MN9202对L-甲状腺素所致大鼠心肌肥厚的影响
作者：王剑波 梅其炳 赵德化
单位：王剑波(第四军医大学基础部药理学教研室, 陕西 西安 710033)；梅其炳(第四军医大学基础部药理学教研室, 陕西 西安 710033)；赵德化(第四军医大学基础部药理学教研室, 陕西 西安 710033)
关键词：二氢吡啶类；钙拮抗剂；心肌肥厚；甲状腺素；氧自由基；超微结构
第四军医大学学报000655 摘要： 目的 探讨二氢吡啶类钙拮抗剂2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1.4-二氢-3,5-吡啶二羧-3-甲酯-5-正戊酯(MN9202)在L-甲状腺素(L-thyroxine, L-Thy)引起大鼠心肌肥厚时对心脏指数，心肌超微结构及心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)含量的影响. 方法 连续12 d ip L-Thy 0.5 mg.kg-1.d-1复制大鼠心肌肥厚模型，实验组ip MN9202 0.4 mg.kg-1.d-1，2 mg.kg-1.d-1，10 mg.kg-1.d-1，阳性对照组ip卡托普利25 mg.kg-1.d-1,模型组、对照组给予等量溶剂，于给药后的第13日处死大鼠，检测心脏指数，电镜观察心肌组织的超微结构变化，化学比色法测定心肌匀浆中SOD、GSH-PX活性和MDA含量. 结果 在注射L-Thy 12 d后，与对照组相比，MN9202能明显降低心脏指数，减轻心肌组织超微结构的病理改变，显著提高大鼠心肌中SOD和GSH-PX活性，并减少MDA的生成，尤以中、高剂量为佳(P<0.05,P<0.01). 结论 MN9202能抑制L-Thy所引起的心肌肥厚，对心肌组织具有保护作用，该作用与阻止Ca2+内流，防止钙超载，提高氧自由基清除活性，抑制脂质过氧化反应有关.
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中图号:R962 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-S0141-04
MN9202 can inhibit cardiac hypertrophy induced by L-Thy in rats
WANG Jian-Bo MEI Qi-Bing ZHAO De-Hua
(Department of Pharmacology, Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To investigate the effect of methyl pentyl 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-3,5-pyridinedicarboxylate (MN9202),a dihydropyridine calcium antagonist, on cardiac indexes,ultrastructure, superoxide dismatase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-PX) activity and malondialdehyde (MDA) concentration in cardiac hypertrophy induced by L-thyroxine (L-Thy) in rats. METHODS cardiac hypertophic model of rats was induced by a continued administration of L-Thy 0.5 mg.kg-1 ip once daily for 12 d. Three doses (0.4, 2, 10 mg.kg-1) of MN9202 or captopril (25 mg.kg-1, positive group), vehicle (model group or control group) were injected by ip before 8 h L-Thy injection; cardiac indexes were examined; the change of myocardial ultrastructure were observed with electron microscope; the activity of SOD, GSH-PX and concentration of MDA were measured by colorimetric analysis. RESULTS by a continued ip L-Thy for 12 d, MN9202 could obviously reduce the cardiac indexes, improve the development of ultrastructural pathological change at myocardium and significently increased the SOD,GSH-PX activity and reduce the production of MDA in rats, especially in middle dose and high dose (P<0.05, P<0.01). CONCLUSION MN9202 can inhibit cardiac hypertrophy induced by L-Thy and protect cardiac tissue from injury, which may be related to blocking intracellular Ca2+ influx, reduceing calcium accumulation and increasing the activity of clearence enzyme of free radical and inhibiting lipid peroxidation
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Keywords:dihydropyridines； calcium antagonist； myocardium hypertrophy；thyroxine； oxygen free radicals； ultrastructure
0 引言
心肌肥厚被认为是心血管发病率和病死率的重要的危险因素之一，也是高血压时心脏损害的重要病理变化，这种改变导致心脏泵血效率降低，影响心肌血氧供应，还可增加心律失常及心源性猝死的发生. 因此，防止心肌肥厚具有重要的意义. 现已发现钙拮抗剂和血管紧张素转化酶抑制剂[1,2]可有效地防治心肌肥厚. 2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氢-3,5-吡啶二羧酸-3-甲酯-5-正戊酯(MN9202)为本室新合成的二氢吡啶类钙拮抗剂，对麻醉和清醒大鼠具有良好的降压作用，且作用时间长，不影响心率，并具有钙拮抗，保护脑缺血、肠系膜缺血，改善血流动力学等多种作用[3,4]，但MN9202对心肌肥厚的作用未进行过研究，本实验通过观察MN9202对L-甲状腺素所致大鼠心肌肥厚的影响，以探讨其抗心肌肥厚形成作用及其机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 8 wk龄SD大鼠48只，体质量(260±20)g，雌雄各半，由本校实验动物研究中心提供，随机分为6组：3个MN9202组，分别ip MN9202 0.4, 2, 10 mg.kg-1，1次/d，阳性对照组ip卡托普利(Captopril, Cap) 25 mg.kg-1，1次/d；溶剂对照组和L-Thy组ip MN9202溶剂2 mL.kg-1，1次/d，连续12 d；第1日给药后,MN9202各剂量组，阳性对照组和L-Thy组，间隔8 h, ip L-Thy 0.5 mg.kg-1，对照组ip L-Thy溶剂(5 g.L-1羧甲基纤维素钠溶液,CMN-Na )2 mL.kg-1.
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用Sigma公司生产的L-甲状腺素(L-thyroxine, L-Thy)，取适量于玻璃乳钵内研成细粉，加入5 g.L-1CMC-Na液，配成浓度为250 mg.L-1的混悬液，供注射用. MN9202由本室合成，结构经核磁共振氢谱分析确定，纯度(高效液相色谱分析)98%以上，先以二甲基亚砜(DMSO)溶解，再用150 mL.L-1吐温-80 (1∶50)配成所需浓度. 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测试盒，购自南京建成生物工程研究所. 卡托普利(Captopril)佛山市生化制药厂，批号：99030606.
1.2 方法 ①心脏指数的检测: 各组大鼠于给药的13 d，称体质量(BW)后处死，分离心脏，剪去多余血管与结缔组织，滤纸吸干，测全心重量(HW)，除去左右心房及右心室，记录左心室重量(LVW)；在距心尖约0.3 cm处用手术刀片横截心脏，于此水平测量左室游离壁厚度(LVWT)，以及室间隔厚度(VST). ② 心肌细胞形态学观察: 取左心室肌，用戊二醛固定，乙醇系列脱水，Epon812浸透，包埋，聚合，超薄切片，以铀、铅双重染色. 在日本JEM-2000EX型透射电镜下观察. ③ 心肌组织中SOD,GSH-PX活性和MDA含量的测定: 取左心室肌，测质量，以含0.25 mol.L-1蔗糖，0.005 mol.L-1 Tris-HCl，0.0001 mol.L-1 EDTA-Na2(pH 7.5)溶液为介质，内切式匀浆机制备成浓度为100 g.L-1的匀浆液(转速为8000 r.min-1，15S×4)，0～4℃ 2000 g离心10 min，取上清液羟胺法[5]测定SOD活性，DTNB直接法[6]测定GSH-PX活性，用硫代巴比妥酸法[7]测定MDA含量，用考马斯亮蓝法[8]测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白作标准，操作过程按试剂盒说明书进行. ④ 统计学分析: 全部数据以
±s表示，行组间t检验.
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2 结果
2.1 MN9202对L-Thy所致心肌肥厚大鼠心脏指数的影响 与对照组比较，L-Thy组心脏指数HW/BW，LVW/BW，LVWT,VST均明显升高(P<0.01)，MN9202中(P<0.05)、高剂量(P<0.01)组能有效地抑制L-Thy引起的大鼠心脏指数的升高，对抗大鼠心肌肥厚的形成(Tab 1).
表 1 MN9202对L-甲状腺素引起大鼠心肌肥厚心脏指数的影响
Tab 1 Effects of MN9202 on cardiac indexes of hypertrophic heart induced by L-thyroxine (L-Thy) in rats (±s, n=8) Group
, http://www.100md.com Dose
(mg.kg-1)
HW/BW
(g.kg-1)
LVW/BW
(g.kg-1)
LVWT
(mm)
VST
(mm)
Control
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Vehicle
2.88±0.23
2.24±0.20
3.20±0.25
1.98±0.10
L-Thy
Vehicle
4.17±0.32a
3.18±0.25a
4.34±0.34a
2.60±0.27a
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MN9202+L-Thy
0.4
3.90±0.24
3.03±0.29
4.13±0.32
2.32±0.30
MN9202+L-Thy
2
3.80±0.18b
2.92±0.21b
3.95±0.28b
, 百拇医药
2.25±0.26b
MN9202+L-Thy
10
3.69±0.19c
2.81±0.18c
3.88±0.26c
2.19±0.32b
Cap+L-Thy
25
3.62±0.23c
, 百拇医药
2.79±0.23c
3.94±0.31c
2.10±0.34c
HW：heart weight, BW: body weight, LVW: left ventricule weight, LVWT: left ventricular wall thickness, VST: ventricular septal thickness;aP<0.01 vs control; bP<0.05, cP<0.01 vs L-Thy, Cap: captopril.2.2 MN9202对L-Thy所致心肌肥厚大鼠心肌细胞超微结构的影响 大鼠经L-Thy处理12 d后，心肌肌纤维排列紊乱,溶解断裂，线粒体明显肿胀，嵴断裂溶解消失，而对照组心肌纤维排列整齐，Z带清晰可见，富含线粒体并且结构正常. MN9202治疗组，心肌肌丝排列较整齐，仅少数肌丝溶解断裂，Z带较清楚，线粒体轻度肿胀，电子密度基本均匀一致，嵴保存尚完好，阳性对照组，肌纤维结构正常，排列整齐，Z线清晰，线粒体结构基本正常，嵴排列完好. 结果见Fig 1～Fig 4.
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2.3 MN9202对L-Thy所致心肌肥厚大鼠心肌中SOD,GSH-PX活性和MDA含量的影响 连续ip L-Thy 12 d后，大鼠心肌组织中SOD,GSH-PX活性降低，MDA含量升高，与对照组相比差异显著(P<0.01)，给MN9202后，能明显升高肥厚心肌组织的SOD,GSH-PX活性，降低MDA含量，与模型组相比差异显著(P<0.05,0.01)，且呈现剂量依赖关系,结果见Tab 2.
图 1 正常大鼠心肌内线粒体结构完整,肌纤维排列整齐，z带清晰
Fig 1 In normal myocardium of rat, mitochondrion structure integrity, myofibrillae put in order, Z band clear TEM ×15 000
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图 2 肥厚大鼠心肌内线粒体肿胀，嵴断裂溶解,肌纤维排列紊乱
Fig 2 In hypertrophic myocardium of rat, mitochondrion swollen, cristae broken, myofibrillae put mussily TEM ×15 000
图 3 MN9202治疗肥厚大鼠心肌内线粒体轻度肿胀，部分肌纤维溶解
Fig 3 In hypertrophic myocardium of rat treated by MN9202(10 mg.kg-1 ),mitochondrion gently swollen, parts of myofibrillae dissolved TEM ×15 000
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图 4 卡托普利治疗肥厚大鼠心肌内线粒体结构较正常，肌纤维排列整齐，Z带清晰
Fig 4 In hypertrophic myocardium of rat treated by captopril(25 mg.kg-1), mitochondrion structure resume normal, myofibrillae put in order relatively, Z band clear TEM ×15 000
表 2 MN9202对肥厚大鼠心肌组织中SOD,GSH-PX和MDA含量的影响
Tab 2 Effects of MN9202 on myocardial SOD,GSH-PX and MDA contents of hypertrophic heart induced by L-thy in rats (n=6,±s) Group
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Dose /(mg.kg-1)
SOD/(nmol.s-1
.g-1 protein)
GSH-PX
/(mmol.min-1.g-1 protein)
MDA
/(μmol.g-1 protein)
Control
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Vehicle
670.97±118.19
147.72±24.58
3.51±1.60
L-Thy
Vehicle
399.91± 83.02a
98.53±16.23b
7.37±1.46a
MN9202+L-Thy
0.4
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487.76± 94.35
113.41±22.48
5.55±1.76
MN9202+L-Thy
2
528.44± 67.68b
129.89±28.06b
5.23±1.51b
MN9202+L-Thy
10
598.62±102.69c
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139.45±17.45c
4.90±0.84c
Cap+L-Thy
25
585.78±104.18c
134.37±24.53b
4.45±1.21c
aP<0.01 vs control, bP<0.05, cP<0.01 vs L-Thy. Cap:captopril.3 讨论 本实验用连续ip L-甲状腺素的方法建立大鼠心肌肥厚模型，观察给予二氢吡啶类钙拮抗剂MN9202对心肌肥厚大鼠心脏指数，超微结构及SOD,GSH-PX活性和MDA含量的影响，发现心肌肥厚时，心脏指数升高,超微结构发生损伤性病理改变，SOD和GSH-PX活性下降，MDA含量增加，而MN9202能够有效地逆转这些变化. L-Thy诱发的肥厚心肌是研究心肌肥厚生化机制的适宜模型之一[9]. L-Thy可促进大鼠心肌细胞mRNA和蛋白质的合成，使氧化磷酸化脱偶联，ATP合成下降，而细胞氧耗却依然旺盛，最终导致心肌缺血性肥厚[10]，在此病程中，细胞内钙离子水平显著升高，出现细胞内钙超载[11]，Ca2+被公认是细胞生长过程中第二信使，Ca2+通道活化后通过特异的离子流激活胞核基因及增加胞质蛋白质合成，Ca2+超载在心肌肥厚发展中起着非常重要的作用[12]，因此，Ca2+可能作为一个细胞内重要生化信号介导了心肌肥厚反应. 阻止Ca2+内流，维持和恢复细胞内钙稳定，对防止心肌肥厚具有重要意义，临床及动物实验均已证明钙拮抗剂具有较好的防止和逆转心肌肥厚的作用. 我们选择新合成的二氢吡啶类钙拮抗剂MN9202用于L-Thy所致心肌肥厚大鼠，可有效地防止心肌肥厚的形成，使心脏指数明显降低，减轻心肌细胞线粒体，肌原纤维等超微结构的破坏，提示MN9202可能通过其钙拮抗作用，阻止Ca2+的超负荷，从而对抗心肌肥厚的形成. 另一方面，在L-Thy诱发的心肌肥厚病程中，心肌缺血和血流再灌注均不可避免地造成心肌细胞的损害. 大量的中间代谢产物堆积，使氧自由基增多，导致细胞膜脂质过氧化反应，加之SOD,GSH-PX等自由基清除系统的耗竭，使氧自由基过量堆积，损伤细胞膜，导致MDA增多. 因此，氧自由基可能参与L-Thy诱发的心肌肥厚，而氧自由基又可进一步加重钙超载. 本实验观察到MN9202能有效地抑制L-Thy引起的大鼠心肌中SOD，GSH-PX活性降低，增强机体清除O2-的能力，并对抗MDA的升高，提示该化合物除具有Ca2+拮抗作用外，还可能减少氧自由基产生和脂质过氧化反应. 此外，从超微结构显示，心肌肥厚组心肌组织发生明显损伤，而MN9202剂量组及阳性对照组，从损伤程度上可见肌纤维和线粒体结构基本正常，说明MN9202及阳性药卡托普利可减轻心肌肥厚时所致的心肌细胞及亚细胞器结构的损伤和功能的丧失，从而使心肌组织得以保护. 这一结果为扩大MN9202临床应用提供了实验依据.
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作者简介：王剑波(1965-)，男(汉族)，四川省江安县人. 1988年毕业于成都中医药大学，主管药师，发表论文13篇，硕士生(导师赵德化). Tel.(029)3374555 Email.Pharmalwjb@fumm.edu.cn
参考文献:
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[2] Nagano M, Higaki K, Mikami H et al. Converting enzyme inhibitors regressed cardiac hypertrophy and reduced tissue angiotensin II in spontaneously hypertensive rats[J]. J Hypertension, 1991;9:595-599.
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[4] Gan G,Mei Qi B, Zhao D H.Protective effects of methyl pentyl 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-3,5-pyridinedicarboxylate on shock induced by intestinal ischemia-reperfusion injury in rabbits[J]. Chin J Pharmacol Toxicol,1997;11(3):190-193.
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[7] Ohkawa H,Ohidhi N,Yagi K.Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction[J]. Anal Biochem,1979;95(2):351-358.
[8] Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J]. Anal Biochem,1991;10(1):27-30.
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[12] Harary I, Farley B. In vitro studies of single isolated beeting heart cells[J]. Science, 1960;13(554):1674-1675.
收稿日期:1999-12-30
修回日期:2000-01-19, 百拇医药
单位：王剑波(第四军医大学基础部药理学教研室, 陕西 西安 710033)；梅其炳(第四军医大学基础部药理学教研室, 陕西 西安 710033)；赵德化(第四军医大学基础部药理学教研室, 陕西 西安 710033)
关键词：二氢吡啶类；钙拮抗剂；心肌肥厚；甲状腺素；氧自由基；超微结构
第四军医大学学报000655 摘要： 目的 探讨二氢吡啶类钙拮抗剂2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1.4-二氢-3,5-吡啶二羧-3-甲酯-5-正戊酯(MN9202)在L-甲状腺素(L-thyroxine, L-Thy)引起大鼠心肌肥厚时对心脏指数，心肌超微结构及心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)含量的影响. 方法 连续12 d ip L-Thy 0.5 mg.kg-1.d-1复制大鼠心肌肥厚模型，实验组ip MN9202 0.4 mg.kg-1.d-1，2 mg.kg-1.d-1，10 mg.kg-1.d-1，阳性对照组ip卡托普利25 mg.kg-1.d-1,模型组、对照组给予等量溶剂，于给药后的第13日处死大鼠，检测心脏指数，电镜观察心肌组织的超微结构变化，化学比色法测定心肌匀浆中SOD、GSH-PX活性和MDA含量. 结果 在注射L-Thy 12 d后，与对照组相比，MN9202能明显降低心脏指数，减轻心肌组织超微结构的病理改变，显著提高大鼠心肌中SOD和GSH-PX活性，并减少MDA的生成，尤以中、高剂量为佳(P<0.05,P<0.01). 结论 MN9202能抑制L-Thy所引起的心肌肥厚，对心肌组织具有保护作用，该作用与阻止Ca2+内流，防止钙超载，提高氧自由基清除活性，抑制脂质过氧化反应有关.
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中图号:R962 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-S0141-04
MN9202 can inhibit cardiac hypertrophy induced by L-Thy in rats
WANG Jian-Bo MEI Qi-Bing ZHAO De-Hua
(Department of Pharmacology, Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To investigate the effect of methyl pentyl 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-3,5-pyridinedicarboxylate (MN9202),a dihydropyridine calcium antagonist, on cardiac indexes,ultrastructure, superoxide dismatase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-PX) activity and malondialdehyde (MDA) concentration in cardiac hypertrophy induced by L-thyroxine (L-Thy) in rats. METHODS cardiac hypertophic model of rats was induced by a continued administration of L-Thy 0.5 mg.kg-1 ip once daily for 12 d. Three doses (0.4, 2, 10 mg.kg-1) of MN9202 or captopril (25 mg.kg-1, positive group), vehicle (model group or control group) were injected by ip before 8 h L-Thy injection; cardiac indexes were examined; the change of myocardial ultrastructure were observed with electron microscope; the activity of SOD, GSH-PX and concentration of MDA were measured by colorimetric analysis. RESULTS by a continued ip L-Thy for 12 d, MN9202 could obviously reduce the cardiac indexes, improve the development of ultrastructural pathological change at myocardium and significently increased the SOD,GSH-PX activity and reduce the production of MDA in rats, especially in middle dose and high dose (P<0.05, P<0.01). CONCLUSION MN9202 can inhibit cardiac hypertrophy induced by L-Thy and protect cardiac tissue from injury, which may be related to blocking intracellular Ca2+ influx, reduceing calcium accumulation and increasing the activity of clearence enzyme of free radical and inhibiting lipid peroxidation
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Keywords:dihydropyridines； calcium antagonist； myocardium hypertrophy；thyroxine； oxygen free radicals； ultrastructure
0 引言
心肌肥厚被认为是心血管发病率和病死率的重要的危险因素之一，也是高血压时心脏损害的重要病理变化，这种改变导致心脏泵血效率降低，影响心肌血氧供应，还可增加心律失常及心源性猝死的发生. 因此，防止心肌肥厚具有重要的意义. 现已发现钙拮抗剂和血管紧张素转化酶抑制剂[1,2]可有效地防治心肌肥厚. 2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氢-3,5-吡啶二羧酸-3-甲酯-5-正戊酯(MN9202)为本室新合成的二氢吡啶类钙拮抗剂，对麻醉和清醒大鼠具有良好的降压作用，且作用时间长，不影响心率，并具有钙拮抗，保护脑缺血、肠系膜缺血，改善血流动力学等多种作用[3,4]，但MN9202对心肌肥厚的作用未进行过研究，本实验通过观察MN9202对L-甲状腺素所致大鼠心肌肥厚的影响，以探讨其抗心肌肥厚形成作用及其机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 8 wk龄SD大鼠48只，体质量(260±20)g，雌雄各半，由本校实验动物研究中心提供，随机分为6组：3个MN9202组，分别ip MN9202 0.4, 2, 10 mg.kg-1，1次/d，阳性对照组ip卡托普利(Captopril, Cap) 25 mg.kg-1，1次/d；溶剂对照组和L-Thy组ip MN9202溶剂2 mL.kg-1，1次/d，连续12 d；第1日给药后,MN9202各剂量组，阳性对照组和L-Thy组，间隔8 h, ip L-Thy 0.5 mg.kg-1，对照组ip L-Thy溶剂(5 g.L-1羧甲基纤维素钠溶液,CMN-Na )2 mL.kg-1.
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用Sigma公司生产的L-甲状腺素(L-thyroxine, L-Thy)，取适量于玻璃乳钵内研成细粉，加入5 g.L-1CMC-Na液，配成浓度为250 mg.L-1的混悬液，供注射用. MN9202由本室合成，结构经核磁共振氢谱分析确定，纯度(高效液相色谱分析)98%以上，先以二甲基亚砜(DMSO)溶解，再用150 mL.L-1吐温-80 (1∶50)配成所需浓度. 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测试盒，购自南京建成生物工程研究所. 卡托普利(Captopril)佛山市生化制药厂，批号：99030606.
1.2 方法 ①心脏指数的检测: 各组大鼠于给药的13 d，称体质量(BW)后处死，分离心脏，剪去多余血管与结缔组织，滤纸吸干，测全心重量(HW)，除去左右心房及右心室，记录左心室重量(LVW)；在距心尖约0.3 cm处用手术刀片横截心脏，于此水平测量左室游离壁厚度(LVWT)，以及室间隔厚度(VST). ② 心肌细胞形态学观察: 取左心室肌，用戊二醛固定，乙醇系列脱水，Epon812浸透，包埋，聚合，超薄切片，以铀、铅双重染色. 在日本JEM-2000EX型透射电镜下观察. ③ 心肌组织中SOD,GSH-PX活性和MDA含量的测定: 取左心室肌，测质量，以含0.25 mol.L-1蔗糖，0.005 mol.L-1 Tris-HCl，0.0001 mol.L-1 EDTA-Na2(pH 7.5)溶液为介质，内切式匀浆机制备成浓度为100 g.L-1的匀浆液(转速为8000 r.min-1，15S×4)，0～4℃ 2000 g离心10 min，取上清液羟胺法[5]测定SOD活性，DTNB直接法[6]测定GSH-PX活性，用硫代巴比妥酸法[7]测定MDA含量，用考马斯亮蓝法[8]测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白作标准，操作过程按试剂盒说明书进行. ④ 统计学分析: 全部数据以
±s表示，行组间t检验., 百拇医药
2 结果
2.1 MN9202对L-Thy所致心肌肥厚大鼠心脏指数的影响 与对照组比较，L-Thy组心脏指数HW/BW，LVW/BW，LVWT,VST均明显升高(P<0.01)，MN9202中(P<0.05)、高剂量(P<0.01)组能有效地抑制L-Thy引起的大鼠心脏指数的升高，对抗大鼠心肌肥厚的形成(Tab 1).
表 1 MN9202对L-甲状腺素引起大鼠心肌肥厚心脏指数的影响
Tab 1 Effects of MN9202 on cardiac indexes of hypertrophic heart induced by L-thyroxine (L-Thy) in rats (
±s, n=8) Group, http://www.100md.com Dose
(mg.kg-1)
HW/BW
(g.kg-1)
LVW/BW
(g.kg-1)
LVWT
(mm)
VST
(mm)
Control
, http://www.100md.com
Vehicle
2.88±0.23
2.24±0.20
3.20±0.25
1.98±0.10
L-Thy
Vehicle
4.17±0.32a
3.18±0.25a
4.34±0.34a
2.60±0.27a
, 百拇医药
MN9202+L-Thy
0.4
3.90±0.24
3.03±0.29
4.13±0.32
2.32±0.30
MN9202+L-Thy
2
3.80±0.18b
2.92±0.21b
3.95±0.28b
, 百拇医药
2.25±0.26b
MN9202+L-Thy
10
3.69±0.19c
2.81±0.18c
3.88±0.26c
2.19±0.32b
Cap+L-Thy
25
3.62±0.23c
, 百拇医药
2.79±0.23c
3.94±0.31c
2.10±0.34c
HW：heart weight, BW: body weight, LVW: left ventricule weight, LVWT: left ventricular wall thickness, VST: ventricular septal thickness;aP<0.01 vs control; bP<0.05, cP<0.01 vs L-Thy, Cap: captopril.2.2 MN9202对L-Thy所致心肌肥厚大鼠心肌细胞超微结构的影响 大鼠经L-Thy处理12 d后，心肌肌纤维排列紊乱,溶解断裂，线粒体明显肿胀，嵴断裂溶解消失，而对照组心肌纤维排列整齐，Z带清晰可见，富含线粒体并且结构正常. MN9202治疗组，心肌肌丝排列较整齐，仅少数肌丝溶解断裂，Z带较清楚，线粒体轻度肿胀，电子密度基本均匀一致，嵴保存尚完好，阳性对照组，肌纤维结构正常，排列整齐，Z线清晰，线粒体结构基本正常，嵴排列完好. 结果见Fig 1～Fig 4.
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2.3 MN9202对L-Thy所致心肌肥厚大鼠心肌中SOD,GSH-PX活性和MDA含量的影响 连续ip L-Thy 12 d后，大鼠心肌组织中SOD,GSH-PX活性降低，MDA含量升高，与对照组相比差异显著(P<0.01)，给MN9202后，能明显升高肥厚心肌组织的SOD,GSH-PX活性，降低MDA含量，与模型组相比差异显著(P<0.05,0.01)，且呈现剂量依赖关系,结果见Tab 2.
图 1 正常大鼠心肌内线粒体结构完整,肌纤维排列整齐，z带清晰
Fig 1 In normal myocardium of rat, mitochondrion structure integrity, myofibrillae put in order, Z band clear TEM ×15 000
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图 2 肥厚大鼠心肌内线粒体肿胀，嵴断裂溶解,肌纤维排列紊乱
Fig 2 In hypertrophic myocardium of rat, mitochondrion swollen, cristae broken, myofibrillae put mussily TEM ×15 000
图 3 MN9202治疗肥厚大鼠心肌内线粒体轻度肿胀，部分肌纤维溶解
Fig 3 In hypertrophic myocardium of rat treated by MN9202(10 mg.kg-1 ),mitochondrion gently swollen, parts of myofibrillae dissolved TEM ×15 000
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图 4 卡托普利治疗肥厚大鼠心肌内线粒体结构较正常，肌纤维排列整齐，Z带清晰
Fig 4 In hypertrophic myocardium of rat treated by captopril(25 mg.kg-1), mitochondrion structure resume normal, myofibrillae put in order relatively, Z band clear TEM ×15 000
表 2 MN9202对肥厚大鼠心肌组织中SOD,GSH-PX和MDA含量的影响
Tab 2 Effects of MN9202 on myocardial SOD,GSH-PX and MDA contents of hypertrophic heart induced by L-thy in rats (n=6,
±s) Group, 百拇医药
Dose /(mg.kg-1)
SOD/(nmol.s-1
.g-1 protein)
GSH-PX
/(mmol.min-1.g-1 protein)
MDA
/(μmol.g-1 protein)
Control
, http://www.100md.com
Vehicle
670.97±118.19
147.72±24.58
3.51±1.60
L-Thy
Vehicle
399.91± 83.02a
98.53±16.23b
7.37±1.46a
MN9202+L-Thy
0.4
, 百拇医药
487.76± 94.35
113.41±22.48
5.55±1.76
MN9202+L-Thy
2
528.44± 67.68b
129.89±28.06b
5.23±1.51b
MN9202+L-Thy
10
598.62±102.69c
, 百拇医药
139.45±17.45c
4.90±0.84c
Cap+L-Thy
25
585.78±104.18c
134.37±24.53b
4.45±1.21c
aP<0.01 vs control, bP<0.05, cP<0.01 vs L-Thy. Cap:captopril.3 讨论 本实验用连续ip L-甲状腺素的方法建立大鼠心肌肥厚模型，观察给予二氢吡啶类钙拮抗剂MN9202对心肌肥厚大鼠心脏指数，超微结构及SOD,GSH-PX活性和MDA含量的影响，发现心肌肥厚时，心脏指数升高,超微结构发生损伤性病理改变，SOD和GSH-PX活性下降，MDA含量增加，而MN9202能够有效地逆转这些变化. L-Thy诱发的肥厚心肌是研究心肌肥厚生化机制的适宜模型之一[9]. L-Thy可促进大鼠心肌细胞mRNA和蛋白质的合成，使氧化磷酸化脱偶联，ATP合成下降，而细胞氧耗却依然旺盛，最终导致心肌缺血性肥厚[10]，在此病程中，细胞内钙离子水平显著升高，出现细胞内钙超载[11]，Ca2+被公认是细胞生长过程中第二信使，Ca2+通道活化后通过特异的离子流激活胞核基因及增加胞质蛋白质合成，Ca2+超载在心肌肥厚发展中起着非常重要的作用[12]，因此，Ca2+可能作为一个细胞内重要生化信号介导了心肌肥厚反应. 阻止Ca2+内流，维持和恢复细胞内钙稳定，对防止心肌肥厚具有重要意义，临床及动物实验均已证明钙拮抗剂具有较好的防止和逆转心肌肥厚的作用. 我们选择新合成的二氢吡啶类钙拮抗剂MN9202用于L-Thy所致心肌肥厚大鼠，可有效地防止心肌肥厚的形成，使心脏指数明显降低，减轻心肌细胞线粒体，肌原纤维等超微结构的破坏，提示MN9202可能通过其钙拮抗作用，阻止Ca2+的超负荷，从而对抗心肌肥厚的形成. 另一方面，在L-Thy诱发的心肌肥厚病程中，心肌缺血和血流再灌注均不可避免地造成心肌细胞的损害. 大量的中间代谢产物堆积，使氧自由基增多，导致细胞膜脂质过氧化反应，加之SOD,GSH-PX等自由基清除系统的耗竭，使氧自由基过量堆积，损伤细胞膜，导致MDA增多. 因此，氧自由基可能参与L-Thy诱发的心肌肥厚，而氧自由基又可进一步加重钙超载. 本实验观察到MN9202能有效地抑制L-Thy引起的大鼠心肌中SOD，GSH-PX活性降低，增强机体清除O2-的能力，并对抗MDA的升高，提示该化合物除具有Ca2+拮抗作用外，还可能减少氧自由基产生和脂质过氧化反应. 此外，从超微结构显示，心肌肥厚组心肌组织发生明显损伤，而MN9202剂量组及阳性对照组，从损伤程度上可见肌纤维和线粒体结构基本正常，说明MN9202及阳性药卡托普利可减轻心肌肥厚时所致的心肌细胞及亚细胞器结构的损伤和功能的丧失，从而使心肌组织得以保护. 这一结果为扩大MN9202临床应用提供了实验依据.
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作者简介：王剑波(1965-)，男(汉族)，四川省江安县人. 1988年毕业于成都中医药大学，主管药师，发表论文13篇，硕士生(导师赵德化). Tel.(029)3374555 Email.Pharmalwjb@fumm.edu.cn
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收稿日期:1999-12-30
修回日期:2000-01-19, 百拇医药