均明显减少，这可能是因为在骨髓损伤较早期(1天内)，c\|kit蛋白于造血细胞浆内反应性增多，而当造血细胞损伤严重时，其表达则明显减少，而此时成骨细胞及软骨细胞表达C\|kit增多，可能是因为辐射促进造血细胞表达c\|kit蛋白减少，而骨髓辐射损伤后急待重建，SCF要想促进造血重建，亦需更多的C\|kit与之相结合，这就需要成骨细胞及软骨细胞表达较多的干细胞因子受体以供需求。照后10天，较多的幼稚细胞胞膜c\|kit蛋白阳性，这样c\|kit蛋白阳性的造血细胞即可与SCF结合，加速造血重建。
本实验首次采用免疫组织(细胞)化学技术，研究了c\|kit蛋白在辐射损伤后骨髓造血细胞、成骨细胞及软骨细胞等的变化规律，这在国内外同类文献中尚未见到，填补了在此领域的研究资料，为C\|kit参与辐射后造血功能重建提供直接依据。但C\|kit究竟如何参与造血重建，尚待今后深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 梁英杰，凌启波.一种快速高敏感的免疫组织化学染色法—LSAB法.中华病理杂志，1993，22：369.
2 Zsebo KM,Wyoych J,Mcniece IK,et al.Identification,purification,and boilogical characterization of hematopoietic stem cell factor from buffalo rat liver\|conditioned medium.Cell,1990,63:195.
3 Huss R,Hong DS,Beckham C,et al.Ultrastructural location of stem cell factor in canine marrow\|derived stromal cell.Exp Hemat,1995,23:33.
, 百拇医药
4 Chabot B,Stephesson DA,Chapqen VM,et al.The proto—oncogene c\|kit encoding a transmembrane tyrosine receptor maps to the mouse W locus.Nature,1988,55:185.
5 金伯泉主编.细胞及分子免疫学.第一版，北京：人民卫生出版社，1995.
6 Aye,MT,Leclair HB,Trudel ZE,et al.Expression of stem cell factor and c\|kit mRNA in cultured endothelial cells,monocytes and cloned human bone marrow stronal cells(cFU\|RF).Exp Hemat,1992,20:523.
7 Okada S,Nakauch H,Nagayoshi K,et al.Enrichment and characterization of murine hematopoietic stem cells that express c\|kit molecule.Blood,1991,78:1706
(收稿：1996-07-15 修回：1996-10-03), 百拇医药