PKC在脑损伤后血脑屏障损害中的作用
作者：李良平 郭希高 徐如祥 蔡颖谦
单位：李良平(第一军医大学珠江医院神经外科 广州，510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科 广州，510282)；蔡颖谦(第一军医大学珠江医院神经外科 广州，510282)；郭希高(广东顺德市第一人民医院神经外科)
关键词：脑损伤；血脑屏障；蛋白激酶C
脑与神经疾病杂志000502 摘 要 目的：探讨PKC在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。方法：雄性SD大鼠60只，随机分为正常对照组、假手术组、脑损伤组和H7治疗组。治疗组于伤后0.5h腹腔注射PKC阻断剂H7 1mg/kg，12h重复注射一次，荧光显微镜定性观察，分光光度计定量检测伊文氏兰渗出。结果：脑损伤后伊文氏兰明显渗出，治疗组渗出明显减少。结论：应用PKC阻断剂H7能明显阻止血脑屏障开放，表明PKC在脑损伤后血脑屏障损害中起重要作用。
, 百拇医药
Effects of PKC on BBB in brain injury
Li Liangping,Guo Xigao,Xu Ruxiang
(Department of Neurosurgery,Zhujiang Hospital First Military Medical University,Guangzhou 510282)
Abstract Objective：Aim To explore the effects of PKC on BBB damage in brain in jury.Methods:60 male SD rats were devided into 4 of groups included control,Sham-operation,injury only and injury with H7-treatment.The rats in the treatment group were peritoneally administered H7 (2mg/kg) at 0.5h and 12h after brain injury.The permeation of Evans blue was observed qualitatively with an epifluorescence and quantitatively with a spectrophotometer.Results:Evans blue significantly in the injured group while significantly decreases in treatment group.Conclusion:H7,a PKC blocker can prevent BBB opening significantly,these results indicate that the PKC take a important role on BBB damage in brain injury.
, 百拇医药
Key words brain injury BBB PKC
蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是调节脑微血管内皮细胞通透性的一条重要信号传导通路。脑损伤后血脑屏障开放，通透性增加，脑水肿发生、 发展，是通过细胞内的信息传导通路，研究细胞内的信号转导机制，可以阐明血脑屏障损害的机理。本研究采用PKC阻断剂H7观察其在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。
材 料 与 方 法
1.实验分组
雄性SD大鼠60只，体重250±30g，随机分为正常对照组、 假手术组、 脑损伤组和H7治疗组，每组15只。治疗组于伤后0.5h腹腔注射H7(1mg/kg)，12h后重复注射一次。动物均于伤后24h处死。
2.脑损伤模型的建立
, http://www.100md.com
采用我们改进的Feeney氏[1]自由落体硬膜外撞击方法。实验动物用10%水合氯醛(0.35g/kg体重)腹腔内注射麻醉后，头部固定于立体定向仪上，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线左侧切开头皮，分离骨膜，用牙科钻于中线旁2mm，紧挨冠状缝后开一直径5mm的圆形骨窗，硬膜保持完整。用20g砝码于30cm高处通过一金属导杆坠落，撞击置于硬膜上的5mm直径的圆形锥上制成脑损伤模型，致伤冲击力为600gcm，硬膜外置明胶海绵止血，骨窗用锌汀粉封闭，缝合头皮，置鼠笼喂养。
正常对照组不做任何处理。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不致脑损伤，术后24h处死。
3.伊文氏兰荧光显微镜观察
每组用3只大鼠于处死前1h经股静脉注射2%伊文氏兰(3ml/kg)，取损伤周围皮质小块待观察脑组织，浸入4℃的4%多聚甲醛(Ph 7.4)72h，固定组织在30%庶糖中至少24h，冰冻切片成20μm，荧光显微镜下观察。
, 百拇医药
4.脑组织伊文氏兰含量的测定
大鼠均于处死前1h注射2%伊文氏兰3ml/kg。取脑时，为清除血液中染料，用生理盐水左心室灌注至右心耳流出清亮液体。取损伤侧皮质、 海马，对侧皮质、 海马分别称重，加入二倍体积二甲基甲酰胺，50℃水浴中孵育72h，1500g离心10min，取上清，应用分光光度计在伊文氏兰最大吸收光谱635nm处检测吸光度，从标准曲线上查得伊文氏兰含量结果以μg/g脑组织表示。
5.统计学处理
应用单因素方差分析和各组均数t检验处理，P<0.05为显著性差异。
结 果
1.伊文氏兰荧光显微镜观察结果
正常对照组和假手术组伊文氏兰无明显渗出，脑损伤组伊文氏兰大量渗出，H7治疗组伊文氏兰渗出明显减少，说明PKC参与了血脑屏障的开放，H7有明显阻止血脑屏障开放的作用。
, 百拇医药
2.脑组织伊文氏兰定量测定结果
脑损伤后损伤侧皮质、 海马，对侧皮质、 海马伊文氏兰含量都明显高于正常对照组和假手术组。治疗组损伤侧海马，对侧皮质、 海马，伊文氏兰含量接近正常，损伤侧皮质伊文氏兰含量明显高于正常对照组和假手术组，但明显低于脑损伤组。H7有明显阻止血脑屏障开放的作用。如表1。
表1 H7治疗后脑组织伊文氏兰含量的变化(X±S) 组 别
n
伊文氏兰含量(μg/g脑组织)
左侧皮质
右侧皮质
左侧海马
右侧海马
, http://www.100md.com
正常对照组
12
10.15±1.06
10.31±1.22
10.62±0.89
11.67±0.84
假手术组
12
10.96±0.43
10.87±0.37
10.61±0.66
10.55±0.49
, 百拇医药
脑损伤组
12
237.41±15.48**
20.97±0.38
20.38±0.79**
15.67±1.19*
H7治疗组
12
75.64±8.21**△△
11.67±1.31△△
, 百拇医药 11.96±0.76△△
10.43±0.85△△
*P<0.05 **P<0.01 Vs control group,△P<0.05,△△P<0.01 Vs brain injured group讨 论
PKC是内皮细胞重要的信息传导通路，调节内皮细胞通透性，在脑微血管内皮细胞参与了血脑屏障通透性调节，与脑水肿的发生发展密切相关。Patterson[2]报道，在牛肺动脉内皮细胞单层，应用PKC抑制剂和下调PKC都能明显抑制百日咳毒素诱发的细胞间裂隙形成和通透性增加。Joo[3]报道在大鼠脑缺血模型中双侧颈内动脉结扎后，脑组织明显水肿，应用PKC抑制剂H7后，脑水肿明显减轻，揭示PKC参与了血脑屏障开放的调节作用。本文通过对大鼠脑损伤后伊文氏兰渗出的定性、 定量研究，证明H7能明显阻止血脑屏障的开放。各种介质作用的非直接损伤区，同侧海马，对侧皮质、 海马，血脑屏障可逆性开放，H7几乎能完全阻断血脑屏障可逆性开放，损伤侧皮质，伊文氏兰渗出也明显减少，损伤区可能存在血管断裂，血脑屏障不可逆性损害，故不能完全阻断血脑屏障开放，表明PKC在血脑屏障损害中起着重要作用。
, http://www.100md.com
内皮细胞间裂隙形成，通透性增加，主要有二方面调节机制：1.轴向的收缩，主要由MLCK调节作用； 2.束缚力量，细胞-细胞，细胞-基质粘附作用。PKC可使粘着斑蛋白激酶激活，作用于粘着斑蛋白和踝蛋白等，使细胞骨架结构重组，细胞回缩，通透性增加[4，5]。脑损伤后各种神经介质和自由基释放可导致脑微血管内皮细胞PKC激活，细胞收缩和回缩，细胞间裂隙形成，通透性增加，血脑屏障开放，加重脑水肿的发生、 发展。
PKC阻断剂H7能阻止PKC作用，阻止细胞骨架结构重排，减少内皮细胞通透性，在脑微血管内皮细胞，阻止血脑屏障的开放。
参考文献
1，Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury:I methodology and local effects of contusions in the rat.Brain Res.1981;211(1)∶67～77.
, 百拇医药
2，Patterson CE,Stasek JK,Schaphorst KL,et al.Machanisms pertussis toxin-induced barrier dysfunction in bovine pulmonary artery endothelial cell monolayers.Am J Physiol.1995;268(6ptl)∶2926～2934.
3，Joo F,Tosaki A,Olah Z,et al.Inhibition by H7 to the protein kinase C prevents formation of brain edema in sprague bawley CFY rats.Brain Res.1989;490(6)∶141～143.
4，Schaphorst KL,Pavalko FM,Patterson CE.Thrombin-mediated focal adhesion plaque reorganization in endothelium:role of protein phosphorylation.Am J Respir Cell Mol Biol.1997;17(4)∶443～455.
5，Garcia JA,Verin AD,Schaphorst KL.Regulation of thrombin-mediated endothelial cell contraction and permeability.Semin Thromb Hemost.1996;22(4)∶309～315.
收稿日期：2000-6-13, http://www.100md.com
单位：李良平(第一军医大学珠江医院神经外科 广州，510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科 广州，510282)；蔡颖谦(第一军医大学珠江医院神经外科 广州，510282)；郭希高(广东顺德市第一人民医院神经外科)
关键词：脑损伤；血脑屏障；蛋白激酶C
脑与神经疾病杂志000502 摘 要 目的：探讨PKC在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。方法：雄性SD大鼠60只，随机分为正常对照组、假手术组、脑损伤组和H7治疗组。治疗组于伤后0.5h腹腔注射PKC阻断剂H7 1mg/kg，12h重复注射一次，荧光显微镜定性观察，分光光度计定量检测伊文氏兰渗出。结果：脑损伤后伊文氏兰明显渗出，治疗组渗出明显减少。结论：应用PKC阻断剂H7能明显阻止血脑屏障开放，表明PKC在脑损伤后血脑屏障损害中起重要作用。
, 百拇医药
Effects of PKC on BBB in brain injury
Li Liangping,Guo Xigao,Xu Ruxiang
(Department of Neurosurgery,Zhujiang Hospital First Military Medical University,Guangzhou 510282)
Abstract Objective：Aim To explore the effects of PKC on BBB damage in brain in jury.Methods:60 male SD rats were devided into 4 of groups included control,Sham-operation,injury only and injury with H7-treatment.The rats in the treatment group were peritoneally administered H7 (2mg/kg) at 0.5h and 12h after brain injury.The permeation of Evans blue was observed qualitatively with an epifluorescence and quantitatively with a spectrophotometer.Results:Evans blue significantly in the injured group while significantly decreases in treatment group.Conclusion:H7,a PKC blocker can prevent BBB opening significantly,these results indicate that the PKC take a important role on BBB damage in brain injury.
, 百拇医药
Key words brain injury BBB PKC
蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是调节脑微血管内皮细胞通透性的一条重要信号传导通路。脑损伤后血脑屏障开放，通透性增加，脑水肿发生、 发展，是通过细胞内的信息传导通路，研究细胞内的信号转导机制，可以阐明血脑屏障损害的机理。本研究采用PKC阻断剂H7观察其在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。
材 料 与 方 法
1.实验分组
雄性SD大鼠60只，体重250±30g，随机分为正常对照组、 假手术组、 脑损伤组和H7治疗组，每组15只。治疗组于伤后0.5h腹腔注射H7(1mg/kg)，12h后重复注射一次。动物均于伤后24h处死。
2.脑损伤模型的建立
, http://www.100md.com
采用我们改进的Feeney氏[1]自由落体硬膜外撞击方法。实验动物用10%水合氯醛(0.35g/kg体重)腹腔内注射麻醉后，头部固定于立体定向仪上，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线左侧切开头皮，分离骨膜，用牙科钻于中线旁2mm，紧挨冠状缝后开一直径5mm的圆形骨窗，硬膜保持完整。用20g砝码于30cm高处通过一金属导杆坠落，撞击置于硬膜上的5mm直径的圆形锥上制成脑损伤模型，致伤冲击力为600gcm，硬膜外置明胶海绵止血，骨窗用锌汀粉封闭，缝合头皮，置鼠笼喂养。
正常对照组不做任何处理。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不致脑损伤，术后24h处死。
3.伊文氏兰荧光显微镜观察
每组用3只大鼠于处死前1h经股静脉注射2%伊文氏兰(3ml/kg)，取损伤周围皮质小块待观察脑组织，浸入4℃的4%多聚甲醛(Ph 7.4)72h，固定组织在30%庶糖中至少24h，冰冻切片成20μm，荧光显微镜下观察。
, 百拇医药
4.脑组织伊文氏兰含量的测定
大鼠均于处死前1h注射2%伊文氏兰3ml/kg。取脑时，为清除血液中染料，用生理盐水左心室灌注至右心耳流出清亮液体。取损伤侧皮质、 海马，对侧皮质、 海马分别称重，加入二倍体积二甲基甲酰胺，50℃水浴中孵育72h，1500g离心10min，取上清，应用分光光度计在伊文氏兰最大吸收光谱635nm处检测吸光度，从标准曲线上查得伊文氏兰含量结果以μg/g脑组织表示。
5.统计学处理
应用单因素方差分析和各组均数t检验处理，P<0.05为显著性差异。
结 果
1.伊文氏兰荧光显微镜观察结果
正常对照组和假手术组伊文氏兰无明显渗出，脑损伤组伊文氏兰大量渗出，H7治疗组伊文氏兰渗出明显减少，说明PKC参与了血脑屏障的开放，H7有明显阻止血脑屏障开放的作用。
, 百拇医药
2.脑组织伊文氏兰定量测定结果
脑损伤后损伤侧皮质、 海马，对侧皮质、 海马伊文氏兰含量都明显高于正常对照组和假手术组。治疗组损伤侧海马，对侧皮质、 海马，伊文氏兰含量接近正常，损伤侧皮质伊文氏兰含量明显高于正常对照组和假手术组，但明显低于脑损伤组。H7有明显阻止血脑屏障开放的作用。如表1。
表1 H7治疗后脑组织伊文氏兰含量的变化(X±S) 组 别
n
伊文氏兰含量(μg/g脑组织)
左侧皮质
右侧皮质
左侧海马
右侧海马
, http://www.100md.com
正常对照组
12
10.15±1.06
10.31±1.22
10.62±0.89
11.67±0.84
假手术组
12
10.96±0.43
10.87±0.37
10.61±0.66
10.55±0.49
, 百拇医药
脑损伤组
12
237.41±15.48**
20.97±0.38
20.38±0.79**
15.67±1.19*
H7治疗组
12
75.64±8.21**△△
11.67±1.31△△
, 百拇医药 11.96±0.76△△
10.43±0.85△△
*P<0.05 **P<0.01 Vs control group,△P<0.05,△△P<0.01 Vs brain injured group讨 论
PKC是内皮细胞重要的信息传导通路，调节内皮细胞通透性，在脑微血管内皮细胞参与了血脑屏障通透性调节，与脑水肿的发生发展密切相关。Patterson[2]报道，在牛肺动脉内皮细胞单层，应用PKC抑制剂和下调PKC都能明显抑制百日咳毒素诱发的细胞间裂隙形成和通透性增加。Joo[3]报道在大鼠脑缺血模型中双侧颈内动脉结扎后，脑组织明显水肿，应用PKC抑制剂H7后，脑水肿明显减轻，揭示PKC参与了血脑屏障开放的调节作用。本文通过对大鼠脑损伤后伊文氏兰渗出的定性、 定量研究，证明H7能明显阻止血脑屏障的开放。各种介质作用的非直接损伤区，同侧海马，对侧皮质、 海马，血脑屏障可逆性开放，H7几乎能完全阻断血脑屏障可逆性开放，损伤侧皮质，伊文氏兰渗出也明显减少，损伤区可能存在血管断裂，血脑屏障不可逆性损害，故不能完全阻断血脑屏障开放，表明PKC在血脑屏障损害中起着重要作用。
, http://www.100md.com
内皮细胞间裂隙形成，通透性增加，主要有二方面调节机制：1.轴向的收缩，主要由MLCK调节作用； 2.束缚力量，细胞-细胞，细胞-基质粘附作用。PKC可使粘着斑蛋白激酶激活，作用于粘着斑蛋白和踝蛋白等，使细胞骨架结构重组，细胞回缩，通透性增加[4，5]。脑损伤后各种神经介质和自由基释放可导致脑微血管内皮细胞PKC激活，细胞收缩和回缩，细胞间裂隙形成，通透性增加，血脑屏障开放，加重脑水肿的发生、 发展。
PKC阻断剂H7能阻止PKC作用，阻止细胞骨架结构重排，减少内皮细胞通透性，在脑微血管内皮细胞，阻止血脑屏障的开放。
参考文献
1，Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury:I methodology and local effects of contusions in the rat.Brain Res.1981;211(1)∶67～77.
, 百拇医药
2，Patterson CE,Stasek JK,Schaphorst KL,et al.Machanisms pertussis toxin-induced barrier dysfunction in bovine pulmonary artery endothelial cell monolayers.Am J Physiol.1995;268(6ptl)∶2926～2934.
3，Joo F,Tosaki A,Olah Z,et al.Inhibition by H7 to the protein kinase C prevents formation of brain edema in sprague bawley CFY rats.Brain Res.1989;490(6)∶141～143.
4，Schaphorst KL,Pavalko FM,Patterson CE.Thrombin-mediated focal adhesion plaque reorganization in endothelium:role of protein phosphorylation.Am J Respir Cell Mol Biol.1997;17(4)∶443～455.
5，Garcia JA,Verin AD,Schaphorst KL.Regulation of thrombin-mediated endothelial cell contraction and permeability.Semin Thromb Hemost.1996;22(4)∶309～315.
收稿日期：2000-6-13, http://www.100md.com