IL-12协同B7-1增强实验小鼠的抗肿瘤免疫
作者：王志华 康熙雄 谷宪三朗 住本秀敏 中畸有恒 浅野茂隆
单位：王志华 康熙雄 谷宪三朗 住本秀敏 中畸有恒 浅野茂隆(哈尔滨医科大学肿瘤研究所分子生物与基因工程研究室 哈尔滨 150040)
关键词：IL-12；B7-1；GM-CSF；癌疫苗；基因治疗
中国肿瘤生物治疗杂志000114 摘 要 目的： 我们应用逆转录病毒构建了IL-12，B7-1和GM-CSF表达载体，以研究基因修饰的肿瘤细胞的癌疫苗作用。方法： 将3种表达载体分别转染EL-4胸腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。结果： 当接种了EL-4/IL-12细胞后，在C57BL/6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL-4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P<0.01)。在EL-4/IL-12被排斥后，体内试验中诱发了实验动物抗EL-4/Wt的系统性、保护性免疫，51Cr释放测定中，获得一个较强的抗EL-4/Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性，体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的肿瘤原性主要依赖于CD4+，CD8+和NK细胞。用EL-4/IL-12细胞进行疫苗治疗比较用EL-4/Neo细胞能有效地延缓已建立的EL-4/Wt肿瘤的生长(P<0.005)，EL-4/IL-12和EL-4/B7-1联合比用单一的转基因细胞增强了治疗效果(P<0.005)。结论： 提示应用IL-12进行血液肿瘤的治疗是有效的，IL-12和B7-1联合使用在未来人类癌症的治疗中亦可有一定的应用前景。
, 百拇医药
《中图图书资料分类法》分类号 R730.3； R730.51
IL-12 Synergizes B7-1 Enhance the Antitumor Immunity in Experimental Mice
Wang Zhihua， Kang Xixiong， Kenzaburo Tani， Hidetoshi Sumimoto, Yakon Nakazaki, Shigetaka Asano
(Institute of Oncology,Harbin Medical University,Harbin 150040)
Abstract Objective: To study the vaccine potency of gene-modified tumor cells, we have constructed IL-12,B7-1 and GM-CSF express vector using retrovirus. Methods: It was transfected into EL-4 thymic lymphoma cells respectively and the effect of gene transduction on anti-tumor immunity were investigated. Results: The tumorigenicity of EL-4/IL-12 transfectant in C57BL/6 synergistical mice was decreased significantly after implanted with EL-4/IL-12 transfectant compaired with EL-4/Wt or EL-4/Neo groups (P<0.01).The systemic protective immunity was induced against the challenge with EL-4/Wt (in 10/15 mice) after the rejection of EL-4/IL-12 in vivo experiment,a stronger CTL activity against EL-4/Wt cells and a weak killer activity against syngeneic Lewis Lung Carcinoma cells were obtained in 51Cr release assay. In vivo depletion analysis suggested that the decrcased tumorigenicity mainly depended on CD4+,CD8+ and NK cells. Therapeutic vaccines with EL-4/IL-12 cells could retard the growth to estabished EL-4/Wt tumors significantly compared with those of EL-4/Neo (P<0.005)， combination of therapeutic vaccines of EL-4/IL-12 and EL-4/B7-1 result in the enhanced the therapeutic effect of each single transficants (P<0.005) in this experimental model. Conclution: These studies suggested that immunogene treatment using IL-12 is effective in hematopoietic malignancy,and combination of IL-12 with B7-1 have a aplication value in human cancer treatment in the near future.
, 百拇医药
Key words IL-12; B7-1; GM-CSF; cancer vaccine; gene therapy
近年，很多研究显示在动物和人类抗肿瘤免疫中T淋巴细胞扮演一个重要的角色[1]。T淋巴细胞活化需要二个信号，一个是由T细胞受体传递的抗原特异性信号，第二个是抗原非特异性的或称共刺激信号由辅助受体和抗原提呈细胞(APCs)上表达的配体结合后进行传递[2]。B7-1的表达只限于APCs，如树突状细胞，活化的B细胞和单核/巨噬细胞[3]。APCs表面的B7分子和他们的对应受体、T细胞表面的CD28相互反应启动了一个共刺激信号，它补充了抗原-MHC复合物对T细胞受体的刺激，导致T细胞表达IL-2及IL-2受体，诱发克隆增生和免疫反应的启动[4，5]。另一方面，几种肿瘤细胞也被用来表达特定的细胞因子以诱发保护性免疫。在这些细胞因子中，白细胞介素12(IL-12)在Th1细胞产生与活化及细胞毒性CD8+细胞的产生被认为是一个主要的因子。IL-12的抗肿瘤效果首先是由CD8+T细胞介导的，在很多实验体系中需要IFN-γ的参与，IFN-γ的重要性源于它作为IL-12的介导者可诱发CD4+Th1细胞发生。另有报告提示IL-12对T细胞的刺激作用可由B7-1共刺激而协同增强，二者的结合能使T细胞更好的增生及产生更多的细胞因子[6]。
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在以往的研究中，我们调查了经照射的GM-CSF和B7-1转基因WEH-1慢性单核性白血病细胞、EL-4胸腺瘤和Lewis肺癌细胞的抗肿瘤免疫效果，指出经照射的转基因肿瘤细胞显示较强的疫苗作用[7]。
本研究中，我们估价了IL-12对EL-4胸腺瘤细胞的肿瘤原性的影响，并进一步研究了IL-12，GM-CSF和B7-1分子在癌疫苗治疗中协同作用的可能性。
1 材料和方法
1.1 实验动物
雌性C57BL/6小鼠，6～8周龄，购于日本CLEA公司，所有实验均于8～12周龄进行。
1.2 细胞株
EL-4胸腺瘤细胞由美国ATCC获得、常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液。GK1.5和53.6-72杂交瘤细胞(均源于ATCC)维持在RPMI 1640培液中(含10%胎牛血清)。通过逆转录PCR进行小鼠IL-12的cDNA克隆，该cDNA插入TFG载体以产生TFG-mIL-12-Neo[8](见图1)。用磷酸钙沉淀法将载体转染Ψcre包装细胞，然后用G418选择法挑选具有抵抗性的克隆细胞，含重组TFG-mIL-12-Neo的逆转录病毒产生细胞维持在含有10%胎牛血清的DMEM培液中，37℃，5%CO2孵箱中培养。
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1.3 基因转导
将转染了TFG-mIL-12-Neo包装细胞培养上清转染EL-4细胞，然后将此细胞应用有限稀释和G418(800 μg/ml)筛选法进一步克隆化[8]。由此获得转IL-12基因的IL-4细胞，即EL-4/IL-12细胞株。转染小鼠GM-CSF cDNA或B7-1 cDNA的EL-4细胞株也通过类似的方法获得[7]。
1.4 单克隆抗体与FACS分析
FITC标记的抗CD80(IG10)、抗CD86(GL1)、抗H-2Kb(SF1-1.1)、抗I-Ab(Ams-32.1)、PE标记的抗H-2Db(34-2-12)、生物素标记的抗H-2Kb/H-2Db(28-8-6)单克隆抗体从Pharmnigen公司购买。cDNA转基因肿瘤细胞CD80，MHC class Ⅰ(H-2Kb和H-2Db)和classⅡ(I-Ab)抗原的表达用流式细胞仪(Becton-Dickinson, San Jose. CA. USA)加以检测及分析。
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1.5 肿瘤原性测定
1×105 EL-4/IL-12(32)或EL-4/Wt或EL-4/Neo细胞混悬在大约0.1 ml HBSS当中，然后将其注射于同系C57BL/6小鼠右侧背部皮内，当可以检测到的肿瘤出现时(直径约大于2 mm)，每2天或4天用游标卡尺进行测量。28 d后，再将1×105 EL-3/Wt细胞经皮内注射已经排斥了EL-4/IL-12(32)细胞的实验小鼠的左侧背部，以研究是否发生了系统的抗肿瘤免疫。
图1 TGF-mIL-12-Neo载体的构建略图
Fig. 1 Constructron of TFG-mIL-12-Neo vector
1.6 转基因细胞的肿瘤治疗
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将1×105EL-4 /Wt肿瘤细胞皮内接种于实验小鼠的右侧背部(第0天)，其后，5×104EL-4 /Wt细胞分别和5×104各种转基因细胞混合(1∶1)分3次，(第3,6,9天)注射左侧背部皮内，肿瘤的生长情况每2天或4 天观察1次。
1.7 CTL活性测定
在转基因细胞接种后56天时将排斥IL-12转基因的和其后用EL-4/Wt激发的实验鼠的脾脏取出，按照制造商家说明书经-尼龙纤维柱获得去除红细胞的富含T细胞的组分，这些效应细胞通过在体外和EL-4/Wt进行5 d培养再行刺激。靶细胞EL-4/Wt或野生型Lewis肺癌细胞(LLC/Wt)通过在100 μCi 51Cr铬酸钠存在下37℃,5%CO2，2 h培养而获得，标记的靶细胞依不同的效/靶比例和效应细胞进行共孵育，4 h后，用自动γ-记数仪测定培养上清的放射活性， 并计算特异溶解的百分比。
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1.8 体内去除实验
基本参照以前的测定方法。简言之，抗小鼠CD4和CD8抗体分别通过CK1.5和53.6-72细胞获得，过Hitrap柱(pharmacia biotech)后，再用EZEP纯化。在连续3 d腹腔给0.5 mg抗CD4或抗CD8或用作对照的HBSS(总容积每只1～2 ml，每组4只C57BL/6小鼠)后，将5×105 EL-4/IL-12细胞接种于右侧背部。此后第3天和第6天经腹腔再注射抗体或HBSS，并每隔2～3天进行瘤块测量。抗asialo GM1单克隆抗体用于NK细胞的去除。简言之，5只C57BL/6小鼠给予200 ng抗asialo GM1单克隆抗体(前1天和前5天)，其后接种EL-4/IL-12细胞5×105，后3天和后7天再行抗asialo GM1单抗注射，瘤块测定方法如前所述，我们以前的实验结果显示在相同的实验条件下用流式细胞仪进行淋巴细胞测定，采用抗CD4或抗CD8单克隆抗体去除C57BL/6小鼠的CD4+或CD8+T细胞可达95%以上，应用抗YAC-1细胞的淋巴细胞体外杀伤活性测定法证明采用抗aoialo GM1单克隆抗体处理可以去除100%的NK细胞。在第31天时，未发生IL-4/IL-12细胞肿瘤的实验小鼠再接种EL-4/Wt细胞以测定是否这些细胞亚型在系统的抗肿瘤免疫记忆中发挥了作用，每隔2～3 d再测定EL-4/Wt细胞发生肿瘤的情况。结果依据Fisher的直接概率法进行统计学分析。
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2 结 果
2.1 转基因EL-4细胞株的建立
将小鼠IL-12,GM-GSF或B7-1 cDNA导入EL-4细胞，流式细胞仪分析显示野生型EL-4和仅仅导入Neo基因(EL-4/Neo)细胞MHCⅠ型抗原(H-2Kb/H-2Db)表达为阳性，CD80抗原表达呈阴性。在EL-4/B7-1细胞诱发了CD80的高效表达，通过有限稀释及ELISA方法检测对高表达细胞株进行了克隆，结果24 h IL-12的分泌量为30.75 ng/106 cell(第32株)，GM-CSF为24 ng/106 cell。
2.2 IL-12转导细胞的肿瘤原性
1×105EL-4/Wt或EL-4/neo或EL-2/IL-12细胞注射于C57BL/6小鼠的右侧背部，每组10只(i.d)，10 d之内，所有的动物都发生了可检测到的肿瘤，然而，接种了EL-4/IL-12动物的肿瘤生长却明显地延迟；18 d之内10只中有6只最终排斥了肿瘤。重复试验中得到了相似的结果，共有80%的小鼠排斥了肿瘤(结果未列出)，这一结果提示IL-12转基因动物可以减小肿瘤原性。
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2.3 IL-12诱发了系统的抗肿瘤免疫
上述接种了EL-4/IL-12细胞并且排斥肿瘤的动物在第28天再接种1×105 EL-4/Wt细胞，其中6只中有5只排斥了接种的肿瘤细胞，并在无肿瘤情况下维持至少100 d，另一组实验中，4只中的3只也排斥了再接种的野生型细胞，结果指出这些动物事实上拥有了保护性的肿瘤免疫。
2.4 EL-4/IL-12和EL-4/B7-1协同增加抗肿瘤免疫
在治疗实验中，接种了EL-4/IL-12和EL-4/B7-1转基因细胞动物的肿瘤生长较之接受EL-4/Wt细胞实验组明显缓慢(P<0.05)，EL-4/IL-12和EL-4/GM-CSF的结合并没有导致治疗效果的增加(图2)，而EL-4/IL-12和EL-4/B7-1的结合比较单一治疗却增加了治疗效果(P<0.005)，详见图3。
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图2 EL-4/IL-12和EL-4/GM-CSF转基因细胞
对EL-4/Wt肿瘤的治疗作用
Fig.2 Therapeutic effect of EL-4/IL-12 and EL-4/GM-CSF
transfectants on EL-4/Wt tumor
图3 EL-4/IL-12结合EL-4/B7-1F转基因细胞
对EL-4/Wt肿瘤的治疗作用
Fig.3 Therapeutic effect of EL-4/IL-12 combained with EL-4/
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B7-1 transfectants on EL-4/Wt tumor
2.5 EL-4/IL-12免疫动物诱发的CTL活性
排斥了EL-4/IL-12和EL-4/Wt的C57BL/6小鼠的脾脏T细胞用于体外细胞毒性测定，结果指出，按照效/靶比率的不同，对亲代EL-4/Wt细胞的特异杀伤活性约为62%～68%，对非特异性LLC细胞的杀伤活性约为7%～18%。
2.6 淋巴细胞亚型去除对EL-4/IL-12细胞抗肿瘤免疫的影响
接种了EL-4/IL-12细胞并排斥该肿瘤的实验小鼠分别用抗NK、抗CD4、抗CD8单抗处理后再用EL-4/Wt细胞攻击，28 d后肿瘤的发生率分别为3/10，10/10和8/9，用CD4和CD8 2种单抗处理的小鼠其肿瘤发生率为7/7，完全的肿瘤排斥依赖于CD4+和CD8+细胞亚型，也部分依赖NK细胞，提示由EL-4/IL-2诱发的抗肿瘤反应需要CD4+, CD8+T细胞亚群的参与，asialo-GM1+NK细胞也扮演了一个重要的角色。
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3 讨 论
本研究中，我们构建了小鼠IL-12表达质粒TFG-mIL-12-Neo并将其导入EL-4胸腺瘤细胞，进而研究了在同系C57BL/6小鼠EL-4/IL-12的免疫原性和进行癌疫苗免疫基因疗法的可行性。
研究结果表明，导入mIL-12 cDNA的EL-4/IL-12细胞的肿瘤原性减少，肿瘤的生长延迟，与EL-4亲代细胞相比，大约60%的肿瘤最终消失，虽然在体外培养中，他们的形态学及增生速度并没有差别。进而，排斥了EL-4/IL-12的小鼠亦排斥了EL-4/Wt细胞，推测这些实验动物已经获得了抵抗致死性肿瘤攻击的保护性肿瘤免疫和针对EL-4/Wt细胞的较强的CTL杀伤活性。
为了测定EL-4/IL-12产生的抗肿瘤免疫反应中特异淋巴细胞的作用，给实验动物注射了抗CD4,CD8和抗asialo GM1抗体以消除体内特异的淋巴细胞亚型，结果提示肿瘤原性的改变主要取决于CD4+,CD8+和NK细胞，这些结果和以往的报道大致相同。IL-4/IL-12和EL-4/B7-1的结合比单独作用则增强了癌疫苗的治疗效果。
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Christina M等人曾报道B7-1表达和重组IL-12的使用具有诱导已建立的SCK肿瘤排斥的协同作用，并指出此种结合在诱导一个有力的抗肿瘤免疫反应方面有一定的效果[8]。Sophie C观察到IL-4和B7-1在小鼠肿瘤细胞的共同表达可提高肿瘤的排斥及疫苗作用[9]。我们的结果亦支持这些发现。那么，为什么IL-12和B7-1结合能得到更好的治疗效果，我们推测IL-12和B7-1在诱发肿瘤免疫方面有着复杂的协同性，首先，表达B7-1的肿瘤细胞能够经CD28刺激CD4+T细胞，进而支持CD8+T细胞分化；其次，IL-12作为第二信号诱发Th1克隆细胞增生和IL-2R的表达及诱发T、NK细胞表面受体和粘附分子的表达；第三，IL-12增加IFN-γ和TNF-α产生，导致T细胞配体MHC Ⅰ和Ⅱ型分子表达的增加。这些理由使得他们能在免疫排斥的原始及效应阶段彼此有效协同。
EL-4/IL-12细胞对放射较为敏感，在预实验中证明经5 000 rad照射后，IL-12的分泌量下降较为明显(数据未显示)，其下降的理由尚不清楚，有待从细胞和分子水平澄清这一机制。本实验中应用未经照射处理的IL-4转基因瘤细胞，结果提示在基因免疫疗法的基础研究中应用活的癌细胞亦具有可行性。
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综上，我们的研究证明IL-12基因转导细胞可以诱发系统的免疫反应，导致肿瘤的部分根除，在这一实验系统中IL-12和B7-1转基因细胞的结合可协同增强治疗效果。基于这一研究基础，在临床实验前，须进一步验证临床动物模型对IL-12和B7-1诱发的抗肿瘤免疫作用及安全性。
参 考 文 献
1，Sling CL， Andreal L, John M, et al. Cytotoxic T lymphocyte response to autologous human squamous cell cancer of the lung: Epitope reconstitution with peptides extractcd from Hla-Aw 68. Cancer Res, 1994, 54: 2731
2，Lu L, Hsieh M, Oriss TB, et al. Generation of DC from mouse spleen cell culture in response to GM-CSF: Immunophenotypic and functional analysis. Immunolgy， 1995, 84: 27
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3，Sallustro F， Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dentritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 downregulated by tumor necrosis factor α. J Exp Med, 1994, 179: 1109
4，Inaba K, Wifmer-Pakce M, Hathcock KS, et al. The tissues distribution of the B7-2 costimulation in mice: Abundant expression on dentritic cells in situ and during mataration in vitro. J Exp Med, 1994, 180: 1849
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5，Townsend SE， Allison JP. Tumor rejection after direct costimulation of CD80+ T cells by B7-transfected melanoma cells. Science, 1993， 259: 368
6，Afponso LC, Scharton TM, Vieira LQ, et al. The adjuvant effect of intrrleukin 12 in a vaccine leishmania major. Science, 1994, 263: 235
7，Sumimoto H, Tani K, Nakazaki Y, et al. GM-CSF and B7-1 (CD80) costimularory signals cooperate in the induction of effective antitumor immunity in syngeneic mice. Hum Gene Ther, 1999 (submmited)
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8，Christiina MC, Maira W, Holly LK, et al. B7-1 and intericukin 12 synergistically induce effective antitumor immunity. Cancer Res， 1995， 55: 4980
9，Sophie C, Christian B, Bernd D, et al. Coexpression of interleukin 4 and B7.1 in murine tumor cells lead to improved tumor rejection and vaccine effect compared to single gene transfectants and a classical adjuvant. Hum Gene Ther, 1996, 7: 525
(1999-05-17收稿； 1999-11-08修回), 百拇医药
单位：王志华 康熙雄 谷宪三朗 住本秀敏 中畸有恒 浅野茂隆(哈尔滨医科大学肿瘤研究所分子生物与基因工程研究室 哈尔滨 150040)
关键词：IL-12；B7-1；GM-CSF；癌疫苗；基因治疗
中国肿瘤生物治疗杂志000114 摘 要 目的： 我们应用逆转录病毒构建了IL-12，B7-1和GM-CSF表达载体，以研究基因修饰的肿瘤细胞的癌疫苗作用。方法： 将3种表达载体分别转染EL-4胸腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。结果： 当接种了EL-4/IL-12细胞后，在C57BL/6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL-4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P<0.01)。在EL-4/IL-12被排斥后，体内试验中诱发了实验动物抗EL-4/Wt的系统性、保护性免疫，51Cr释放测定中，获得一个较强的抗EL-4/Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性，体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的肿瘤原性主要依赖于CD4+，CD8+和NK细胞。用EL-4/IL-12细胞进行疫苗治疗比较用EL-4/Neo细胞能有效地延缓已建立的EL-4/Wt肿瘤的生长(P<0.005)，EL-4/IL-12和EL-4/B7-1联合比用单一的转基因细胞增强了治疗效果(P<0.005)。结论： 提示应用IL-12进行血液肿瘤的治疗是有效的，IL-12和B7-1联合使用在未来人类癌症的治疗中亦可有一定的应用前景。
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《中图图书资料分类法》分类号 R730.3； R730.51
IL-12 Synergizes B7-1 Enhance the Antitumor Immunity in Experimental Mice
Wang Zhihua， Kang Xixiong， Kenzaburo Tani， Hidetoshi Sumimoto, Yakon Nakazaki, Shigetaka Asano
(Institute of Oncology,Harbin Medical University,Harbin 150040)
Abstract Objective: To study the vaccine potency of gene-modified tumor cells, we have constructed IL-12,B7-1 and GM-CSF express vector using retrovirus. Methods: It was transfected into EL-4 thymic lymphoma cells respectively and the effect of gene transduction on anti-tumor immunity were investigated. Results: The tumorigenicity of EL-4/IL-12 transfectant in C57BL/6 synergistical mice was decreased significantly after implanted with EL-4/IL-12 transfectant compaired with EL-4/Wt or EL-4/Neo groups (P<0.01).The systemic protective immunity was induced against the challenge with EL-4/Wt (in 10/15 mice) after the rejection of EL-4/IL-12 in vivo experiment,a stronger CTL activity against EL-4/Wt cells and a weak killer activity against syngeneic Lewis Lung Carcinoma cells were obtained in 51Cr release assay. In vivo depletion analysis suggested that the decrcased tumorigenicity mainly depended on CD4+,CD8+ and NK cells. Therapeutic vaccines with EL-4/IL-12 cells could retard the growth to estabished EL-4/Wt tumors significantly compared with those of EL-4/Neo (P<0.005)， combination of therapeutic vaccines of EL-4/IL-12 and EL-4/B7-1 result in the enhanced the therapeutic effect of each single transficants (P<0.005) in this experimental model. Conclution: These studies suggested that immunogene treatment using IL-12 is effective in hematopoietic malignancy,and combination of IL-12 with B7-1 have a aplication value in human cancer treatment in the near future.
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Key words IL-12; B7-1; GM-CSF; cancer vaccine; gene therapy
近年，很多研究显示在动物和人类抗肿瘤免疫中T淋巴细胞扮演一个重要的角色[1]。T淋巴细胞活化需要二个信号，一个是由T细胞受体传递的抗原特异性信号，第二个是抗原非特异性的或称共刺激信号由辅助受体和抗原提呈细胞(APCs)上表达的配体结合后进行传递[2]。B7-1的表达只限于APCs，如树突状细胞，活化的B细胞和单核/巨噬细胞[3]。APCs表面的B7分子和他们的对应受体、T细胞表面的CD28相互反应启动了一个共刺激信号，它补充了抗原-MHC复合物对T细胞受体的刺激，导致T细胞表达IL-2及IL-2受体，诱发克隆增生和免疫反应的启动[4，5]。另一方面，几种肿瘤细胞也被用来表达特定的细胞因子以诱发保护性免疫。在这些细胞因子中，白细胞介素12(IL-12)在Th1细胞产生与活化及细胞毒性CD8+细胞的产生被认为是一个主要的因子。IL-12的抗肿瘤效果首先是由CD8+T细胞介导的，在很多实验体系中需要IFN-γ的参与，IFN-γ的重要性源于它作为IL-12的介导者可诱发CD4+Th1细胞发生。另有报告提示IL-12对T细胞的刺激作用可由B7-1共刺激而协同增强，二者的结合能使T细胞更好的增生及产生更多的细胞因子[6]。
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在以往的研究中，我们调查了经照射的GM-CSF和B7-1转基因WEH-1慢性单核性白血病细胞、EL-4胸腺瘤和Lewis肺癌细胞的抗肿瘤免疫效果，指出经照射的转基因肿瘤细胞显示较强的疫苗作用[7]。
本研究中，我们估价了IL-12对EL-4胸腺瘤细胞的肿瘤原性的影响，并进一步研究了IL-12，GM-CSF和B7-1分子在癌疫苗治疗中协同作用的可能性。
1 材料和方法
1.1 实验动物
雌性C57BL/6小鼠，6～8周龄，购于日本CLEA公司，所有实验均于8～12周龄进行。
1.2 细胞株
EL-4胸腺瘤细胞由美国ATCC获得、常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液。GK1.5和53.6-72杂交瘤细胞(均源于ATCC)维持在RPMI 1640培液中(含10%胎牛血清)。通过逆转录PCR进行小鼠IL-12的cDNA克隆，该cDNA插入TFG载体以产生TFG-mIL-12-Neo[8](见图1)。用磷酸钙沉淀法将载体转染Ψcre包装细胞，然后用G418选择法挑选具有抵抗性的克隆细胞，含重组TFG-mIL-12-Neo的逆转录病毒产生细胞维持在含有10%胎牛血清的DMEM培液中，37℃，5%CO2孵箱中培养。
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1.3 基因转导
将转染了TFG-mIL-12-Neo包装细胞培养上清转染EL-4细胞，然后将此细胞应用有限稀释和G418(800 μg/ml)筛选法进一步克隆化[8]。由此获得转IL-12基因的IL-4细胞，即EL-4/IL-12细胞株。转染小鼠GM-CSF cDNA或B7-1 cDNA的EL-4细胞株也通过类似的方法获得[7]。
1.4 单克隆抗体与FACS分析
FITC标记的抗CD80(IG10)、抗CD86(GL1)、抗H-2Kb(SF1-1.1)、抗I-Ab(Ams-32.1)、PE标记的抗H-2Db(34-2-12)、生物素标记的抗H-2Kb/H-2Db(28-8-6)单克隆抗体从Pharmnigen公司购买。cDNA转基因肿瘤细胞CD80，MHC class Ⅰ(H-2Kb和H-2Db)和classⅡ(I-Ab)抗原的表达用流式细胞仪(Becton-Dickinson, San Jose. CA. USA)加以检测及分析。
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1.5 肿瘤原性测定
1×105 EL-4/IL-12(32)或EL-4/Wt或EL-4/Neo细胞混悬在大约0.1 ml HBSS当中，然后将其注射于同系C57BL/6小鼠右侧背部皮内，当可以检测到的肿瘤出现时(直径约大于2 mm)，每2天或4天用游标卡尺进行测量。28 d后，再将1×105 EL-3/Wt细胞经皮内注射已经排斥了EL-4/IL-12(32)细胞的实验小鼠的左侧背部，以研究是否发生了系统的抗肿瘤免疫。
图1 TGF-mIL-12-Neo载体的构建略图
Fig. 1 Constructron of TFG-mIL-12-Neo vector
1.6 转基因细胞的肿瘤治疗
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将1×105EL-4 /Wt肿瘤细胞皮内接种于实验小鼠的右侧背部(第0天)，其后，5×104EL-4 /Wt细胞分别和5×104各种转基因细胞混合(1∶1)分3次，(第3,6,9天)注射左侧背部皮内，肿瘤的生长情况每2天或4 天观察1次。
1.7 CTL活性测定
在转基因细胞接种后56天时将排斥IL-12转基因的和其后用EL-4/Wt激发的实验鼠的脾脏取出，按照制造商家说明书经-尼龙纤维柱获得去除红细胞的富含T细胞的组分，这些效应细胞通过在体外和EL-4/Wt进行5 d培养再行刺激。靶细胞EL-4/Wt或野生型Lewis肺癌细胞(LLC/Wt)通过在100 μCi 51Cr铬酸钠存在下37℃,5%CO2，2 h培养而获得，标记的靶细胞依不同的效/靶比例和效应细胞进行共孵育，4 h后，用自动γ-记数仪测定培养上清的放射活性， 并计算特异溶解的百分比。
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1.8 体内去除实验
基本参照以前的测定方法。简言之，抗小鼠CD4和CD8抗体分别通过CK1.5和53.6-72细胞获得，过Hitrap柱(pharmacia biotech)后，再用EZEP纯化。在连续3 d腹腔给0.5 mg抗CD4或抗CD8或用作对照的HBSS(总容积每只1～2 ml，每组4只C57BL/6小鼠)后，将5×105 EL-4/IL-12细胞接种于右侧背部。此后第3天和第6天经腹腔再注射抗体或HBSS，并每隔2～3天进行瘤块测量。抗asialo GM1单克隆抗体用于NK细胞的去除。简言之，5只C57BL/6小鼠给予200 ng抗asialo GM1单克隆抗体(前1天和前5天)，其后接种EL-4/IL-12细胞5×105，后3天和后7天再行抗asialo GM1单抗注射，瘤块测定方法如前所述，我们以前的实验结果显示在相同的实验条件下用流式细胞仪进行淋巴细胞测定，采用抗CD4或抗CD8单克隆抗体去除C57BL/6小鼠的CD4+或CD8+T细胞可达95%以上，应用抗YAC-1细胞的淋巴细胞体外杀伤活性测定法证明采用抗aoialo GM1单克隆抗体处理可以去除100%的NK细胞。在第31天时，未发生IL-4/IL-12细胞肿瘤的实验小鼠再接种EL-4/Wt细胞以测定是否这些细胞亚型在系统的抗肿瘤免疫记忆中发挥了作用，每隔2～3 d再测定EL-4/Wt细胞发生肿瘤的情况。结果依据Fisher的直接概率法进行统计学分析。
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2 结 果
2.1 转基因EL-4细胞株的建立
将小鼠IL-12,GM-GSF或B7-1 cDNA导入EL-4细胞，流式细胞仪分析显示野生型EL-4和仅仅导入Neo基因(EL-4/Neo)细胞MHCⅠ型抗原(H-2Kb/H-2Db)表达为阳性，CD80抗原表达呈阴性。在EL-4/B7-1细胞诱发了CD80的高效表达，通过有限稀释及ELISA方法检测对高表达细胞株进行了克隆，结果24 h IL-12的分泌量为30.75 ng/106 cell(第32株)，GM-CSF为24 ng/106 cell。
2.2 IL-12转导细胞的肿瘤原性
1×105EL-4/Wt或EL-4/neo或EL-2/IL-12细胞注射于C57BL/6小鼠的右侧背部，每组10只(i.d)，10 d之内，所有的动物都发生了可检测到的肿瘤，然而，接种了EL-4/IL-12动物的肿瘤生长却明显地延迟；18 d之内10只中有6只最终排斥了肿瘤。重复试验中得到了相似的结果，共有80%的小鼠排斥了肿瘤(结果未列出)，这一结果提示IL-12转基因动物可以减小肿瘤原性。
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2.3 IL-12诱发了系统的抗肿瘤免疫
上述接种了EL-4/IL-12细胞并且排斥肿瘤的动物在第28天再接种1×105 EL-4/Wt细胞，其中6只中有5只排斥了接种的肿瘤细胞，并在无肿瘤情况下维持至少100 d，另一组实验中，4只中的3只也排斥了再接种的野生型细胞，结果指出这些动物事实上拥有了保护性的肿瘤免疫。
2.4 EL-4/IL-12和EL-4/B7-1协同增加抗肿瘤免疫
在治疗实验中，接种了EL-4/IL-12和EL-4/B7-1转基因细胞动物的肿瘤生长较之接受EL-4/Wt细胞实验组明显缓慢(P<0.05)，EL-4/IL-12和EL-4/GM-CSF的结合并没有导致治疗效果的增加(图2)，而EL-4/IL-12和EL-4/B7-1的结合比较单一治疗却增加了治疗效果(P<0.005)，详见图3。
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图2 EL-4/IL-12和EL-4/GM-CSF转基因细胞
对EL-4/Wt肿瘤的治疗作用
Fig.2 Therapeutic effect of EL-4/IL-12 and EL-4/GM-CSF
transfectants on EL-4/Wt tumor
图3 EL-4/IL-12结合EL-4/B7-1F转基因细胞
对EL-4/Wt肿瘤的治疗作用
Fig.3 Therapeutic effect of EL-4/IL-12 combained with EL-4/
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B7-1 transfectants on EL-4/Wt tumor
2.5 EL-4/IL-12免疫动物诱发的CTL活性
排斥了EL-4/IL-12和EL-4/Wt的C57BL/6小鼠的脾脏T细胞用于体外细胞毒性测定，结果指出，按照效/靶比率的不同，对亲代EL-4/Wt细胞的特异杀伤活性约为62%～68%，对非特异性LLC细胞的杀伤活性约为7%～18%。
2.6 淋巴细胞亚型去除对EL-4/IL-12细胞抗肿瘤免疫的影响
接种了EL-4/IL-12细胞并排斥该肿瘤的实验小鼠分别用抗NK、抗CD4、抗CD8单抗处理后再用EL-4/Wt细胞攻击，28 d后肿瘤的发生率分别为3/10，10/10和8/9，用CD4和CD8 2种单抗处理的小鼠其肿瘤发生率为7/7，完全的肿瘤排斥依赖于CD4+和CD8+细胞亚型，也部分依赖NK细胞，提示由EL-4/IL-2诱发的抗肿瘤反应需要CD4+, CD8+T细胞亚群的参与，asialo-GM1+NK细胞也扮演了一个重要的角色。
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3 讨 论
本研究中，我们构建了小鼠IL-12表达质粒TFG-mIL-12-Neo并将其导入EL-4胸腺瘤细胞，进而研究了在同系C57BL/6小鼠EL-4/IL-12的免疫原性和进行癌疫苗免疫基因疗法的可行性。
研究结果表明，导入mIL-12 cDNA的EL-4/IL-12细胞的肿瘤原性减少，肿瘤的生长延迟，与EL-4亲代细胞相比，大约60%的肿瘤最终消失，虽然在体外培养中，他们的形态学及增生速度并没有差别。进而，排斥了EL-4/IL-12的小鼠亦排斥了EL-4/Wt细胞，推测这些实验动物已经获得了抵抗致死性肿瘤攻击的保护性肿瘤免疫和针对EL-4/Wt细胞的较强的CTL杀伤活性。
为了测定EL-4/IL-12产生的抗肿瘤免疫反应中特异淋巴细胞的作用，给实验动物注射了抗CD4,CD8和抗asialo GM1抗体以消除体内特异的淋巴细胞亚型，结果提示肿瘤原性的改变主要取决于CD4+,CD8+和NK细胞，这些结果和以往的报道大致相同。IL-4/IL-12和EL-4/B7-1的结合比单独作用则增强了癌疫苗的治疗效果。
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Christina M等人曾报道B7-1表达和重组IL-12的使用具有诱导已建立的SCK肿瘤排斥的协同作用，并指出此种结合在诱导一个有力的抗肿瘤免疫反应方面有一定的效果[8]。Sophie C观察到IL-4和B7-1在小鼠肿瘤细胞的共同表达可提高肿瘤的排斥及疫苗作用[9]。我们的结果亦支持这些发现。那么，为什么IL-12和B7-1结合能得到更好的治疗效果，我们推测IL-12和B7-1在诱发肿瘤免疫方面有着复杂的协同性，首先，表达B7-1的肿瘤细胞能够经CD28刺激CD4+T细胞，进而支持CD8+T细胞分化；其次，IL-12作为第二信号诱发Th1克隆细胞增生和IL-2R的表达及诱发T、NK细胞表面受体和粘附分子的表达；第三，IL-12增加IFN-γ和TNF-α产生，导致T细胞配体MHC Ⅰ和Ⅱ型分子表达的增加。这些理由使得他们能在免疫排斥的原始及效应阶段彼此有效协同。
EL-4/IL-12细胞对放射较为敏感，在预实验中证明经5 000 rad照射后，IL-12的分泌量下降较为明显(数据未显示)，其下降的理由尚不清楚，有待从细胞和分子水平澄清这一机制。本实验中应用未经照射处理的IL-4转基因瘤细胞，结果提示在基因免疫疗法的基础研究中应用活的癌细胞亦具有可行性。
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综上，我们的研究证明IL-12基因转导细胞可以诱发系统的免疫反应，导致肿瘤的部分根除，在这一实验系统中IL-12和B7-1转基因细胞的结合可协同增强治疗效果。基于这一研究基础，在临床实验前，须进一步验证临床动物模型对IL-12和B7-1诱发的抗肿瘤免疫作用及安全性。
参 考 文 献
1，Sling CL， Andreal L, John M, et al. Cytotoxic T lymphocyte response to autologous human squamous cell cancer of the lung: Epitope reconstitution with peptides extractcd from Hla-Aw 68. Cancer Res, 1994, 54: 2731
2，Lu L, Hsieh M, Oriss TB, et al. Generation of DC from mouse spleen cell culture in response to GM-CSF: Immunophenotypic and functional analysis. Immunolgy， 1995, 84: 27
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3，Sallustro F， Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dentritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 downregulated by tumor necrosis factor α. J Exp Med, 1994, 179: 1109
4，Inaba K, Wifmer-Pakce M, Hathcock KS, et al. The tissues distribution of the B7-2 costimulation in mice: Abundant expression on dentritic cells in situ and during mataration in vitro. J Exp Med, 1994, 180: 1849
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5，Townsend SE， Allison JP. Tumor rejection after direct costimulation of CD80+ T cells by B7-transfected melanoma cells. Science, 1993， 259: 368
6，Afponso LC, Scharton TM, Vieira LQ, et al. The adjuvant effect of intrrleukin 12 in a vaccine leishmania major. Science, 1994, 263: 235
7，Sumimoto H, Tani K, Nakazaki Y, et al. GM-CSF and B7-1 (CD80) costimularory signals cooperate in the induction of effective antitumor immunity in syngeneic mice. Hum Gene Ther, 1999 (submmited)
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8，Christiina MC, Maira W, Holly LK, et al. B7-1 and intericukin 12 synergistically induce effective antitumor immunity. Cancer Res， 1995， 55: 4980
9，Sophie C, Christian B, Bernd D, et al. Coexpression of interleukin 4 and B7.1 in murine tumor cells lead to improved tumor rejection and vaccine effect compared to single gene transfectants and a classical adjuvant. Hum Gene Ther, 1996, 7: 525
(1999-05-17收稿； 1999-11-08修回), 百拇医药