HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达
作者：李爱华 刘天承 田竟生
单位：李爱华：首都医科大学生化教研室；刘天承 田竟生：首都医科大学神经科学研究所
关键词：HSV1-tk基因；逆转录病毒载体；基因转移
首都医科大学学报990103 提要：通过DNA重组技术，将HSV1-tk基因片段重组到含有HSV1-tk启动子的pN2A型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组DNA，以磷酸钙法转染ψ2，PA317包装细胞后，经G418筛选，抗性克隆细胞上清能成功地感染NIH3T3，细胞系测定平均滴度为6.2×105 CFU/mL，最高可达1.5×106 CFU/mL。
中图分类号： Q784
The Construction of
, 百拇医药
pN2A-HSV1-tk and Expression
Li Aihua
Department of Biochemistry, Capital University of Medical Sciences
Liu Tiancheng, Tian Jingsheng
Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences
Abstract：The full-length HSV1-tk gene was inserted into retrovirus vector pN2A by DNA recombinant techniques. The plasmid pN2A-HSV1-tk was transfected into ψ2, PA317 packaging cell line by DNA-calcium phosphate coprecipitation. The G418 resistant clones were selected and their medium could infect NIH3T3 successfully and their average titer was 6.2×105 CFU/mL. The highest one reached 1.5×106 CFU/mL. The producer cell line will be used in gene therapy.
, 百拇医药
Key words: HSV1-tk gene; retrovirus vector; gene transfer
逆转录病毒介导的基因转移是80年代初发展起来的一种高效基因转移技术[1]。它借助逆转录病毒DNA载体与外源基因重组后，经包装细胞系包装，产生含外源基因的缺陷性重组逆转录病毒。该病毒可以成功地感染靶细胞，将外源基因整合于靶细胞染色体基因组中，并得到表达。从单纯疱疹病毒I型(HSV1)分离的胸苷激酶(TK)基因能提高肿瘤细胞对抗病毒药物羟甲基无环鸟苷(GCV)的转换，阻断增殖细胞的DNA合成，造成增殖细胞的“自杀性死亡”。所以，目前许多学者将HSV-tk基因整合到载体中，然后进入靶细胞达到治疗目的。美国Raffel等采用HSV1-tk结合GCV治疗脑瘤，有近期疗效。本研究的目的是构建用于脑胶质瘤治疗的HSV1-tk载体。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
XL1-blue菌株、NIH3T3、PA317、ψ2细胞系本所冻存。双拷贝逆转录病毒载体pN2A由中国医学科学院卢圣栋教授惠赠。质粒载体pHSV-106(7.760 kb，含有HSV1-tk基因的全长序列，具有氨苄青霉素抗性)购自Gibco/BRL公司。DNA限制性内切酶SnaBⅠ、NcoⅠ购自Promega公司。PvuⅡ、BglⅡ、T4DNA连接酶购自华美生物工程公司。
1.2 HSV1-tk重组逆转录病毒载体的构建
按图1、2构建策略的逆转录病毒质粒pN2A经大量扩增，扩增产物用SnaBⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，纯化9.678 kb片段，形成平末端的pN2A载体在牛小肠碱性磷酸酶作用下去磷酸化，再纯化。同样，质粒载体pHSV-106经大量扩增后，扩增产物用PvuⅡ和NcoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，纯化1.728 kb DNA片段，在Klenow片段(DNA聚合酶Ⅰ的大片段酶)的作用下将形成的5′突出末端完全填平，并纯化该目的DNA片段。然后将1.728 kb的目的DNA与9.678 kb的pN2A载体以摩尔比3∶1连接，转化感受态大肠杆菌XL1-blue后，快提转化子质粒DNA，根据相对分子质量大小及相应酶切图谱鉴定阳性重组子。
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图1 全长HSV1-tk基因(3.4 kb)的限制性酶切图谱
图2 pN2Atk的构建路径
1.3 重组载体包装及包装细胞克隆
大量制备重组逆转录病毒质粒、pN2A-HSV1-tk经纯化后，以常规DNA磷酸钙共沉淀法转染ψ2 24 h后，10%甘油HBS休克60 s(35 ℃)；3%CO2继续培养；24 h后取ψ2上清在37 ℃下转染病毒细胞PA317；5% CO2培养48 h后，消化，1∶50稀释，分瓶培养24 h。以400 mg/L G418进行筛选。2周后，挑取单克隆细胞，转入10 mL培养瓶中，加入300 mg/L G418维持培养，即为产病毒细胞。
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1.4 重组逆转录病毒滴度的测定
NIH3T3细胞以0.6×104 cm-2接种，24 h后去掉培养基，加入含产病毒培养上清10 μL及polybrene 8 mg/L的新培养液2 mL吸附3 h，再加培养基4 mL继续培养48 h后以1∶50稀释接种，再培养24 h，加入400 mg/L G418筛选。2周后，经10%甲醛固定，Giemsa染色计抗性细胞克隆数，并计算病毒滴度。
2 结果
2.1 逆转录病毒载体pN2Atk的重组鉴定
挑选7个转化菌落小量提取质粒，经BglⅡ酶切分析，结果显示：克隆3、5为正向插入重组质粒，克隆4为反向重组质粒，正向插入重组质粒大量提取后，酶切结果见图3。根据图谱预计：BglⅡ酶切，正向插入应得11.146 kb、260 bp，反向插入应得9.92 kb、1.486 kb。
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图3 酶切电泳图谱鉴定重组子
1 λDNA/HindⅢ相对分子质量标准 2 pN2A SnaBⅠ
3 克隆4 BglⅡ 4 正向插入质粒BglⅡ
5 正向插入质粒 6 λDNA E/H相对分子质量标准
2.2 重组产病毒细胞的构建及滴度测定
pN2Atk病毒质粒转染PA317后，出现大量G418抗性细胞克隆，单个克隆经扩增培养，收集上清，感染NIH3T3细胞，各组均出现G418抗性的阳性克隆。各产病毒细胞的平均滴度为6.2×105 CFU/mL，最高可达1.5×106 CFU/mL。这表明重组质粒转染PA317后，经该细胞内产生的外壳蛋白、核心蛋白与逆转录酶的组装，能产生具有感染靶细胞的能力，并能介导TK基因转移的重组逆转录病毒。
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产病毒细胞上清感染过的NIH3T3产生的G418阳性克隆，扩增后，取其上清再感染未经任何病毒感染的NIH3T3细胞，经G418筛选，无阳性克隆形成，表明产病毒细胞培养液中不存在辅助病毒。
3 讨论
近年来，自杀基因用于抑制肿瘤的研究已得到广泛的重视[2]。Chen等最近的研究表明[3]：HSV1-tk/GCV系统介导的旁观者效应，要求达到10%～20%的基因转移效率，而且HSV1-tk基因表达水平必须超过一定界限，才会引发明显的抗肿瘤作用。寻找合适的基因表达载体和转移方式以提高HSV1-tk的转移效率和表达水平，正成为脑肿瘤基因治疗基础研究的一个新热点。从载体安全性和基因转移效率两方面考虑，逆转录病毒载体仍是较为理想的载体，但主要问题在于：病毒滴度不高(一般低于106 CFU/mL)。解决的办法包括：改进载体和改进包装细胞。
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开展HSV1-tk/GCV治疗脑胶质瘤的研究，重要的是建立一个有效的载体。我们选用pN2A逆转录病毒，由于其3′LTR中含有剪切和加尾序列，插入的目的基因3′末端若含有剪切和加尾序列，就会严重干扰病毒RNA全长的转录水平，降低逆转录病毒载体的滴度和基因表达效率。因此在构建逆转录病毒载体 pN2ATK时，尽量删除了HSV1-tk基因3′末端的剪切和加尾序列。
pN2Atk载体的启动子为HSV1-tk基因自身启动子，属中等强度启动子，但在某种特定的靶细胞内，启动子的强弱顺序会有所改变，是因为不同的启动子引导基因转录的效率会受到靶细胞内转录调控反式因子的种类和数量多少的影响。在逆转录病毒载体中，启动子处在不同的位置也会影响其强度。
另有文献报道，用磷酸钙共沉淀法将载体DNA转染单嗜性包装细胞如ψ2，再用其病毒上清感染双嗜性包装细胞如PA317、CRIP等，被称为“乒乓感染”，可使病毒滴度提高10～20倍[4]。按照这种方法，测得病毒平均滴度为6.2×105 CFU/mL，最高可达1.5×106 CFU/mL，对于开展HSV1-tk基因/GCV系统基因治疗脑肿瘤的研究提供了实验基础。
, 百拇医药
参考文献
1 Miller A D, Buttimore C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol, 1986, 6(8):2895
2 Karp J E. New directions in molecular medicine. Cancer Res, 1994, 54:653
3 Chen C Y. Effect of herpes simplex virus thymidine kinase expression levels on ganciclovir-mediated cytotoxicity and the “bystander effect”. Hum Gene Ther, 1995, 6:1467～1476
4 侯云德.动物病毒载体与基因治疗的现状和前景.生物工程进展,1994,14:19:1～9
收稿日期：1998-03-30, 百拇医药
单位：李爱华：首都医科大学生化教研室；刘天承 田竟生：首都医科大学神经科学研究所
关键词：HSV1-tk基因；逆转录病毒载体；基因转移
首都医科大学学报990103 提要：通过DNA重组技术，将HSV1-tk基因片段重组到含有HSV1-tk启动子的pN2A型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组DNA，以磷酸钙法转染ψ2，PA317包装细胞后，经G418筛选，抗性克隆细胞上清能成功地感染NIH3T3，细胞系测定平均滴度为6.2×105 CFU/mL，最高可达1.5×106 CFU/mL。
中图分类号： Q784
The Construction of
, 百拇医药
pN2A-HSV1-tk and Expression
Li Aihua
Department of Biochemistry, Capital University of Medical Sciences
Liu Tiancheng, Tian Jingsheng
Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences
Abstract：The full-length HSV1-tk gene was inserted into retrovirus vector pN2A by DNA recombinant techniques. The plasmid pN2A-HSV1-tk was transfected into ψ2, PA317 packaging cell line by DNA-calcium phosphate coprecipitation. The G418 resistant clones were selected and their medium could infect NIH3T3 successfully and their average titer was 6.2×105 CFU/mL. The highest one reached 1.5×106 CFU/mL. The producer cell line will be used in gene therapy.
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Key words: HSV1-tk gene; retrovirus vector; gene transfer
逆转录病毒介导的基因转移是80年代初发展起来的一种高效基因转移技术[1]。它借助逆转录病毒DNA载体与外源基因重组后，经包装细胞系包装，产生含外源基因的缺陷性重组逆转录病毒。该病毒可以成功地感染靶细胞，将外源基因整合于靶细胞染色体基因组中，并得到表达。从单纯疱疹病毒I型(HSV1)分离的胸苷激酶(TK)基因能提高肿瘤细胞对抗病毒药物羟甲基无环鸟苷(GCV)的转换，阻断增殖细胞的DNA合成，造成增殖细胞的“自杀性死亡”。所以，目前许多学者将HSV-tk基因整合到载体中，然后进入靶细胞达到治疗目的。美国Raffel等采用HSV1-tk结合GCV治疗脑瘤，有近期疗效。本研究的目的是构建用于脑胶质瘤治疗的HSV1-tk载体。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
XL1-blue菌株、NIH3T3、PA317、ψ2细胞系本所冻存。双拷贝逆转录病毒载体pN2A由中国医学科学院卢圣栋教授惠赠。质粒载体pHSV-106(7.760 kb，含有HSV1-tk基因的全长序列，具有氨苄青霉素抗性)购自Gibco/BRL公司。DNA限制性内切酶SnaBⅠ、NcoⅠ购自Promega公司。PvuⅡ、BglⅡ、T4DNA连接酶购自华美生物工程公司。
1.2 HSV1-tk重组逆转录病毒载体的构建
按图1、2构建策略的逆转录病毒质粒pN2A经大量扩增，扩增产物用SnaBⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，纯化9.678 kb片段，形成平末端的pN2A载体在牛小肠碱性磷酸酶作用下去磷酸化，再纯化。同样，质粒载体pHSV-106经大量扩增后，扩增产物用PvuⅡ和NcoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，纯化1.728 kb DNA片段，在Klenow片段(DNA聚合酶Ⅰ的大片段酶)的作用下将形成的5′突出末端完全填平，并纯化该目的DNA片段。然后将1.728 kb的目的DNA与9.678 kb的pN2A载体以摩尔比3∶1连接，转化感受态大肠杆菌XL1-blue后，快提转化子质粒DNA，根据相对分子质量大小及相应酶切图谱鉴定阳性重组子。
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图1 全长HSV1-tk基因(3.4 kb)的限制性酶切图谱
图2 pN2Atk的构建路径
1.3 重组载体包装及包装细胞克隆
大量制备重组逆转录病毒质粒、pN2A-HSV1-tk经纯化后，以常规DNA磷酸钙共沉淀法转染ψ2 24 h后，10%甘油HBS休克60 s(35 ℃)；3%CO2继续培养；24 h后取ψ2上清在37 ℃下转染病毒细胞PA317；5% CO2培养48 h后，消化，1∶50稀释，分瓶培养24 h。以400 mg/L G418进行筛选。2周后，挑取单克隆细胞，转入10 mL培养瓶中，加入300 mg/L G418维持培养，即为产病毒细胞。
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1.4 重组逆转录病毒滴度的测定
NIH3T3细胞以0.6×104 cm-2接种，24 h后去掉培养基，加入含产病毒培养上清10 μL及polybrene 8 mg/L的新培养液2 mL吸附3 h，再加培养基4 mL继续培养48 h后以1∶50稀释接种，再培养24 h，加入400 mg/L G418筛选。2周后，经10%甲醛固定，Giemsa染色计抗性细胞克隆数，并计算病毒滴度。
2 结果
2.1 逆转录病毒载体pN2Atk的重组鉴定
挑选7个转化菌落小量提取质粒，经BglⅡ酶切分析，结果显示：克隆3、5为正向插入重组质粒，克隆4为反向重组质粒，正向插入重组质粒大量提取后，酶切结果见图3。根据图谱预计：BglⅡ酶切，正向插入应得11.146 kb、260 bp，反向插入应得9.92 kb、1.486 kb。
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图3 酶切电泳图谱鉴定重组子
1 λDNA/HindⅢ相对分子质量标准 2 pN2A SnaBⅠ
3 克隆4 BglⅡ 4 正向插入质粒BglⅡ
5 正向插入质粒 6 λDNA E/H相对分子质量标准
2.2 重组产病毒细胞的构建及滴度测定
pN2Atk病毒质粒转染PA317后，出现大量G418抗性细胞克隆，单个克隆经扩增培养，收集上清，感染NIH3T3细胞，各组均出现G418抗性的阳性克隆。各产病毒细胞的平均滴度为6.2×105 CFU/mL，最高可达1.5×106 CFU/mL。这表明重组质粒转染PA317后，经该细胞内产生的外壳蛋白、核心蛋白与逆转录酶的组装，能产生具有感染靶细胞的能力，并能介导TK基因转移的重组逆转录病毒。
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产病毒细胞上清感染过的NIH3T3产生的G418阳性克隆，扩增后，取其上清再感染未经任何病毒感染的NIH3T3细胞，经G418筛选，无阳性克隆形成，表明产病毒细胞培养液中不存在辅助病毒。
3 讨论
近年来，自杀基因用于抑制肿瘤的研究已得到广泛的重视[2]。Chen等最近的研究表明[3]：HSV1-tk/GCV系统介导的旁观者效应，要求达到10%～20%的基因转移效率，而且HSV1-tk基因表达水平必须超过一定界限，才会引发明显的抗肿瘤作用。寻找合适的基因表达载体和转移方式以提高HSV1-tk的转移效率和表达水平，正成为脑肿瘤基因治疗基础研究的一个新热点。从载体安全性和基因转移效率两方面考虑，逆转录病毒载体仍是较为理想的载体，但主要问题在于：病毒滴度不高(一般低于106 CFU/mL)。解决的办法包括：改进载体和改进包装细胞。
, http://www.100md.com
开展HSV1-tk/GCV治疗脑胶质瘤的研究，重要的是建立一个有效的载体。我们选用pN2A逆转录病毒，由于其3′LTR中含有剪切和加尾序列，插入的目的基因3′末端若含有剪切和加尾序列，就会严重干扰病毒RNA全长的转录水平，降低逆转录病毒载体的滴度和基因表达效率。因此在构建逆转录病毒载体 pN2ATK时，尽量删除了HSV1-tk基因3′末端的剪切和加尾序列。
pN2Atk载体的启动子为HSV1-tk基因自身启动子，属中等强度启动子，但在某种特定的靶细胞内，启动子的强弱顺序会有所改变，是因为不同的启动子引导基因转录的效率会受到靶细胞内转录调控反式因子的种类和数量多少的影响。在逆转录病毒载体中，启动子处在不同的位置也会影响其强度。
另有文献报道，用磷酸钙共沉淀法将载体DNA转染单嗜性包装细胞如ψ2，再用其病毒上清感染双嗜性包装细胞如PA317、CRIP等，被称为“乒乓感染”，可使病毒滴度提高10～20倍[4]。按照这种方法，测得病毒平均滴度为6.2×105 CFU/mL，最高可达1.5×106 CFU/mL，对于开展HSV1-tk基因/GCV系统基因治疗脑肿瘤的研究提供了实验基础。
, 百拇医药
参考文献
1 Miller A D, Buttimore C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol, 1986, 6(8):2895
2 Karp J E. New directions in molecular medicine. Cancer Res, 1994, 54:653
3 Chen C Y. Effect of herpes simplex virus thymidine kinase expression levels on ganciclovir-mediated cytotoxicity and the “bystander effect”. Hum Gene Ther, 1995, 6:1467～1476
4 侯云德.动物病毒载体与基因治疗的现状和前景.生物工程进展,1994,14:19:1～9
收稿日期：1998-03-30, 百拇医药