不同损伤时期血管内膜的增殖和凝血酶的影响
作者：许俊堂 唐朝枢 张 波 刘乃奎 侯 琳 王小红 欧和生 李田昌 胡大一 翁心植
单位：许俊堂 李田昌 胡大一 翁心植 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，心脏中心，北京市，100020；唐朝枢 张 波 刘乃奎 侯 琳 王小红 欧和生 北京医科大学
关键词：平滑肌细胞；凝血酶；增殖细胞核抗原；再狭窄
中国循环杂志990513 摘要：目的:探讨内皮拉伤后血管内膜增殖反应的动态变化,和凝血酶对损伤血管增殖反应的影响。
方法:Fogarty导管拉伤大鼠主动脉,不同时期处死,病理观察血管内膜厚度,免疫组织化学观察增殖细胞核抗原在损伤血管的表达;并将离体的血管环在体外加入不同浓度的凝血酶[0 U/ml(对照组)、1 U/ml(1 U凝血酶组)和5 U/ml(5 U凝血酶组)]培养12小时,测定单位重量血管环氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)的掺入量。
, http://www.100md.com
结果:拉伤后血管内膜/中膜面积值于4～6周达到高峰,7～8周增厚的内膜几乎完全消退。增殖细胞核抗原的表达与血管内膜增殖反应基本一致。3H-TdR掺入于术后3日和3周出现2个高峰。加入凝血酶1 U/ml或5 U/ml,3日的3H-TdR掺入量增加,与0日比较有显著性差异P<0.05,4周后3H-TdR掺入进入低反应期。
结论:血管损伤后3日是细胞分裂最为活跃的时期,对凝血酶促增殖作用也最敏感,4周后为低反应期,因此及早有效抗凝对于控制血管增生和再狭窄有十分重要的意义。
中图分类号：R322.1+2
文献标识码：A
文章编号：1000-3614(1999)05-0289-03
, 百拇医药
Vascular Proliferation in Different Injury Stage and the Effect of Thrombin on It in a Rat Model of Aortic Injury
Xu Juntang,Tang Chaoshu,Zhang Bo,et al.
The Heart Center,Beijing Red Cross Chaoyang Hospital,Capital University of Medical Science,Beijing(100020)
Abstract Objective: To study the dynamic changes of neointimal peoliferation,and the influence of thrombin on vascular proliferative response.
, http://www.100md.com
Methods: The rat aorta were endothelium-denuded by a fogarty catheter.The animals were killed in different postoperative phases for measuring the ratio of intima/media area, counting the expression of proliferative cell nuclear antigen in injured vascular intima by immunohistochemistry.Further,the excised aorta rings were incubated for 12 hours in 1640 medium supplemented with different content of thrombin(0 U/ml,1 U/ml and 5 U/ml).3H-TdR incorporation was determined.
, 百拇医药
Results:Ratio of intima/media peaked at 4-6 weeks,and then regressed to normal by 7～8 weeks.The expression of proliferative cell nuclear antigen showed the similar trend to the proliferative reaction of vascular intima.3H-TdR incorporation showed two peak values at both 3 days and 3 weeks respectively.Along with the addition of thrombin,3H-TdR increased significantly at 3 days compared to 0 day.Four weeks latter,the incorporation of3H-TdR decreased in all three groups.
, http://www.100md.com
Conclusion:Marked cell division occurred at the 3rd day after endothelial denudation,and during this period the reaction of cells to thrombin is most susceptiblle.And then decreases after 4 weeks in all three groups than control.So it very important that early and effective anticoagulation should be administered for avoiding intimal proliferation and formation of restenosis.
Key words Smooth muscle cell; Thrombin;Proliferative cell nuclear antigen;Restenosis
, http://www.100md.com
(Chinese Circulation Journal,1999,14:289.)
凝血酶不但参与凝血过程,还是体内重要的有丝分裂原,与其他生长因子一起促进血管平滑肌增生,与经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)后再狭窄的发生有关[1]。有研究发现,急性冠状动脉综合征(不稳定性心绞痛、非Q波心肌梗塞)6个月后,对病情不稳定的患者,凝血酶的产生仍维持于高水平[2]。了解不同损伤时期血管组织增生情况及其对凝血酶促增生反应的不同,对于抗血栓治疗具有一定的指导意义。本文系列观察拉伤后大鼠主动脉增殖情况,取离体血管环组织培养,观察凝血酶对不同损伤时期血管的促增殖反应。
1 材料和方法
鼠主动脉拉伤模型的制作:雄性Wistar大鼠56只(北京医科大学实验动物科学部),体重280～350 g(310±35 g),鼠龄2～4个月,40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉。颈正中切口分离左侧颈动脉,剥离外膜,远心端切开插入2F fogarty导管,从腹主动脉远端开始充气,向头侧拉伤整个腹主动脉和胸主动脉,不同方向重复3次。动物醒后,送动物房常规饲养。
, http://www.100md.com
取材:血管拉伤后,简单随机按0日、3日、1周、3周、4周、5周和6周、7～8周不同的时期处死。动物预期过量麻醉药全部处死,立刻剪开胸、腹部,分离胸、腹主动脉,修剪后分成4段,自上而下作为对照组(不加凝血酶)、病理取材、1 U 凝血酶组(1 U/ml)和5 U凝血酶组(5 U/ml)。每段血管长10～25 mm,重20～70 g,迅速投入冷的磷酸缓冲液中。
病理检查、图象处理:血管用4%的甲醛固定,石蜡包埋、切片,苏木素伊红(HE)染色。图象处理系统计算内膜/中膜面积值。
免疫组织化学:切片60℃烤箱20分钟,二甲苯脱蜡、酒精脱水,H2O2去除内源性过氧化物酶活性。0.1%胰蛋白酶30分钟,然后1∶10小牛血清滴于铺片处,37℃ 20～30分钟,加增殖细胞核抗原抗体(一抗),4℃过夜。次日加生物素化二抗,37℃ 60分钟。然后加亲和素—生物素复合物(ABC)37℃ 50分钟,二氨基联苯胺—双氧水(DAB-H2O2)显色,镜下控制显色时间,自来水终止显色。部分HE复染核1分钟。酒精脱水,二甲苯透明,固封。
, http://www.100md.com
将每血管不同部位选取10个高倍视野,计算增殖细胞核抗原阳性细胞数,取平均值±标准差为阳性细胞数/高倍视野。
氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入:将血管条在1 ml无血清1640培养基中预孵育30分钟。60分钟后,加3H-TdR,每孔5μCi,过夜。磷酸缓冲液洗两遍,加入液闪瓶。每瓶加0.8 ml甲酸消化,80℃烤箱2小时。碱中和后,加闪烁液至澄清,过液。β液闪仪放射活性测定。
统计学处理:计量资料以
±s表示,同组不同时间参数间的比较采用方差分析,两两对比采用q检验,不同组别间比较采用t检验。P<0.05为有显著性差异。
2 结果
血管的增殖反应见表1。拉伤后血管内膜/中膜面积值于4～6周达到高峰,7～8周内膜增厚几乎完全消退。增殖细胞核抗原主要存在于增厚的内膜细胞核内,与血管增殖反应基本一致。
, 百拇医药
表1 大鼠被拉伤后损伤的血管内膜平均每高倍视野增殖细胞核抗原阳性细胞数
(个)和内膜/中膜面积值在不同损伤时期的变化(n=56*,±s)
0日
3日
1周
3周
4周
5周
6周
7～8周
, http://www.100md.com 增殖细胞核抗原
5±2
6±2
10±5
18±5△
23±8△△△
28±9△△△
20±7△△△
8±4
内膜/中膜面积
0.00±0.01
0.01±0.01
, http://www.100md.com
0.02±0.01
0.16±0.04△△
0.33±0.10△△△
0.34±0.12△△△
0.22±0.06△△△
0.10±0.03
注:与0日比较△P<0.05 △△P<0.01 △△△P<0.001。*各不同时期大鼠n=7
拉伤后不同时期的主动脉环3H-TdR掺入的变化和凝血酶的影响:3组3H-TdR掺入的动态变化见表2,不同损伤时期的离体血管环在1640培养基中培养12小时,3H-TdR掺入于术后3日和3周出现2个高峰。加入凝血酶1 U/ml或5 U/ml,3日3H-TdR掺入量增加,与0日比较有显著性差异(P<0.05),3组所有大鼠于4周后3H-TdR掺入进入低反应期。
, 百拇医药
表2 3组大鼠在不同损伤时期孵育的血管壁3H-TdR掺入的变化和凝血酶的影响(DPM，n=49*，±s) 组别
0日
3日
1周
3周
4周
5周
6～8周
对照组
2957±952
, 百拇医药
4664±1498
3355±1019
4040±1030
2876±988
1795±553
1706±543
1 U凝血酶组
3142±583
5754±1272△
3600±1642
4140±1539
, 百拇医药 3289±1396
1967±822
2194±1162
5 U凝血酶组
3404±1196
6198±1872△
3575±928
4456±1353
3016±812
2015±878
1759±572
注:与0日比较△P<0.05。*各不同时期大鼠n=7,7个时间点共49只大鼠,因后期大鼠内膜增生情况稳定,故将6周和7～8周合并为6～8周
, 百拇医药
3 讨论
伴随着血管的损伤,如PTCA、动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征,凝血系统激活,凝血酶在局部大量形成,不但参与凝血过程形成血栓,还通过其特异性的受体引起血管平滑肌细胞增殖,在PTCA再狭窄的形成中起始动作用[1]。
增殖细胞核抗原是脱氧核糖核酸(DNA)多聚酶的辅助蛋白,参与DNA的合成,代表细胞的分裂增生[3]。本文显示,血管拉伤后4周内膜显著增厚,持续至第6周,至7～8周内膜增厚几乎完全消退,增殖细胞核抗原阳性细胞与血管内膜的增生反应基本一致,说明拉伤的鼠主动脉存在血管内膜修复、增生和消退的动态过程。
伴随血管损伤,离体培养血管环3H-TdR掺入于3日达到高峰,以后逐渐有所下降,至3周出现第2峰,但其峰值低于第1峰。由此可见,血管损伤后3日是细胞分裂最为活跃的时期。本结果与血管损伤后平滑肌细胞的反应时相一致,即符合第1波次(first wave)的中膜平滑肌细胞增殖(3日),然后迁移至内膜,在血管内膜出现第2波次(second wave)的平滑肌细胞增殖(1～3周)[4]。
, 百拇医药
本文结果可见,在培养的血管环中加入1 U/ml或5 U/ml的凝血酶,3日3H-TdR掺入与0日比较有显著性差异P<0.05,说明此期对凝血酶的促增殖反应最为敏感。
本文系统观察了鼠主动脉拉伤后血管平滑肌细胞分裂增殖和内膜增厚的动态变化,并初步探讨不同损伤时期血管对凝血酶促增殖反应的不同,显示及早有效抗凝对于控制损伤—凝血系统激活相关的血管增生和再狭窄具有十分重要的意义,有关问题值得进一步探讨。
*北京市科委科技新星计划资助(No.96116)
作者简介：许俊堂(1963-)，男，副主任医师，博士，主要从事心血管系统血栓学，即心血管血栓、抗栓和纤溶方面的研究
参考文献
1 Fager G.Thrombin and proliferation of vascular smooth muscle cells.Cir Res,1995,77:645—650.
, http://www.100md.com
2 Merlini PA,Bauer KA,Oltrona L,et al.Persistent activation of coagulation mechanism in unstable angina and myocardial infarction.Circulation,1994,90:61—68.
3 Takada M,Tanaka H,Yamada T,et al.Antibody to thrombin receptor inhibits neointimal smooth muscle cell accumulation without causing inhibition of platelet aggregation or altering hemostatic parameters after angioplasty in rat.Circ Res,1998,18:980—987.
4 Libby P,Tanaka H.The molecular bases of restenosis.Prog Cardiovas Dis,1997,40:97—106.
收稿:1999-01-23
修回:1999-07-22, http://www.100md.com
单位：许俊堂 李田昌 胡大一 翁心植 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，心脏中心，北京市，100020；唐朝枢 张 波 刘乃奎 侯 琳 王小红 欧和生 北京医科大学
关键词：平滑肌细胞；凝血酶；增殖细胞核抗原；再狭窄
中国循环杂志990513 摘要：目的:探讨内皮拉伤后血管内膜增殖反应的动态变化,和凝血酶对损伤血管增殖反应的影响。
方法:Fogarty导管拉伤大鼠主动脉,不同时期处死,病理观察血管内膜厚度,免疫组织化学观察增殖细胞核抗原在损伤血管的表达;并将离体的血管环在体外加入不同浓度的凝血酶[0 U/ml(对照组)、1 U/ml(1 U凝血酶组)和5 U/ml(5 U凝血酶组)]培养12小时,测定单位重量血管环氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)的掺入量。
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结果:拉伤后血管内膜/中膜面积值于4～6周达到高峰,7～8周增厚的内膜几乎完全消退。增殖细胞核抗原的表达与血管内膜增殖反应基本一致。3H-TdR掺入于术后3日和3周出现2个高峰。加入凝血酶1 U/ml或5 U/ml,3日的3H-TdR掺入量增加,与0日比较有显著性差异P<0.05,4周后3H-TdR掺入进入低反应期。
结论:血管损伤后3日是细胞分裂最为活跃的时期,对凝血酶促增殖作用也最敏感,4周后为低反应期,因此及早有效抗凝对于控制血管增生和再狭窄有十分重要的意义。
中图分类号：R322.1+2
文献标识码：A
文章编号：1000-3614(1999)05-0289-03
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Vascular Proliferation in Different Injury Stage and the Effect of Thrombin on It in a Rat Model of Aortic Injury
Xu Juntang,Tang Chaoshu,Zhang Bo,et al.
The Heart Center,Beijing Red Cross Chaoyang Hospital,Capital University of Medical Science,Beijing(100020)
Abstract Objective: To study the dynamic changes of neointimal peoliferation,and the influence of thrombin on vascular proliferative response.
, http://www.100md.com
Methods: The rat aorta were endothelium-denuded by a fogarty catheter.The animals were killed in different postoperative phases for measuring the ratio of intima/media area, counting the expression of proliferative cell nuclear antigen in injured vascular intima by immunohistochemistry.Further,the excised aorta rings were incubated for 12 hours in 1640 medium supplemented with different content of thrombin(0 U/ml,1 U/ml and 5 U/ml).3H-TdR incorporation was determined.
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Results:Ratio of intima/media peaked at 4-6 weeks,and then regressed to normal by 7～8 weeks.The expression of proliferative cell nuclear antigen showed the similar trend to the proliferative reaction of vascular intima.3H-TdR incorporation showed two peak values at both 3 days and 3 weeks respectively.Along with the addition of thrombin,3H-TdR increased significantly at 3 days compared to 0 day.Four weeks latter,the incorporation of3H-TdR decreased in all three groups.
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Conclusion:Marked cell division occurred at the 3rd day after endothelial denudation,and during this period the reaction of cells to thrombin is most susceptiblle.And then decreases after 4 weeks in all three groups than control.So it very important that early and effective anticoagulation should be administered for avoiding intimal proliferation and formation of restenosis.
Key words Smooth muscle cell; Thrombin;Proliferative cell nuclear antigen;Restenosis
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(Chinese Circulation Journal,1999,14:289.)
凝血酶不但参与凝血过程,还是体内重要的有丝分裂原,与其他生长因子一起促进血管平滑肌增生,与经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)后再狭窄的发生有关[1]。有研究发现,急性冠状动脉综合征(不稳定性心绞痛、非Q波心肌梗塞)6个月后,对病情不稳定的患者,凝血酶的产生仍维持于高水平[2]。了解不同损伤时期血管组织增生情况及其对凝血酶促增生反应的不同,对于抗血栓治疗具有一定的指导意义。本文系列观察拉伤后大鼠主动脉增殖情况,取离体血管环组织培养,观察凝血酶对不同损伤时期血管的促增殖反应。
1 材料和方法
鼠主动脉拉伤模型的制作:雄性Wistar大鼠56只(北京医科大学实验动物科学部),体重280～350 g(310±35 g),鼠龄2～4个月,40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉。颈正中切口分离左侧颈动脉,剥离外膜,远心端切开插入2F fogarty导管,从腹主动脉远端开始充气,向头侧拉伤整个腹主动脉和胸主动脉,不同方向重复3次。动物醒后,送动物房常规饲养。
, http://www.100md.com
取材:血管拉伤后,简单随机按0日、3日、1周、3周、4周、5周和6周、7～8周不同的时期处死。动物预期过量麻醉药全部处死,立刻剪开胸、腹部,分离胸、腹主动脉,修剪后分成4段,自上而下作为对照组(不加凝血酶)、病理取材、1 U 凝血酶组(1 U/ml)和5 U凝血酶组(5 U/ml)。每段血管长10～25 mm,重20～70 g,迅速投入冷的磷酸缓冲液中。
病理检查、图象处理:血管用4%的甲醛固定,石蜡包埋、切片,苏木素伊红(HE)染色。图象处理系统计算内膜/中膜面积值。
免疫组织化学:切片60℃烤箱20分钟,二甲苯脱蜡、酒精脱水,H2O2去除内源性过氧化物酶活性。0.1%胰蛋白酶30分钟,然后1∶10小牛血清滴于铺片处,37℃ 20～30分钟,加增殖细胞核抗原抗体(一抗),4℃过夜。次日加生物素化二抗,37℃ 60分钟。然后加亲和素—生物素复合物(ABC)37℃ 50分钟,二氨基联苯胺—双氧水(DAB-H2O2)显色,镜下控制显色时间,自来水终止显色。部分HE复染核1分钟。酒精脱水,二甲苯透明,固封。
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将每血管不同部位选取10个高倍视野,计算增殖细胞核抗原阳性细胞数,取平均值±标准差为阳性细胞数/高倍视野。
氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入:将血管条在1 ml无血清1640培养基中预孵育30分钟。60分钟后,加3H-TdR,每孔5μCi,过夜。磷酸缓冲液洗两遍,加入液闪瓶。每瓶加0.8 ml甲酸消化,80℃烤箱2小时。碱中和后,加闪烁液至澄清,过液。β液闪仪放射活性测定。
统计学处理:计量资料以
±s表示,同组不同时间参数间的比较采用方差分析,两两对比采用q检验,不同组别间比较采用t检验。P<0.05为有显著性差异。2 结果
血管的增殖反应见表1。拉伤后血管内膜/中膜面积值于4～6周达到高峰,7～8周内膜增厚几乎完全消退。增殖细胞核抗原主要存在于增厚的内膜细胞核内,与血管增殖反应基本一致。
, 百拇医药
表1 大鼠被拉伤后损伤的血管内膜平均每高倍视野增殖细胞核抗原阳性细胞数
(个)和内膜/中膜面积值在不同损伤时期的变化(n=56*,
±s)0日
3日
1周
3周
4周
5周
6周
7～8周
, http://www.100md.com 增殖细胞核抗原
5±2
6±2
10±5
18±5△
23±8△△△
28±9△△△
20±7△△△
8±4
内膜/中膜面积
0.00±0.01
0.01±0.01
, http://www.100md.com
0.02±0.01
0.16±0.04△△
0.33±0.10△△△
0.34±0.12△△△
0.22±0.06△△△
0.10±0.03
注:与0日比较△P<0.05 △△P<0.01 △△△P<0.001。*各不同时期大鼠n=7
拉伤后不同时期的主动脉环3H-TdR掺入的变化和凝血酶的影响:3组3H-TdR掺入的动态变化见表2,不同损伤时期的离体血管环在1640培养基中培养12小时,3H-TdR掺入于术后3日和3周出现2个高峰。加入凝血酶1 U/ml或5 U/ml,3日3H-TdR掺入量增加,与0日比较有显著性差异(P<0.05),3组所有大鼠于4周后3H-TdR掺入进入低反应期。
, 百拇医药
表2 3组大鼠在不同损伤时期孵育的血管壁3H-TdR掺入的变化和凝血酶的影响(DPM，n=49*，
±s) 组别0日
3日
1周
3周
4周
5周
6～8周
对照组
2957±952
, 百拇医药
4664±1498
3355±1019
4040±1030
2876±988
1795±553
1706±543
1 U凝血酶组
3142±583
5754±1272△
3600±1642
4140±1539
, 百拇医药 3289±1396
1967±822
2194±1162
5 U凝血酶组
3404±1196
6198±1872△
3575±928
4456±1353
3016±812
2015±878
1759±572
注:与0日比较△P<0.05。*各不同时期大鼠n=7,7个时间点共49只大鼠,因后期大鼠内膜增生情况稳定,故将6周和7～8周合并为6～8周
, 百拇医药
3 讨论
伴随着血管的损伤,如PTCA、动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征,凝血系统激活,凝血酶在局部大量形成,不但参与凝血过程形成血栓,还通过其特异性的受体引起血管平滑肌细胞增殖,在PTCA再狭窄的形成中起始动作用[1]。
增殖细胞核抗原是脱氧核糖核酸(DNA)多聚酶的辅助蛋白,参与DNA的合成,代表细胞的分裂增生[3]。本文显示,血管拉伤后4周内膜显著增厚,持续至第6周,至7～8周内膜增厚几乎完全消退,增殖细胞核抗原阳性细胞与血管内膜的增生反应基本一致,说明拉伤的鼠主动脉存在血管内膜修复、增生和消退的动态过程。
伴随血管损伤,离体培养血管环3H-TdR掺入于3日达到高峰,以后逐渐有所下降,至3周出现第2峰,但其峰值低于第1峰。由此可见,血管损伤后3日是细胞分裂最为活跃的时期。本结果与血管损伤后平滑肌细胞的反应时相一致,即符合第1波次(first wave)的中膜平滑肌细胞增殖(3日),然后迁移至内膜,在血管内膜出现第2波次(second wave)的平滑肌细胞增殖(1～3周)[4]。
, 百拇医药
本文结果可见,在培养的血管环中加入1 U/ml或5 U/ml的凝血酶,3日3H-TdR掺入与0日比较有显著性差异P<0.05,说明此期对凝血酶的促增殖反应最为敏感。
本文系统观察了鼠主动脉拉伤后血管平滑肌细胞分裂增殖和内膜增厚的动态变化,并初步探讨不同损伤时期血管对凝血酶促增殖反应的不同,显示及早有效抗凝对于控制损伤—凝血系统激活相关的血管增生和再狭窄具有十分重要的意义,有关问题值得进一步探讨。
*北京市科委科技新星计划资助(No.96116)
作者简介：许俊堂(1963-)，男，副主任医师，博士，主要从事心血管系统血栓学，即心血管血栓、抗栓和纤溶方面的研究
参考文献
1 Fager G.Thrombin and proliferation of vascular smooth muscle cells.Cir Res,1995,77:645—650.
, http://www.100md.com
2 Merlini PA,Bauer KA,Oltrona L,et al.Persistent activation of coagulation mechanism in unstable angina and myocardial infarction.Circulation,1994,90:61—68.
3 Takada M,Tanaka H,Yamada T,et al.Antibody to thrombin receptor inhibits neointimal smooth muscle cell accumulation without causing inhibition of platelet aggregation or altering hemostatic parameters after angioplasty in rat.Circ Res,1998,18:980—987.
4 Libby P,Tanaka H.The molecular bases of restenosis.Prog Cardiovas Dis,1997,40:97—106.
收稿:1999-01-23
修回:1999-07-22, http://www.100md.com