长春新碱对体外培养成骨细胞的影响
作者：朱建民 方浩 陈新刚 曾明 金蔚芳 王洪复
单位：朱建民(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；方浩(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；陈新刚(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；曾明(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；金蔚芳(上海医科大学骨代谢研究室，上海 200032)；王洪复(上海医科大学骨代谢研究室，上海 20
关键词：长春新碱；成骨细胞；细胞培养；骨折愈合
临床骨科杂志000301
【摘要】 目的 观察抗癌药物长春新碱对体外培养成骨细胞的作用。方法 在新生SD大鼠头颅骨次代成骨细胞(OB2)培养液中分别加入不同浓度(10-1～10-9g/L)长春新碱,分别观察OB2的增殖功能(用波长570 nm处OD值表示)、分化功能[用碱性磷酸酶(ALP)活性表示]和矿化功能(用矿化结节数/视野表示)。结果 OD值实验组为0.091±0.005～0.297±0.044，对照组为 0.347±0.035;ALP(U/g蛋白质)活性实验组为77±12,对照组为81±4;矿化结节数/视野(个)实验组为1.0±0.816，对照组为1.5±1.0。结论 从绝对数来看,各浓度长春新碱对OB2的增殖、分化和矿化功能均具抑制作用。与对照组比较,长春新碱对OB2增殖功能的抑制作用具有极显著性意义(P<0.01)。
, 百拇医药
【中图分类号】R979.19;R364.3 【文献标识码】 A
【文章编号】1008-0287(2000)03-0161-03
Effects of vincristine on osteoblasts in vitro
Zhu Jianmin, Fang Hao, Chen Xingang, Zeng Ming, Jin Weifang, Wang Hongfu
(Dept of Orthopaedics, Shanghai 8th Hospital, Shanghai 200233)
【Abstract】 Objective To observe the effects of vincristine,an anti-cancer drug on osteoblasts in vitro. Methods The culture medium with different vincristine concentrations(10-1～10-9 g/L) and the second generation of osteoblasts(OB2) from the skull of newborn SD rat were mixed for the observation about the proliferation respectively (OD value at wavelength 570 nm), the differentiation (ALP activity) and the mineralization(mineralized nodus/field of vision) of the OB2. Results The OD value of experimental group was 0.091±0.005～0.297±0.044, and that of control group 0.347±0.035; the ALP activity of experimental group was 77 U/g±12 U/g proteins,and that of control group 81 U/g±4 U/g proteins and the mineralized nodus of experimental group was 1.0±0.816, and that of control group 1.5±1.0. Conclusion The proliferation, differentiation and mineralization of the OB2 were separately inhibited by vincristine. In comparision with control group, the inhibited proliferation of the OB2 was the most remarkable (P<0.01).
, 百拇医药
【Key words】vincristine; osteoblasts; cell culture; fracture healing
临床上肿瘤患者骨折常出现延迟愈合或不愈合的异常现象〔1,2〕。 动物实验研究显示,长春新碱可延长骨折愈合的时间,抑制碱性磷酸酶(ALP)活性,并延长骨折愈合过程中ALP高峰期出现的时间〔3〕。本研究旨在进一步观察长春新碱对体外培养成骨细胞的影响,从不同层面阐述抗癌药长春新碱对骨折愈合的影响及其机制。
1 材料与方法
1.1 药物 选用广州明兴制药厂生产的注射用冻干粉剂硫酸长春新碱。批准号:粤卫药准字(82)第A3-114号；批号:950710；规格:1 mg×10支。用生理盐水将其浓度稀释至10 g/L,再用细胞培养液分别稀释至10-1～10-9g/L不同浓度。
, 百拇医药
1.2 细胞培养 取新生(出生24 h内)SD大鼠头颅骨,用0.25%胰蛋白酶预消化15～20 min,以清除纤维组织细胞。再用0.1% Ⅱ型胶原酶，在37℃环境中振荡(每分钟50次左右)消化60 min,以1 000 r*min-1离心收集成骨细胞。将分离收集的成骨细胞以104个/cm2的密度接种于培养瓶中,置5% CO2、37℃培养箱培养。24 h可见细胞贴壁生长，胞浆开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔48 h替换培养液。于接种后第4天(半汇合)取第2代成骨细胞(OB2)培养，先以0.25%胰蛋白酶使贴壁细胞消化松解，轻摇细胞即脱壁。以104个/cm2的密度移入含培养液的新培养瓶继续培养，加入不同浓度长春新碱作药效试验。采用MEM(minimum eagle medium)培养液，内含10%小牛血清、青霉素等，新鲜配置，冷冻保存〔4〕。
1.3 观察指标
, 百拇医药
1.3.1 OB2增殖功能测定 OB2以6×103个/孔密度接种于24孔培养板上,24 h后换入含不同浓度药物的培养液中,于加药后72 h用MTT{[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]}方法在酶标仪上进行测试。测试条件为：①测定时换成无血清培养液；②测定波长为570 nm；③37℃、5% CO2，MTT孵育4 h；④MTT 50μl(5 g/L)，检测细胞数1×106，光密度(OD)值与活细胞数相关系数r=0.970 1。以波长570 nm处的OD值表示OB2增殖功能,结果与对照组比较〔4〕。
1.3.2 OB2分化功能测定 OB2以2×104个/孔密度接种于24孔培养板上,24 h后换入含敏感浓度药物的培养液中,每48 h更换培养液1次,待汇合后用对硝基苯磷酸盐(PNPP)法和分光光度计测定细胞溶液中的ALP活性(条件为pH 10.5，37℃，波长为405 nm);再用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,以U/g蛋白质表示ALP活性,结果与对照组比较。ALP活性是OB2分化功能指标〔4〕。
, 百拇医药
1.3.3 OB2矿化功能测定 OB2以2×104个/孔密度接种于6孔Costor培养板上,10天后换入含敏感浓度药物的培养液中,14天后用90%乙醇固定,0.1%茜素红染色。以橘红色结节、边界清晰、>200 μm为标准。在40倍光镜下作矿化结节计数,结果与对照组比较〔4〕。
1.4 对照组设计 采用去离子水设定药物空白对照组。
1.5 统计学方法 数据处理采用
±s表示,组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 对OB2增殖功能的作用 当长春新碱浓度为10-1g/L时,波长570 nm处的OD值为0.091±0.005;浓度为10-3 g/L时,OD值为0.141±0.010;浓度为10-5 g/L时,OD值为0.196±0.013;浓度为10-7 g/L时,OD值为0.297±0.044。对照组OD值为0.347±0.035。从绝对值来看,长春新碱10-1～10-7 g/L各浓度组均抑制OB2增殖。与对照组比较，长春新碱10-1～10-5 g/L浓度组的抑制作用具有极显著性意义(P<0.01,n=6)。当浓度稀释至10-7 g/L时,则无显著性意义(P>0.05,n=6)。
, 百拇医药
2.2 对OB2分化功能的作用 参考不同浓度长春新碱对OB2增殖功能的作用结果,选取一个敏感浓度作OB2 ALP活性实验研究。结果显示,当取长春新碱敏感浓度10-5 g/L时,ALP活性(U/g蛋白质)为77±12，对照组为81±4。从绝对数来看，敏感浓度的长春新碱对OB2分化功能具有一定的抑制作用。与对照组比较则无显著性意义(P>0.05,n=6)。
2.3 对OB2矿化功能的作用 参考不同浓度长春新碱对OB2增殖功能的作用结果,选取一个敏感浓度作OB2 矿化功能实验研究。结果显示,当取长春新碱敏感浓度10-5 g/L时,矿化结节数/视野(个)为1.0±0.8，对照组为1.5±1.0。从绝对数来看,敏感浓度的长春新碱对OB2矿化功能具有一定的抑制作用。与对照组比较则无显著性意义(P>0.05,n=6)。
, 百拇医药
3 讨论
肿瘤患者骨折的异常愈合与抗癌药物的使用有关。长春新碱是一类作用于细胞增殖周期中的M期(有丝分裂期)的特异性抗癌药物，可完全抑制细胞内微管蛋白的聚合,阻断微管的形成。微管除了具有维持细胞形态的作用外,它还是构成纺锤体的主要成份。当微管的功能被抑制时,纺锤体的功能也将受到破坏,最终使细胞分裂停止于分裂中期〔5〕。由此推测,长春新碱对OB2的作用也不例外。本研究显示,虽然从绝对数来看，长春新碱各浓度对OB2的增殖、分化和矿化功能均具抑制作用,但主要抑制OB2的增殖功能(P<0.01),而对OB2分化和矿化功能的抑制作用很小，可能是继发性的结果(P>0.05)，由此能较好地解释肿瘤患者骨折延迟愈合或不愈合的原因及机制。
成骨细胞是骨形成细胞，合成和分泌I型胶原和多种非胶原蛋白质，在全身和局部细胞因子调节下，分泌类骨质和碱性磷酸酶等促矿化物质，促进新骨形成。因此，成骨细胞功能与骨折愈合效率密切相关。本研究表明，长春新碱对成骨细胞有明显抑制作用，因而延缓骨折愈合过程中的新骨形成。由此可较好地解释肿瘤患者骨折延迟愈合或不愈合的细胞机制。
, http://www.100md.com
基金项目：上海市徐汇区卫生局科研基金资助项目(编号：99011)
作者简介：朱建民(1955-)，男，主任医师，科主任。研究方向：骨愈合
0032)
参考文献
1，Healey JH,Zimmerman PA, McDonnell JM et al. Percutaneous bone marrow grafting of delayed union and nonunion in cancer patients[J]. Clin Orthop， 1991;(256):281～293
2，朱建民, 金宗达. 经皮自体骨髓移植治疗骨不连和骨缺损[J]. 中华外科杂志， 1995;33(9):574～576
3，鲍建瑛,朱建民. 长春新碱对骨折愈合的影响[J]. 上海医学， 1999;22(9):555～556
4，王洪复，金尉芳，高建军. 骨质疏松症防治药物的体外细胞药效评价[J]. 中国骨质疏松杂志， 1999;5(2):58～62
5，王肇炎,韩 锐 主编.肿瘤药物治疗[M]. 第2版， 北京:人民出版社, 1983：93～95
2000-01-17收稿，2000-06-26修回, 百拇医药
单位：朱建民(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；方浩(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；陈新刚(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；曾明(上海市第八人民医院骨科，上海 200233)；金蔚芳(上海医科大学骨代谢研究室，上海 200032)；王洪复(上海医科大学骨代谢研究室，上海 20
关键词：长春新碱；成骨细胞；细胞培养；骨折愈合
临床骨科杂志000301
【摘要】 目的 观察抗癌药物长春新碱对体外培养成骨细胞的作用。方法 在新生SD大鼠头颅骨次代成骨细胞(OB2)培养液中分别加入不同浓度(10-1～10-9g/L)长春新碱,分别观察OB2的增殖功能(用波长570 nm处OD值表示)、分化功能[用碱性磷酸酶(ALP)活性表示]和矿化功能(用矿化结节数/视野表示)。结果 OD值实验组为0.091±0.005～0.297±0.044，对照组为 0.347±0.035;ALP(U/g蛋白质)活性实验组为77±12,对照组为81±4;矿化结节数/视野(个)实验组为1.0±0.816，对照组为1.5±1.0。结论 从绝对数来看,各浓度长春新碱对OB2的增殖、分化和矿化功能均具抑制作用。与对照组比较,长春新碱对OB2增殖功能的抑制作用具有极显著性意义(P<0.01)。
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【中图分类号】R979.19;R364.3 【文献标识码】 A
【文章编号】1008-0287(2000)03-0161-03
Effects of vincristine on osteoblasts in vitro
Zhu Jianmin, Fang Hao, Chen Xingang, Zeng Ming, Jin Weifang, Wang Hongfu
(Dept of Orthopaedics, Shanghai 8th Hospital, Shanghai 200233)
【Abstract】 Objective To observe the effects of vincristine,an anti-cancer drug on osteoblasts in vitro. Methods The culture medium with different vincristine concentrations(10-1～10-9 g/L) and the second generation of osteoblasts(OB2) from the skull of newborn SD rat were mixed for the observation about the proliferation respectively (OD value at wavelength 570 nm), the differentiation (ALP activity) and the mineralization(mineralized nodus/field of vision) of the OB2. Results The OD value of experimental group was 0.091±0.005～0.297±0.044, and that of control group 0.347±0.035; the ALP activity of experimental group was 77 U/g±12 U/g proteins,and that of control group 81 U/g±4 U/g proteins and the mineralized nodus of experimental group was 1.0±0.816, and that of control group 1.5±1.0. Conclusion The proliferation, differentiation and mineralization of the OB2 were separately inhibited by vincristine. In comparision with control group, the inhibited proliferation of the OB2 was the most remarkable (P<0.01).
, 百拇医药
【Key words】vincristine; osteoblasts; cell culture; fracture healing
临床上肿瘤患者骨折常出现延迟愈合或不愈合的异常现象〔1,2〕。 动物实验研究显示,长春新碱可延长骨折愈合的时间,抑制碱性磷酸酶(ALP)活性,并延长骨折愈合过程中ALP高峰期出现的时间〔3〕。本研究旨在进一步观察长春新碱对体外培养成骨细胞的影响,从不同层面阐述抗癌药长春新碱对骨折愈合的影响及其机制。
1 材料与方法
1.1 药物 选用广州明兴制药厂生产的注射用冻干粉剂硫酸长春新碱。批准号:粤卫药准字(82)第A3-114号；批号:950710；规格:1 mg×10支。用生理盐水将其浓度稀释至10 g/L,再用细胞培养液分别稀释至10-1～10-9g/L不同浓度。
, 百拇医药
1.2 细胞培养 取新生(出生24 h内)SD大鼠头颅骨,用0.25%胰蛋白酶预消化15～20 min,以清除纤维组织细胞。再用0.1% Ⅱ型胶原酶，在37℃环境中振荡(每分钟50次左右)消化60 min,以1 000 r*min-1离心收集成骨细胞。将分离收集的成骨细胞以104个/cm2的密度接种于培养瓶中,置5% CO2、37℃培养箱培养。24 h可见细胞贴壁生长，胞浆开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔48 h替换培养液。于接种后第4天(半汇合)取第2代成骨细胞(OB2)培养，先以0.25%胰蛋白酶使贴壁细胞消化松解，轻摇细胞即脱壁。以104个/cm2的密度移入含培养液的新培养瓶继续培养，加入不同浓度长春新碱作药效试验。采用MEM(minimum eagle medium)培养液，内含10%小牛血清、青霉素等，新鲜配置，冷冻保存〔4〕。
1.3 观察指标
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1.3.1 OB2增殖功能测定 OB2以6×103个/孔密度接种于24孔培养板上,24 h后换入含不同浓度药物的培养液中,于加药后72 h用MTT{[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]}方法在酶标仪上进行测试。测试条件为：①测定时换成无血清培养液；②测定波长为570 nm；③37℃、5% CO2，MTT孵育4 h；④MTT 50μl(5 g/L)，检测细胞数1×106，光密度(OD)值与活细胞数相关系数r=0.970 1。以波长570 nm处的OD值表示OB2增殖功能,结果与对照组比较〔4〕。
1.3.2 OB2分化功能测定 OB2以2×104个/孔密度接种于24孔培养板上,24 h后换入含敏感浓度药物的培养液中,每48 h更换培养液1次,待汇合后用对硝基苯磷酸盐(PNPP)法和分光光度计测定细胞溶液中的ALP活性(条件为pH 10.5，37℃，波长为405 nm);再用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,以U/g蛋白质表示ALP活性,结果与对照组比较。ALP活性是OB2分化功能指标〔4〕。
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1.3.3 OB2矿化功能测定 OB2以2×104个/孔密度接种于6孔Costor培养板上,10天后换入含敏感浓度药物的培养液中,14天后用90%乙醇固定,0.1%茜素红染色。以橘红色结节、边界清晰、>200 μm为标准。在40倍光镜下作矿化结节计数,结果与对照组比较〔4〕。
1.4 对照组设计 采用去离子水设定药物空白对照组。
1.5 统计学方法 数据处理采用
±s表示,组间比较采用t检验。2 结果
2.1 对OB2增殖功能的作用 当长春新碱浓度为10-1g/L时,波长570 nm处的OD值为0.091±0.005;浓度为10-3 g/L时,OD值为0.141±0.010;浓度为10-5 g/L时,OD值为0.196±0.013;浓度为10-7 g/L时,OD值为0.297±0.044。对照组OD值为0.347±0.035。从绝对值来看,长春新碱10-1～10-7 g/L各浓度组均抑制OB2增殖。与对照组比较，长春新碱10-1～10-5 g/L浓度组的抑制作用具有极显著性意义(P<0.01,n=6)。当浓度稀释至10-7 g/L时,则无显著性意义(P>0.05,n=6)。
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2.2 对OB2分化功能的作用 参考不同浓度长春新碱对OB2增殖功能的作用结果,选取一个敏感浓度作OB2 ALP活性实验研究。结果显示,当取长春新碱敏感浓度10-5 g/L时,ALP活性(U/g蛋白质)为77±12，对照组为81±4。从绝对数来看，敏感浓度的长春新碱对OB2分化功能具有一定的抑制作用。与对照组比较则无显著性意义(P>0.05,n=6)。
2.3 对OB2矿化功能的作用 参考不同浓度长春新碱对OB2增殖功能的作用结果,选取一个敏感浓度作OB2 矿化功能实验研究。结果显示,当取长春新碱敏感浓度10-5 g/L时,矿化结节数/视野(个)为1.0±0.8，对照组为1.5±1.0。从绝对数来看,敏感浓度的长春新碱对OB2矿化功能具有一定的抑制作用。与对照组比较则无显著性意义(P>0.05,n=6)。
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3 讨论
肿瘤患者骨折的异常愈合与抗癌药物的使用有关。长春新碱是一类作用于细胞增殖周期中的M期(有丝分裂期)的特异性抗癌药物，可完全抑制细胞内微管蛋白的聚合,阻断微管的形成。微管除了具有维持细胞形态的作用外,它还是构成纺锤体的主要成份。当微管的功能被抑制时,纺锤体的功能也将受到破坏,最终使细胞分裂停止于分裂中期〔5〕。由此推测,长春新碱对OB2的作用也不例外。本研究显示,虽然从绝对数来看，长春新碱各浓度对OB2的增殖、分化和矿化功能均具抑制作用,但主要抑制OB2的增殖功能(P<0.01),而对OB2分化和矿化功能的抑制作用很小，可能是继发性的结果(P>0.05)，由此能较好地解释肿瘤患者骨折延迟愈合或不愈合的原因及机制。
成骨细胞是骨形成细胞，合成和分泌I型胶原和多种非胶原蛋白质，在全身和局部细胞因子调节下，分泌类骨质和碱性磷酸酶等促矿化物质，促进新骨形成。因此，成骨细胞功能与骨折愈合效率密切相关。本研究表明，长春新碱对成骨细胞有明显抑制作用，因而延缓骨折愈合过程中的新骨形成。由此可较好地解释肿瘤患者骨折延迟愈合或不愈合的细胞机制。
, http://www.100md.com
基金项目：上海市徐汇区卫生局科研基金资助项目(编号：99011)
作者简介：朱建民(1955-)，男，主任医师，科主任。研究方向：骨愈合
0032)
参考文献
1，Healey JH,Zimmerman PA, McDonnell JM et al. Percutaneous bone marrow grafting of delayed union and nonunion in cancer patients[J]. Clin Orthop， 1991;(256):281～293
2，朱建民, 金宗达. 经皮自体骨髓移植治疗骨不连和骨缺损[J]. 中华外科杂志， 1995;33(9):574～576
3，鲍建瑛,朱建民. 长春新碱对骨折愈合的影响[J]. 上海医学， 1999;22(9):555～556
4，王洪复，金尉芳，高建军. 骨质疏松症防治药物的体外细胞药效评价[J]. 中国骨质疏松杂志， 1999;5(2):58～62
5，王肇炎,韩 锐 主编.肿瘤药物治疗[M]. 第2版， 北京:人民出版社, 1983：93～95
2000-01-17收稿，2000-06-26修回, 百拇医药