白介素-1受体相关激酶-2和磷脂酰肌醇 3-激酶协同调控白介素-1诱导的NF-κB 活化
作者：郭甫坤 李亦蕾 吴曙光
单位：郭甫坤(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)；李亦蕾(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)；吴曙光(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)
关键词：白细胞介素1；白介素1受体相关激酶-2；磷脂酰肌醇 3-激酶；反义寡核苷酸；NF-Kappa κB
第一军医大学学报000202 摘要：目的 研究白介素1受体相关激酶2(IRAK-2)和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI 3-激酶)在白介素-1(IL-1)诱导核因子- κB(NF-κB)活化中的作用。方法 Lipofectin介导反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸转染HepG2细胞后，用逆转录PCR法检测IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶 mRNA表达水平，以Sandwich ELISA法检测NF-κB的活化。结果 (1) 反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别抑制IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶mRNA的表达；(2)反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸部分抑制NF-κB活化；(3)与反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比，反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染HepG2细胞对NF-κB的抑制作用明显增强。结论 在HepG2细胞中，IRAK-2和PI 3-激酶都调控NF-κB活化但都不能完全激活NF-κB，IRAK-2和PI 3-激酶在调控NF-κB 活化时有协同作用。
, 百拇医药
中图分类号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0113-04
Interleukin-1 receptor-associated kinase-2 and phosphatidylinositol 3-kinase synergetically activate NF-κB
GUO Fu-kun，LI Yi-lei，WU Shu-guang
(Institute of Pharmaceutic Sciences, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To investigate the role of interleukin-1 receptor-associated kinase-2 (IRAK-2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) in interleukin-1 (IL-1)-induced nuclear factor-κB (NF-κB) activation. Methods Phosphorothioate oligonucleotides (ODN) were designed antisense to IRAK-2 or PI 3-kinase. Antisense IRAK-2 ODN or antisense PI 3-kinase ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured HepG2 cells. IRAK-2 mRNA and PI 3-kinase mRNA expression was assayed by semiquantitative reverse transcription-PCR. The levels of NF-κB were measured by sandwich ELISA. Results Antisense IRAK-2 ODN and antisense PI 3-kinase ODN blocked IRAK-2 and PI 3-kinase expression, respectively. As a result, antisense IRAK-2 ODN or antisense PI 3-kinase ODN inhibited IL-1-induced NF-κB activation in a dose (1 8 μg)- and time (5 24 h)- dependent fashion. When the cells were treated with antisense IRAK-2 ODN 4 μg or antisense PI 3-kinase ODN 2μg for 8 h, the maximum inhibition rate was (54.5±0.2)% and (42.8±1.3)%, respectively. However, since the NF-κB activity was still much higher than that of basal group (P<0.01), the inhibition was incomplete. Cotransfection of antisense IRAK-2 ODN 4μg with antisense PI 3-kinase ODN 2μg resulted in an additive inhibition of NF-κB-activation by (80.3±0.5)%. Conclusions In HepG2 cells, either IRAK-2 or PI 3-kinase is necessary but not sufficient to fully activate NF-κB. IRAK-2 regulates IL-1-stimulated NF-κB activation in cooperation with PI 3-kinase.
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Key words: interleukin-1; interleukin-1 receptor associated kinase-2; phosphatidylinositol 3-kinase; antisense oligonucleotide; nuclear factor-κB
白介素-1(IL-1)是一种在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。越来越多的研究表明，IL-1的生物学效应主要由转录因子核因子-κB (NF-κB)调控[1]。因此，阐明IL-1激活NF-κB的信号机制具有重要的理论和临床应用价值。
IL-1刺激信号由其I型受体(IL-1RI)转导。与大多数细胞因子受体不同，IL-1RI没有内在的蛋白激酶活性[2]，因而势必需要结合细胞浆蛋白激酶来传导信号。IL-1受体相关激酶-2(IRAK-2)和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI 3-激酶)就属于这样的蛋白激酶。研究表明，IRAK-2和PI 3-激酶都能激活NF-κB[2、3]，但目前还不清楚它们是否协同作用，本文对此进行了探讨。
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1 材料与方法
1.1 细胞系和试剂
HepG2细胞从ATCC公司购买。DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体 ( 抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基羧基末端 ) 和兔NF-κB p65 亚基特异性抗体 ( 抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基氨基末端 ) 由美国Santa CruZ 生物技术公司生产。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记 IgG购自河南华美生物工程公司。SV总RNA 分离试剂盒和逆转录-PCR (RT-PCR) 试剂盒为Promega 公司产品。
1.2 细胞培养[2]
HepG2细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基于37℃、5 % CO2条件下培养至密度达90% 以上。
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1.3 寡核苷酸的序列及合成
反义IRAK-2 寡核苷酸序列：5’-GTAGATGTAGCAG
GCCAT-3’；正义IRAK-2 寡核苷酸序列：5’-ATGGCCTGC
TACATCTAC-3’。反义PI 3-激酶寡核苷酸序列：5’-CTCAGCACTCATGTTTGC-3’；正义PI 3-激酶寡核苷酸序列：5’-GCAAACATGAGTGCTGAG-3’。寡核苷酸 的5’ 端和3’端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰，由上海生工生物工程有限公司合成。正义寡核苷酸序列与靶序列一致，反义寡核苷酸序列与靶序列互补。
1.4 Lipofectin 介导寡核苷酸转染HepG2细胞
参照lipofectin说明书操作。
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1.5 RT-PCR法测定IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶mRNA表达水平细胞用IL-1β 100 U/ml 刺激30 min， 洗去IL-1β， IRAK-2实验组分别加入正义IRAK-2 寡核苷酸4 μg和反义IRAK-2 寡核苷酸4μg；PI 3-激酶实验组分别加入正义PI 3-激酶寡核苷酸 2μg 和反义PI 3-激酶寡核苷酸2μg，各实验组均设立对照。细胞与寡核苷酸孵育8 h，提取总RNA，RT-PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++图像分析软件VILBER LOURMAT公司)定量。IRAK-2 5’ 端引物为：5’-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3’；3’端引物为：5’-CCAGCACAGGTAA GACATTGG-3’。PI 3-激酶5’端引物为：5’-GGTACCAGTACAGAGCGCTGTA-3’；3’端引物为：5’-CGGAGCTTTGTACTTCTGGAGC-3’。内参照β-actin 5’端引物为 5’-TGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；3’端引物为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(由上海生工生物工程有限公司合成)。重复实验3次。
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1.6 Sandwich ELISA法测定NF-κB
按Rovin等[4]的方法提取细胞核蛋白，用Sandwich ELISA法测定NF-κB[5]。重复实验3次。
1.7数据分析
实验数据以
±s表示，采用t检验进行统计学分析。
图 1 A 反义IRAK-2 寡核苷酸对IRAK-2 表达的抑制 B 反义PI 3-激酶寡核苷酸对PI 3-激酶表达的抑制
Fig.1 A. Effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 expression B. Effect of antisense PI 3-kinase ODN on PI 3-kinase expression
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**P<0.01 vs control; S-2: sense IRAK-2 ODN; S-3: sense PI 3-kinase ODN; AS-2: antisense IRAK-2 ODN; AS-3: antisense PI 3-kinase ODN;
V: volume of peak
图 2 反义IRAK-2 寡核苷酸对NF-kB 活化的抑制
Fig.2 Effect of antisense IRAK-2 ODN on NF-kB activation
**P < 0.01 vs control; AS-2 antisense IRAK-2 ODN
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图 3 反义PI 3-激酶寡核苷酸对NF-kB 活化的抑制
Fig.3 Effect of antisense PI 3-kinase ODN on NF-kB activation
** P < 0.01 vs control; AS-3 antisense PI 3-kinase ODN
2 结果
2.1反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别对IRAK-2和PI 3-激酶表达的影响
以IRAK-2或PI 3-激酶PCR产物与作为内参照的看家基因β-actin PCR产物吸收峰体积的比值反映了反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸对各自的靶基因表达的影响。结果表明，反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别抑制IRAK-2和PI 3-激酶的表达(与对照组相比，P<0.01)，而正义IRAK-2 寡核苷酸和正义PI 3-激酶寡核苷酸都不能抑制靶基因表达(图 1A，B)。
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2.2 反义IRAK-2寡核苷酸对NF-κB活化的影响
细胞用IL-1β 100 U/ml 刺激30 min, 洗去IL-1β，加入反义IRAK-2寡核苷酸孵育一定时间， 洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1 h。设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-2寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-2寡核苷酸)。 提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义IRAK-2 寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图2A)。当4μg反义IRAK-2 寡核苷酸与HepG2细胞共孵育8 h时，NF-κB的吸光度值降幅最大，从对照组的(2.371±0.051)A下降到(1.079±0.006)A，抑制率达(54.5±0.2)%(图2B)。但是，此时的NF-κB活性仍远高于基础NF-κB水平，NF-κB基础水平值为(0.292±0.046)A(图2B)，说明反义IRAK-2 寡核苷酸不能完全抑制NF-κB活化，预示虽然IRAK-2在IL-1诱导的NF-κB活化中起调控作用，但IRAK-2只能部分激活NF-κB。
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2.3反义PI 3-激酶寡核苷酸对NF-κB活化的影响
细胞用IL-1β 100 U/ml 刺激30 min，洗去IL-1β，加入反义PI 3-激酶寡核苷酸孵育一定时间，洗去反义寡核苷酸， IL-1β刺激1 h。设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义PI 3-激酶寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义PI 3-激酶寡核苷酸)。提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义PI 3-激酶寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图3A)。2 μg反义PI 3-激酶寡核苷酸与细胞孵育8 h的抑制作用最强，NF-κB的吸光度值从对照组的(2.228±0.050)A降至(1.275±0.029)A，抑制率为(42.8±1.3)%(图3B)。然而，与反义IRAK-2 寡核苷酸类似，反义PI 3-激酶寡核苷酸对NF-κB的抑制不完全(图3B)，意味着PI 3-激酶调控NF-κB活化但不足以完全激活NF-κB。
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2.4反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染对NF-κB活化的影响
虽然IRAK-2和PI 3-激酶都调控IL-1诱导的NF-κB
活化，但两者都不足以完全激活NF-κB。由此我们推测这两个早期信号转导子在激活NF-κB时有协同作用。为了验证这一假设，我们将4μg反义IRAK-2 寡核苷酸和2μg反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染HepG2细胞，结果达(80.3±0.5)%的NF-κB活性被抑制(图4)，说明IRAK-2和PI 3-激酶确实是协同起作用。
图 4 反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染对NF-kB
活化的影响
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Fig.4 Effect of cotransfection of antisense IRAK-2 ODN with
antisense PI 3-kinase ODN on NF-kB activation
AS-2: antisense IRAK-2 ODN; AS-3: antisense PI 3-kinase ODN
3 讨论
本研究发现IRAK-2和PI 3-激酶各自都能调控IL-1诱导的NF-κB活化，但都不足以完全激活NF-κB，IRAK-2和PI 3-激酶在调控NF-κB活化时协同作用。
近年来，反义寡核苷酸因其作用高度特异而成为一种新兴的疾病治疗策略和理论研究工具[7]。反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别抑制IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶mRNA的表达，而对看家基因β-actin的表达无抑制作用(图1)，表明反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸可分别作为IRAK-2和PI 3-激酶表达的特异性抑制剂。
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反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2表达的抑制导致
IL-1诱导的NF-κB活化受到抑制，但这种抑制是不完全的(图2)，说明IRAK-2是NF-κB活化必要但不充分条件。由于PI 3-激酶具有与IRAK-2相似的作用(图3)，推测IRAK-2 和PI 3-激酶可能协同激活NF-κB。此推测为本实验结果证实，即与反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比，两者共转染细胞对NF-κB的抑制作用明显增强(图4)。有趣的是，反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染后NF-κB活性仍未降至基础水平(P <0.01)(图4)，提示还可能存在别的蛋白激酶与IRAK-2和PI 3-激酶一起调控NF-κB活化。
澄清IRAK-2和PI 3-激酶之间的关系可为抑制IL-1引起的炎症反应提供理论指导。但是，IRAK-2和PI 3-激酶协同作用的分子机制有待阐明。另外，由于IL-1信号转导极其复杂，HepG2细胞中IRAK-2和PI 3-激酶协同激活NF-κB的作用模式是否存在于其它细胞和体内也需证实。
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基金项目：博士课题基金资助项目
作者简介：郭甫坤(1971-)，男，重庆开县人，1994年毕业于吉林大学，第一军医大学在读博士研究生
参考文献
1，O’Neill LAJ, Greene C. Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptor family: ancient signaling machinery in mammals, insects, and plants[J]. J Leukoc Biol, 1998, 63 (6):650～7.
2，Reddy SAG, Huang JH, Liao WSL. Phosphatidylinositol 3-kinase in interleukin 1 signaling[J]. J Biol Chem, 1997, 272 (46):29167～73.
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3，Muzio M, Ni J, Feng P et al. IRAK (pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling[J]. Science, 1997, 278 (5343):1612～5.
4，Rovin BH, Dickerson JA, Tan LC et al. Activation of nuclear factor-κB correlates with MCP expression by human mesangial cells[J]. Kidney Int, 1995, 48 (4):1263～71.
5，Wang RG, Zhu XZ, Song W. Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor in Macaca mulatta[J]. Acta Pharmacol Sin, 1998, 19 (1):50～3.
6，Stepkowski SM. Application of antisense oligodeoxynucleotides for organ transplantation[J].Transplant Proc, 1998, 30 (5):2142～5.
收稿日期：1999-07-10, 百拇医药
单位：郭甫坤(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)；李亦蕾(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)；吴曙光(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)
关键词：白细胞介素1；白介素1受体相关激酶-2；磷脂酰肌醇 3-激酶；反义寡核苷酸；NF-Kappa κB
第一军医大学学报000202 摘要：目的 研究白介素1受体相关激酶2(IRAK-2)和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI 3-激酶)在白介素-1(IL-1)诱导核因子- κB(NF-κB)活化中的作用。方法 Lipofectin介导反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸转染HepG2细胞后，用逆转录PCR法检测IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶 mRNA表达水平，以Sandwich ELISA法检测NF-κB的活化。结果 (1) 反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别抑制IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶mRNA的表达；(2)反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸部分抑制NF-κB活化；(3)与反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比，反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染HepG2细胞对NF-κB的抑制作用明显增强。结论 在HepG2细胞中，IRAK-2和PI 3-激酶都调控NF-κB活化但都不能完全激活NF-κB，IRAK-2和PI 3-激酶在调控NF-κB 活化时有协同作用。
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中图分类号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0113-04
Interleukin-1 receptor-associated kinase-2 and phosphatidylinositol 3-kinase synergetically activate NF-κB
GUO Fu-kun，LI Yi-lei，WU Shu-guang
(Institute of Pharmaceutic Sciences, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To investigate the role of interleukin-1 receptor-associated kinase-2 (IRAK-2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) in interleukin-1 (IL-1)-induced nuclear factor-κB (NF-κB) activation. Methods Phosphorothioate oligonucleotides (ODN) were designed antisense to IRAK-2 or PI 3-kinase. Antisense IRAK-2 ODN or antisense PI 3-kinase ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured HepG2 cells. IRAK-2 mRNA and PI 3-kinase mRNA expression was assayed by semiquantitative reverse transcription-PCR. The levels of NF-κB were measured by sandwich ELISA. Results Antisense IRAK-2 ODN and antisense PI 3-kinase ODN blocked IRAK-2 and PI 3-kinase expression, respectively. As a result, antisense IRAK-2 ODN or antisense PI 3-kinase ODN inhibited IL-1-induced NF-κB activation in a dose (1 8 μg)- and time (5 24 h)- dependent fashion. When the cells were treated with antisense IRAK-2 ODN 4 μg or antisense PI 3-kinase ODN 2μg for 8 h, the maximum inhibition rate was (54.5±0.2)% and (42.8±1.3)%, respectively. However, since the NF-κB activity was still much higher than that of basal group (P<0.01), the inhibition was incomplete. Cotransfection of antisense IRAK-2 ODN 4μg with antisense PI 3-kinase ODN 2μg resulted in an additive inhibition of NF-κB-activation by (80.3±0.5)%. Conclusions In HepG2 cells, either IRAK-2 or PI 3-kinase is necessary but not sufficient to fully activate NF-κB. IRAK-2 regulates IL-1-stimulated NF-κB activation in cooperation with PI 3-kinase.
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Key words: interleukin-1; interleukin-1 receptor associated kinase-2; phosphatidylinositol 3-kinase; antisense oligonucleotide; nuclear factor-κB
白介素-1(IL-1)是一种在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。越来越多的研究表明，IL-1的生物学效应主要由转录因子核因子-κB (NF-κB)调控[1]。因此，阐明IL-1激活NF-κB的信号机制具有重要的理论和临床应用价值。
IL-1刺激信号由其I型受体(IL-1RI)转导。与大多数细胞因子受体不同，IL-1RI没有内在的蛋白激酶活性[2]，因而势必需要结合细胞浆蛋白激酶来传导信号。IL-1受体相关激酶-2(IRAK-2)和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI 3-激酶)就属于这样的蛋白激酶。研究表明，IRAK-2和PI 3-激酶都能激活NF-κB[2、3]，但目前还不清楚它们是否协同作用，本文对此进行了探讨。
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1 材料与方法
1.1 细胞系和试剂
HepG2细胞从ATCC公司购买。DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体 ( 抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基羧基末端 ) 和兔NF-κB p65 亚基特异性抗体 ( 抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基氨基末端 ) 由美国Santa CruZ 生物技术公司生产。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记 IgG购自河南华美生物工程公司。SV总RNA 分离试剂盒和逆转录-PCR (RT-PCR) 试剂盒为Promega 公司产品。
1.2 细胞培养[2]
HepG2细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基于37℃、5 % CO2条件下培养至密度达90% 以上。
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1.3 寡核苷酸的序列及合成
反义IRAK-2 寡核苷酸序列：5’-GTAGATGTAGCAG
GCCAT-3’；正义IRAK-2 寡核苷酸序列：5’-ATGGCCTGC
TACATCTAC-3’。反义PI 3-激酶寡核苷酸序列：5’-CTCAGCACTCATGTTTGC-3’；正义PI 3-激酶寡核苷酸序列：5’-GCAAACATGAGTGCTGAG-3’。寡核苷酸 的5’ 端和3’端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰，由上海生工生物工程有限公司合成。正义寡核苷酸序列与靶序列一致，反义寡核苷酸序列与靶序列互补。
1.4 Lipofectin 介导寡核苷酸转染HepG2细胞
参照lipofectin说明书操作。
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1.5 RT-PCR法测定IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶mRNA表达水平细胞用IL-1β 100 U/ml 刺激30 min， 洗去IL-1β， IRAK-2实验组分别加入正义IRAK-2 寡核苷酸4 μg和反义IRAK-2 寡核苷酸4μg；PI 3-激酶实验组分别加入正义PI 3-激酶寡核苷酸 2μg 和反义PI 3-激酶寡核苷酸2μg，各实验组均设立对照。细胞与寡核苷酸孵育8 h，提取总RNA，RT-PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++图像分析软件VILBER LOURMAT公司)定量。IRAK-2 5’ 端引物为：5’-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3’；3’端引物为：5’-CCAGCACAGGTAA GACATTGG-3’。PI 3-激酶5’端引物为：5’-GGTACCAGTACAGAGCGCTGTA-3’；3’端引物为：5’-CGGAGCTTTGTACTTCTGGAGC-3’。内参照β-actin 5’端引物为 5’-TGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；3’端引物为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(由上海生工生物工程有限公司合成)。重复实验3次。
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1.6 Sandwich ELISA法测定NF-κB
按Rovin等[4]的方法提取细胞核蛋白，用Sandwich ELISA法测定NF-κB[5]。重复实验3次。
1.7数据分析
实验数据以
±s表示，采用t检验进行统计学分析。图 1 A 反义IRAK-2 寡核苷酸对IRAK-2 表达的抑制 B 反义PI 3-激酶寡核苷酸对PI 3-激酶表达的抑制
Fig.1 A. Effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 expression B. Effect of antisense PI 3-kinase ODN on PI 3-kinase expression
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**P<0.01 vs control; S-2: sense IRAK-2 ODN; S-3: sense PI 3-kinase ODN; AS-2: antisense IRAK-2 ODN; AS-3: antisense PI 3-kinase ODN;
V: volume of peak
图 2 反义IRAK-2 寡核苷酸对NF-kB 活化的抑制
Fig.2 Effect of antisense IRAK-2 ODN on NF-kB activation
**P < 0.01 vs control; AS-2 antisense IRAK-2 ODN
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图 3 反义PI 3-激酶寡核苷酸对NF-kB 活化的抑制
Fig.3 Effect of antisense PI 3-kinase ODN on NF-kB activation
** P < 0.01 vs control; AS-3 antisense PI 3-kinase ODN
2 结果
2.1反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别对IRAK-2和PI 3-激酶表达的影响
以IRAK-2或PI 3-激酶PCR产物与作为内参照的看家基因β-actin PCR产物吸收峰体积的比值反映了反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸对各自的靶基因表达的影响。结果表明，反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别抑制IRAK-2和PI 3-激酶的表达(与对照组相比，P<0.01)，而正义IRAK-2 寡核苷酸和正义PI 3-激酶寡核苷酸都不能抑制靶基因表达(图 1A，B)。
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2.2 反义IRAK-2寡核苷酸对NF-κB活化的影响
细胞用IL-1β 100 U/ml 刺激30 min, 洗去IL-1β，加入反义IRAK-2寡核苷酸孵育一定时间， 洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1 h。设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-2寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-2寡核苷酸)。 提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义IRAK-2 寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图2A)。当4μg反义IRAK-2 寡核苷酸与HepG2细胞共孵育8 h时，NF-κB的吸光度值降幅最大，从对照组的(2.371±0.051)A下降到(1.079±0.006)A，抑制率达(54.5±0.2)%(图2B)。但是，此时的NF-κB活性仍远高于基础NF-κB水平，NF-κB基础水平值为(0.292±0.046)A(图2B)，说明反义IRAK-2 寡核苷酸不能完全抑制NF-κB活化，预示虽然IRAK-2在IL-1诱导的NF-κB活化中起调控作用，但IRAK-2只能部分激活NF-κB。
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2.3反义PI 3-激酶寡核苷酸对NF-κB活化的影响
细胞用IL-1β 100 U/ml 刺激30 min，洗去IL-1β，加入反义PI 3-激酶寡核苷酸孵育一定时间，洗去反义寡核苷酸， IL-1β刺激1 h。设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义PI 3-激酶寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义PI 3-激酶寡核苷酸)。提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义PI 3-激酶寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图3A)。2 μg反义PI 3-激酶寡核苷酸与细胞孵育8 h的抑制作用最强，NF-κB的吸光度值从对照组的(2.228±0.050)A降至(1.275±0.029)A，抑制率为(42.8±1.3)%(图3B)。然而，与反义IRAK-2 寡核苷酸类似，反义PI 3-激酶寡核苷酸对NF-κB的抑制不完全(图3B)，意味着PI 3-激酶调控NF-κB活化但不足以完全激活NF-κB。
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2.4反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染对NF-κB活化的影响
虽然IRAK-2和PI 3-激酶都调控IL-1诱导的NF-κB
活化，但两者都不足以完全激活NF-κB。由此我们推测这两个早期信号转导子在激活NF-κB时有协同作用。为了验证这一假设，我们将4μg反义IRAK-2 寡核苷酸和2μg反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染HepG2细胞，结果达(80.3±0.5)%的NF-κB活性被抑制(图4)，说明IRAK-2和PI 3-激酶确实是协同起作用。
图 4 反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染对NF-kB
活化的影响
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Fig.4 Effect of cotransfection of antisense IRAK-2 ODN with
antisense PI 3-kinase ODN on NF-kB activation
AS-2: antisense IRAK-2 ODN; AS-3: antisense PI 3-kinase ODN
3 讨论
本研究发现IRAK-2和PI 3-激酶各自都能调控IL-1诱导的NF-κB活化，但都不足以完全激活NF-κB，IRAK-2和PI 3-激酶在调控NF-κB活化时协同作用。
近年来，反义寡核苷酸因其作用高度特异而成为一种新兴的疾病治疗策略和理论研究工具[7]。反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别抑制IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶mRNA的表达，而对看家基因β-actin的表达无抑制作用(图1)，表明反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸可分别作为IRAK-2和PI 3-激酶表达的特异性抑制剂。
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反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2表达的抑制导致
IL-1诱导的NF-κB活化受到抑制，但这种抑制是不完全的(图2)，说明IRAK-2是NF-κB活化必要但不充分条件。由于PI 3-激酶具有与IRAK-2相似的作用(图3)，推测IRAK-2 和PI 3-激酶可能协同激活NF-κB。此推测为本实验结果证实，即与反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比，两者共转染细胞对NF-κB的抑制作用明显增强(图4)。有趣的是，反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染后NF-κB活性仍未降至基础水平(P <0.01)(图4)，提示还可能存在别的蛋白激酶与IRAK-2和PI 3-激酶一起调控NF-κB活化。
澄清IRAK-2和PI 3-激酶之间的关系可为抑制IL-1引起的炎症反应提供理论指导。但是，IRAK-2和PI 3-激酶协同作用的分子机制有待阐明。另外，由于IL-1信号转导极其复杂，HepG2细胞中IRAK-2和PI 3-激酶协同激活NF-κB的作用模式是否存在于其它细胞和体内也需证实。
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基金项目：博士课题基金资助项目
作者简介：郭甫坤(1971-)，男，重庆开县人，1994年毕业于吉林大学，第一军医大学在读博士研究生
参考文献
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收稿日期：1999-07-10, 百拇医药