表皮生长因子受体反义RNA表达对乳腺癌细胞恶性表型的抑制作用
作者：范文红 陆应麟 邓凡 葛学铭 刘爽 唐佩弦
单位：100850 北京，中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
关键词：
中华医学杂志981127 表皮生长因子受体是具有酷氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白[1]。为了直接观察EGFR过表达在人类肿瘤中的作用，我们应用反义核酸技术，针对EGFR5′1350 bp片段构建了反义RNA表达质粒pLXSN-AE5′，将其导入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中，观察其对细胞生物学行为的影响。
一、材料和方法
1.质粒、细胞株：含人EGFR全长cDNA端1 350 bp片段的质粒pXEGFR及逆转录病毒表达载体pLXSN，本所保存。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，由北京市肿瘤所孙素莲教授赠送。
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2.EGFR反义RNA表达载体的构建及包装：4.0 kb EGFR cDNA克隆入pUC18载体，构成pUC18-GEFR，经BamHI酶切，液氮冻融法回收EGFR cDNA5′端1 350 bp片段，反向插入到逆转录病毒载体pLXSN，构成重组质粒pLXSN-AE5′。用lipofectamine介导的转染方法，将其导入包装细胞PA317，同时以空载体转染做对照。
3.病毒上清感染受体细胞：按文献[2]方法进行。
4.PCR方法鉴定外源基因的整合：针对载体pLXSN中neo基因设计一对引物(上游引物：5′-GAT GCA ATG CGG C-3′；下游引物5′-GAT AGA AGG CGA TGC GCT GCG AAT CG-3′)，可扩增出433 bp长度的片段。方法参照分子克隆[3]。
5.反转录PCR(RT-PCR)检测外源片段在RNA水平的表达：针对EGFR cDNA5′端1 350 bp的反向序列，设计一对引物(上游引物5′-TTT CTG GCA GTT CTC CTC TC-3′；下游引物：5′-CGC AGT TGG GCA CTT G-3′)，可扩增出512 bp长度的片段，方法参照分子克隆[3]。
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6.测定EGFR表达量的变化：按文献[4]方法进行。用FACS420型流式细胞仪(美国Becton-Dickinson)检测。
7.细胞体外增殖速度测定及软琼脂细胞集落形成实验：按文献[6]方法进行。
8.测细胞周期的变化：用流式细胞仪按文献[5]方法进行。
9细胞对不同基质成分的粘附性实验：按文献[6]方法进行。
二、结果
1.重组质粒pLXSW-AE5′端1 350 bp片段与载体pLXSN连接后，EcoRI酶切鉴定EGFR cDNA的插入方向。反向插入时，酶切产生887 bp和6 337 bp两个片段。
2.外源片段在靶细胞中整合的检测：转染重组质粒的细胞基因组DNA中扩出433 bp片段空白对照细胞中无扩增带，说明外源片段已整合到靶细胞的基因组DNA中(图1)。
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1,9,λDNA(Hind Ш); 2. MDA-MB-231基因组DNA; 3. 转染pLXSN的细
胞基因组DNA; 4~8. 转染pLSXN-AE5'的不同克隆中扩增出的433bp片段
图1 PCR扩增检测外源片段在靶细胞中的整合
1.MDA-MB-231; 2、5 λDAN(Hind Ш/EorRI); 3. MDA-AS8; 4 MDA-AS10
图2 RT-PCR检测外源片段在靶细胞中的表达
3.外源基因的表达：以阳性克隆细胞总RNA为模板，扩增出512 bp片段，对照细胞中无扩增带(图2)，证明转导的EGFR反义cDNA片段已在靶细胞中表达。
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4.EGFR表达量的变化：转导pLXSN-AE5′质粒的2个阳性克隆细胞膜EGFR表达量都明显降低，转导pLXSN的细胞克隆在EGFR的表达上无明显变化。
5.反义EGFR基因转导对靶细胞体外增殖的影响：转导pLXSN的细胞和对照组相比，垃殖情况无明显变化，而转染反义EGFR基因的阳性克隆细胞MDA-AS8、MDA-AS10的增殖受到不同程度的抑制。
6.反义EGFR基因转导对MDA-MB-231细胞周期的影响：见表1。表1 反义EGFR基因转导对MDA细胞周期的影响(细胞数) 细胞种类
细胞周期
G0/G1
S
G2/M
, 百拇医药
PI
MDA-MB-231
53
29
18
0.47
MDA-PL
48
24
28
0.52△
MDA-AS8
64
, 百拇医药
19
16
0.35*
MDA-AS10
67
17
12
0.29*
注：与MDA-MB-231组比较△P>0.05，*P<0.01；PI为增殖指数表2 反义EGFR基因转对MDA细胞生长的影响(
±s) 细胞种类
, 百拇医药
细胞数/皿
集落数
MDA-MB-231
5 000
154±7
MDA-PL
5 000
152±21△
MDA-AS8
5 000
99±21*
MDA-AS10
, http://www.100md.com
5 000
55±12*
注：与MDA-MB-231组比较：△P>0.05，*P>0.01
图3 基因转导前后细胞对层粘连蛋白(LN)的粘附性变化
图4 基因转导前后细胞对纤维粘连蛋白(FN)的粘性附性变化
7.细胞集落形成能力的变化：见表2。
8.转基因前后细胞对不同基质的粘附能力：见图3，图4。
, 百拇医药
三、讨论
本实验中，反义EGFR基轩转导能明显抑制MDA-MB-231细胞的体外增殖速度和在软琼脂中的集落形成能力。但是不同的细胞克隆，增殖速度受抑制的程度不同，经测定细胞膜EGFR的表达量可知，EGFR表达水平下降的细胞增殖速度降低，提示EGFR对MDA-MB-231细胞的增殖起重要作用。细胞周期分析表明，两个反义EGFR转染的细胞克隆S期和G2/M期细胞减少，G0/G1期细胞增加，证明细胞阻滞于G1期。这反映MDA-MB-231细胞的恶性增殖受到部分抑制。另外，我们发现基因转导后，细胞膜EGFR表达量降低的同时，肿瘤细胞对LN及FN的粘附力有不同程度的下降。但对体内肿瘤侵袭转移能力有无影响尚待实验证实。
参考文献
1 Gill GN, Bertics PJ, Santon JB. Epidermal growth factor and its receptor. Molecular and cellular. Endocrinology, 1987,51：169-186.
, http://www.100md.com
2 Miller AD, Miller DG, Garcia JV, et al. Use of retroviral vectors for gene transfer and expression. Mehtods Enzymol, 1993,217：581-599.
3 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.第2版.北京科学出版社，1992.672-681.
4 Mueller H, Loop P, Liu R, et al. Differential signal transduction of epidermal-growth-factor receptors in hormone-dependent and hormone-independent human breast cancer cells. Eur J Biochem, 1994,221：631-637.
, 百拇医药
5 鄂征，陈泉光，徐新来，等.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1993.153-154.
6 Lichtner RB, Kaufmann AM, Kittmann A, et al. Ligand mediated activation of ectopic EGF receptor promotes matrix protein adhesion and lung colonization of rat mammary adenocarcinoma cells. Oncogene, 1995,10：1823-1832.
(收稿：1997-10-22 修回：1998-07-05), 百拇医药
单位：100850 北京，中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
关键词：
中华医学杂志981127 表皮生长因子受体是具有酷氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白[1]。为了直接观察EGFR过表达在人类肿瘤中的作用，我们应用反义核酸技术，针对EGFR5′1350 bp片段构建了反义RNA表达质粒pLXSN-AE5′，将其导入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中，观察其对细胞生物学行为的影响。
一、材料和方法
1.质粒、细胞株：含人EGFR全长cDNA端1 350 bp片段的质粒pXEGFR及逆转录病毒表达载体pLXSN，本所保存。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，由北京市肿瘤所孙素莲教授赠送。
, http://www.100md.com
2.EGFR反义RNA表达载体的构建及包装：4.0 kb EGFR cDNA克隆入pUC18载体，构成pUC18-GEFR，经BamHI酶切，液氮冻融法回收EGFR cDNA5′端1 350 bp片段，反向插入到逆转录病毒载体pLXSN，构成重组质粒pLXSN-AE5′。用lipofectamine介导的转染方法，将其导入包装细胞PA317，同时以空载体转染做对照。
3.病毒上清感染受体细胞：按文献[2]方法进行。
4.PCR方法鉴定外源基因的整合：针对载体pLXSN中neo基因设计一对引物(上游引物：5′-GAT GCA ATG CGG C-3′；下游引物5′-GAT AGA AGG CGA TGC GCT GCG AAT CG-3′)，可扩增出433 bp长度的片段。方法参照分子克隆[3]。
5.反转录PCR(RT-PCR)检测外源片段在RNA水平的表达：针对EGFR cDNA5′端1 350 bp的反向序列，设计一对引物(上游引物5′-TTT CTG GCA GTT CTC CTC TC-3′；下游引物：5′-CGC AGT TGG GCA CTT G-3′)，可扩增出512 bp长度的片段，方法参照分子克隆[3]。
, http://www.100md.com
6.测定EGFR表达量的变化：按文献[4]方法进行。用FACS420型流式细胞仪(美国Becton-Dickinson)检测。
7.细胞体外增殖速度测定及软琼脂细胞集落形成实验：按文献[6]方法进行。
8.测细胞周期的变化：用流式细胞仪按文献[5]方法进行。
9细胞对不同基质成分的粘附性实验：按文献[6]方法进行。
二、结果
1.重组质粒pLXSW-AE5′端1 350 bp片段与载体pLXSN连接后，EcoRI酶切鉴定EGFR cDNA的插入方向。反向插入时，酶切产生887 bp和6 337 bp两个片段。
2.外源片段在靶细胞中整合的检测：转染重组质粒的细胞基因组DNA中扩出433 bp片段空白对照细胞中无扩增带，说明外源片段已整合到靶细胞的基因组DNA中(图1)。
, http://www.100md.com
1,9,λDNA(Hind Ш); 2. MDA-MB-231基因组DNA; 3. 转染pLXSN的细
胞基因组DNA; 4~8. 转染pLSXN-AE5'的不同克隆中扩增出的433bp片段
图1 PCR扩增检测外源片段在靶细胞中的整合
1.MDA-MB-231; 2、5 λDAN(Hind Ш/EorRI); 3. MDA-AS8; 4 MDA-AS10
图2 RT-PCR检测外源片段在靶细胞中的表达
3.外源基因的表达：以阳性克隆细胞总RNA为模板，扩增出512 bp片段，对照细胞中无扩增带(图2)，证明转导的EGFR反义cDNA片段已在靶细胞中表达。
, http://www.100md.com
4.EGFR表达量的变化：转导pLXSN-AE5′质粒的2个阳性克隆细胞膜EGFR表达量都明显降低，转导pLXSN的细胞克隆在EGFR的表达上无明显变化。
5.反义EGFR基因转导对靶细胞体外增殖的影响：转导pLXSN的细胞和对照组相比，垃殖情况无明显变化，而转染反义EGFR基因的阳性克隆细胞MDA-AS8、MDA-AS10的增殖受到不同程度的抑制。
6.反义EGFR基因转导对MDA-MB-231细胞周期的影响：见表1。表1 反义EGFR基因转导对MDA细胞周期的影响(细胞数) 细胞种类
细胞周期
G0/G1
S
G2/M
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PI
MDA-MB-231
53
29
18
0.47
MDA-PL
48
24
28
0.52△
MDA-AS8
64
, 百拇医药
19
16
0.35*
MDA-AS10
67
17
12
0.29*
注：与MDA-MB-231组比较△P>0.05，*P<0.01；PI为增殖指数表2 反义EGFR基因转对MDA细胞生长的影响(
±s) 细胞种类, 百拇医药
细胞数/皿
集落数
MDA-MB-231
5 000
154±7
MDA-PL
5 000
152±21△
MDA-AS8
5 000
99±21*
MDA-AS10
, http://www.100md.com
5 000
55±12*
注：与MDA-MB-231组比较：△P>0.05，*P>0.01
图3 基因转导前后细胞对层粘连蛋白(LN)的粘附性变化
图4 基因转导前后细胞对纤维粘连蛋白(FN)的粘性附性变化
7.细胞集落形成能力的变化：见表2。
8.转基因前后细胞对不同基质的粘附能力：见图3，图4。
, 百拇医药
三、讨论
本实验中，反义EGFR基轩转导能明显抑制MDA-MB-231细胞的体外增殖速度和在软琼脂中的集落形成能力。但是不同的细胞克隆，增殖速度受抑制的程度不同，经测定细胞膜EGFR的表达量可知，EGFR表达水平下降的细胞增殖速度降低，提示EGFR对MDA-MB-231细胞的增殖起重要作用。细胞周期分析表明，两个反义EGFR转染的细胞克隆S期和G2/M期细胞减少，G0/G1期细胞增加，证明细胞阻滞于G1期。这反映MDA-MB-231细胞的恶性增殖受到部分抑制。另外，我们发现基因转导后，细胞膜EGFR表达量降低的同时，肿瘤细胞对LN及FN的粘附力有不同程度的下降。但对体内肿瘤侵袭转移能力有无影响尚待实验证实。
参考文献
1 Gill GN, Bertics PJ, Santon JB. Epidermal growth factor and its receptor. Molecular and cellular. Endocrinology, 1987,51：169-186.
, http://www.100md.com
2 Miller AD, Miller DG, Garcia JV, et al. Use of retroviral vectors for gene transfer and expression. Mehtods Enzymol, 1993,217：581-599.
3 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.第2版.北京科学出版社，1992.672-681.
4 Mueller H, Loop P, Liu R, et al. Differential signal transduction of epidermal-growth-factor receptors in hormone-dependent and hormone-independent human breast cancer cells. Eur J Biochem, 1994,221：631-637.
, 百拇医药
5 鄂征，陈泉光，徐新来，等.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1993.153-154.
6 Lichtner RB, Kaufmann AM, Kittmann A, et al. Ligand mediated activation of ectopic EGF receptor promotes matrix protein adhesion and lung colonization of rat mammary adenocarcinoma cells. Oncogene, 1995,10：1823-1832.
(收稿：1997-10-22 修回：1998-07-05), 百拇医药