不同基因区反义寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒基因表达的比较
作者：钟森 王升启 张定凤 王玉芝 任红 王全立
单位：646000 四川泸州医学院附属医院(钟森)；军事医学科学院(王升启、王玉芝、王全立)；重庆医科大学病毒性肝炎研究所(张定凤、任红)
关键词：寡核苷酸类，反义；肝炎病毒，乙型
中华传染病杂志980104
【摘要】 目的 探讨反义寡核苷酸(ASON)特异性抗病毒作用。方法 在HepG2 2.2.15细胞中观察了4段16聚针对乙型肝炎病毒(HBV)基因不同功能区的ASON对病毒复制的抑制作用。结果 ASON能显著抑制HBV基因的抗原表达(P<0.001)，在S基因区设计的ASON对HBsAg的抑制作用明显优于C基因区的ASON(P<0.05)。反之，在C基因区设计的ASON对HBeAg的抑制作用又明显优于S和Pre-S2基因区的ASON(P<0.01)。4段ASON的联合用药并不能增强其对HBV的抑制作用。结论 ASON可能成为一种有开发潜力的抗病毒药物。
, http://www.100md.com
A comparative research on inhibition of hepatitis B virus replication by antisense oligonucleotides against various gene regions Zhong Sen, Wang Shengqi, Zhang Dingfeng, et al. The Affiliated Hospital, Luzhou Medical College,Luzhou 646000
【Abstract】 Objective In order to study specific antiviral effect of antisense oligonucleotide (ASON). Methods We examined the ability of four 16-mers ASONs,which targeted several HBV-specific functions, to inhibit HBV replication in the HepG2 2.2.15 cells. Results ASONs could inhibit significantly the secretion of HBsAg and HBeAg at a total final concentration of 10μmol/L(P<0.001). ASONs designed against the S gene inhibited the secretion of HBsAg more effectively than those designed against C and pre-C gene regions(P<0.05), while the latter inhibited HBeAg secretion more effectively than the former(P<0.01). Inhibition of HBV gene expression by a mixture of four different ASONs were not more effective than that by a single one. Conclusion ASON seems to be a very potential anti-HBV drug.
, 百拇医药
【Key words】 Oligonucleotides,antisense Hepatitis B virus
为了探讨针对不同基因区设计的ASON对HBV基因表达抑制的影响，本实验以HepG22.2.15细胞为研究对象，合成了与HBV mRNA前S2(Pre-S2)和S基因起始部位、多聚腺苷酸(Poly A)增加信号位点以及U5样序列区互补的4段16聚硫代磷酸ASON，通过检测作用细胞培养上清液中病毒蛋白分泌情况，对上述4段ASON的抗-HBV作用进行了比较研究。
材料与方法
一、材料
RPMI1640购自Sigma公司；G418为美国GI BCO公司产品；小牛血清为成都华西生化厂产品；实验细胞模型为1986年美国西奈山医学中心Sells等应用克隆双体HBV DNA基因转染HepG2细胞的2.2.15细胞株。HBsAg、HBeAg的ELISA检测试剂盒购自华美生物工程公司。
, 百拇医药
二、方法
(一)2.2.15细胞的培养及HBsAg和HBeAg分泌规律测定 参照文献[1]进行。
(二)ASON的合成 16聚硫代磷酸脱氧核苷的化学合成在美国ABI公司391A PCR MATE EP DNA合成仪上自动进行，纯化后纯度>99%。我们选择互补于病毒mRNA的4个位点并合成了4段16聚ASON。同时设无关序列(Ⅴ)作对照。硫代磷酸ASON碱基序列及作用位点见表1。
表1 ASON的序列选择及作用位点 序列
编号
核苷酸
位置
碱基序列(5′～3′) 作用位点
, 百拇医药
Ⅰ
151～166
TGTTCTCCATGTTCAG S基因起始区
Ⅱ
1890～1905
CATGCCCCAAAGCCAC U5样序列
Ⅲ
1918～1933
CTCCAAATTCTTTATA Poly A增加信号序列
Ⅳ
3206～3221
, 百拇医药
CCACTGCATGGCCTGA Pre-S2基因起始区
Ⅴ
AGTCAGTCAGTCAGTC 无关序列
(三)抗病毒活性测定 研究分3个实验组，即ASON组，共4个样品，根据需要设置不同的浓度；无关序列组，碱基数目与ASON相同但不与病毒mRNA互补；联合用药组，即序列Ⅰ～Ⅳ混合使用，每组每份样品浓度做3个复孔。将ASON作用于2.2.15细胞后，定期检测培养上清液中HBsAg和HBeAg含量，采用双抗体夹心法，酶标仪读数，结果以阳性孔A值/阴性孔A值(P/N值)表示。另设不含药物的2.2.15细胞作对照，并与实验组同步测定HBsAg和HBeAg含量。ASON对HBsAg和HBeAg的抑制率由如下公式计算：
抑制率=(实验孔X-对照孔X)÷(对照孔X-2.1)×100%
, 百拇医药
(X为HBsAg或HBeAg的P/N值)
(四)细胞和活细胞计数以及细胞毒性试验[2] 细胞计数用常规血球计数板计数；活细胞计数用0.5%台酚蓝与等量细胞液混合，染色3～5分钟进行计数，着色细胞为死细胞，不着色细胞为活细胞。
(五)统计学处理 数值比较用卡方及其分割检验。
结果
一、2.2.15细胞病毒抗原分泌规律
将2.2.15细胞按1×105/孔接种于24孔培养板中，每孔含培养液1ml，每天收集培养上清液200μl用于检测HBsAg和HBeAg，并更换培养液。2.2.15细胞经传代后第1天即可在培养上清液中检测出HBsAg和HBeAg，随着培养时间的延长，病毒抗原的分泌量逐渐增加，至培养后第8天达到高峰，并趋于稳定分泌(表2)。
, 百拇医药
表2 HBsAg和HBeAg的分泌量(P/N值) 抗 原
培 养 天 数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
HBsAg
, 百拇医药
2.4
3.6
4.2
5.7
7.1
7.3
7.7
9.1
9.0
9.2
HBeAg
3.5
4.5
, http://www.100md.com
5.7
6.8
9.5
9.8
11.2
12.5
12.8
12.7
二、ASON对病毒蛋白分泌的抑制作用
2.2.15细胞在传代后当天即加入ASON序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以及Ⅰ～Ⅳ的混合序列，根据预试结果，ASON的作用浓度选用2μmol/L。以后每天取200μl测定HBsAg和HBeAg，并换含药培养液，连续测定10天。同时设序列Ⅴ为对照组，用药浓度及其他实验条件与实验组相同。
, 百拇医药
ASON对HBsAg分泌的抑制作用在加药后第1天即出现，一般在第5天达到高峰，抑制率在75%～88%左右，其中以序列Ⅰ抑制作用最强，可达88%，随后抑制作用逐渐减弱，序列Ⅰ～Ⅳ和联合用药组对HBsAg的抑制强度依次为Ⅰ>Ⅳ>联合用药>Ⅲ>Ⅱ。无关序列Ⅴ对HBsAg的抑制率甚微，为6%～11%之间。
与此同时，在用药后第1天，ASON对HBeAg也产生一定的抑制作用，到第5～6天抑制率最强，大约在50%～70%左右，其中序列Ⅱ抑制率最强为75%，高峰抑制效应持续时间相对短暂，1～2天后即较快减弱。序列Ⅰ～Ⅳ和联合用药组对HBeAg的抑制强度依次为Ⅱ>Ⅲ>联合用药>Ⅳ>Ⅰ。无关序列Ⅴ对HBeAg的抑制率为8%～15%。
三、ASON抗病毒作用的比较研究
2.2.15细胞按上述方法培养并加入ASON，至培养第5天检测上清液HBsAg和HBeAg水平如表3所示。
, 百拇医药
表3 ASON对病毒抗原分泌抑制作用的比较 样 本
抑 制 率 (%)
HBsAg
HBeAg
Ⅰ
88
55
Ⅱ
75
75
Ⅲ
77
71
, http://www.100md.com
Ⅳ
85
50
Ⅰ～Ⅳ
83
59
Ⅴ
7
9
经χ2及其分割检验证实，与对照组相比ASON能显著抑制2.2.15细胞HBsAg或HBeAg的分泌(P<0.001)，其中针对HBsAg而言，序列Ⅰ抑制作用比序列Ⅱ和Ⅲ强(P<0.02和P<0.05)；针对HBeAg而言，序列Ⅱ和Ⅲ的抑制作用比序列Ⅰ和Ⅳ强(P<0.01)，其他组间差异无显著性。
, http://www.100md.com
四、ASON对细胞的毒性观察
在培养时间内，含寡核苷酸的2.2.15细胞的生长、形态和活细胞比例与不加药物的细胞相比无明显差别，各段寡核苷酸在浓度为0.1、1、10和100μmol/L时，在同等培养条件下未见明显细胞病变。
讨论
我们设计的4段ASON中，序列Ⅰ和Ⅳ分别为针对S基因和Pre-S2基因翻译起始区(含ATG)与mRNA互补的16聚ASON。两者对HBsAg的抑制率分别为88%和85%，对HBeAg的抑制率为55%和50%。这一结果与其他作者在类似实验条件下所获得的结果基本一致[3]，而略低于从PLC/PRF/5细胞中所观察到的研究结果[4]，推测可能是由于不同的作用细胞对ASON敏感性不同所致。
序列Ⅱ、Ⅲ是根据Pre-C和C基因的高度保守区设计的。序列Ⅱ是与C基因起始码5′端上游(包括ATG)16个核苷酸互补的ASON，其对HBeAg表现为较强的抑制作用，抑制率为75%。作者目前尚未见到有关在该区域设计ASON的报道。序列Ⅲ位于Poly A增加信号序列，对HBeAg的产生也呈现较高的抑制率(71%)，明显高于在该区设计的21聚ASON[5]，可见ASON的长度不同对其活性也有较大影响。
, 百拇医药
4段ASON均能明显抑制2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌，而无关序列的抑制作用甚微。从总体来讲，针对S基因的ASON对HBsAg的抑制作用优于针对Pre-C和C基因区的ASON；相反，后者对HBeAg的抑制作用又优于前者。由此可见，ASON的抗HBV作用是由序列特异性所决定的，针对不同基因区设计的ASON对该基因区相应的编码蛋白也显示出较强的抑制作用。此外在本实验中未观察到ASON的细胞毒作用。
本研究还发现，ASON的联合用药对HBV的抑制作用并不完全优于单独用药，其原因还不清楚，是否与ASON间相互形成二聚体或多聚体从而降低其透膜性和杂交能力有关还有待进一步的实验加以证实。
本课题获国家自然科学基金资助
参考文献
1 钟森，张定凤，温守明，等.反义寡核苷酸靶向肝细胞体外抗乙型肝炎病毒实验研究.中华医学杂志，1995，75：392-395.
, 百拇医药
2 吴祥甫，汪垣，李载平，等.互补寡核苷酸-多聚赖氨酸对乙肝病毒表面抗原表达的抑制.生物化学与生物物理学报， 1992，24：219-223.
3 姚志强，周永兴，王爱莲，等.反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒的体外抗病毒作用.中华医学杂志，1994，72：74-76.
4 Goodarzi G, Gross SC, Tewari A, et al. Antisense oligodeoxy-
ribonucleotides inhibit the expression of the gene of hepatitis B virus surface antigen. J Gen Virol,1990,71:3021-3025.
5 Wu GY, Wu CH. Specific inhibition of hepatitis B viral gene expression in vitro by targeted antisense oligonucleotides. J Biol Chem,1992,267:12436-12439., 百拇医药
单位：646000 四川泸州医学院附属医院(钟森)；军事医学科学院(王升启、王玉芝、王全立)；重庆医科大学病毒性肝炎研究所(张定凤、任红)
关键词：寡核苷酸类，反义；肝炎病毒，乙型
中华传染病杂志980104
【摘要】 目的 探讨反义寡核苷酸(ASON)特异性抗病毒作用。方法 在HepG2 2.2.15细胞中观察了4段16聚针对乙型肝炎病毒(HBV)基因不同功能区的ASON对病毒复制的抑制作用。结果 ASON能显著抑制HBV基因的抗原表达(P<0.001)，在S基因区设计的ASON对HBsAg的抑制作用明显优于C基因区的ASON(P<0.05)。反之，在C基因区设计的ASON对HBeAg的抑制作用又明显优于S和Pre-S2基因区的ASON(P<0.01)。4段ASON的联合用药并不能增强其对HBV的抑制作用。结论 ASON可能成为一种有开发潜力的抗病毒药物。
, http://www.100md.com
A comparative research on inhibition of hepatitis B virus replication by antisense oligonucleotides against various gene regions Zhong Sen, Wang Shengqi, Zhang Dingfeng, et al. The Affiliated Hospital, Luzhou Medical College,Luzhou 646000
【Abstract】 Objective In order to study specific antiviral effect of antisense oligonucleotide (ASON). Methods We examined the ability of four 16-mers ASONs,which targeted several HBV-specific functions, to inhibit HBV replication in the HepG2 2.2.15 cells. Results ASONs could inhibit significantly the secretion of HBsAg and HBeAg at a total final concentration of 10μmol/L(P<0.001). ASONs designed against the S gene inhibited the secretion of HBsAg more effectively than those designed against C and pre-C gene regions(P<0.05), while the latter inhibited HBeAg secretion more effectively than the former(P<0.01). Inhibition of HBV gene expression by a mixture of four different ASONs were not more effective than that by a single one. Conclusion ASON seems to be a very potential anti-HBV drug.
, 百拇医药
【Key words】 Oligonucleotides,antisense Hepatitis B virus
为了探讨针对不同基因区设计的ASON对HBV基因表达抑制的影响，本实验以HepG22.2.15细胞为研究对象，合成了与HBV mRNA前S2(Pre-S2)和S基因起始部位、多聚腺苷酸(Poly A)增加信号位点以及U5样序列区互补的4段16聚硫代磷酸ASON，通过检测作用细胞培养上清液中病毒蛋白分泌情况，对上述4段ASON的抗-HBV作用进行了比较研究。
材料与方法
一、材料
RPMI1640购自Sigma公司；G418为美国GI BCO公司产品；小牛血清为成都华西生化厂产品；实验细胞模型为1986年美国西奈山医学中心Sells等应用克隆双体HBV DNA基因转染HepG2细胞的2.2.15细胞株。HBsAg、HBeAg的ELISA检测试剂盒购自华美生物工程公司。
, 百拇医药
二、方法
(一)2.2.15细胞的培养及HBsAg和HBeAg分泌规律测定 参照文献[1]进行。
(二)ASON的合成 16聚硫代磷酸脱氧核苷的化学合成在美国ABI公司391A PCR MATE EP DNA合成仪上自动进行，纯化后纯度>99%。我们选择互补于病毒mRNA的4个位点并合成了4段16聚ASON。同时设无关序列(Ⅴ)作对照。硫代磷酸ASON碱基序列及作用位点见表1。
表1 ASON的序列选择及作用位点 序列
编号
核苷酸
位置
碱基序列(5′～3′) 作用位点
, 百拇医药
Ⅰ
151～166
TGTTCTCCATGTTCAG S基因起始区
Ⅱ
1890～1905
CATGCCCCAAAGCCAC U5样序列
Ⅲ
1918～1933
CTCCAAATTCTTTATA Poly A增加信号序列
Ⅳ
3206～3221
, 百拇医药
CCACTGCATGGCCTGA Pre-S2基因起始区
Ⅴ
AGTCAGTCAGTCAGTC 无关序列
(三)抗病毒活性测定 研究分3个实验组，即ASON组，共4个样品，根据需要设置不同的浓度；无关序列组，碱基数目与ASON相同但不与病毒mRNA互补；联合用药组，即序列Ⅰ～Ⅳ混合使用，每组每份样品浓度做3个复孔。将ASON作用于2.2.15细胞后，定期检测培养上清液中HBsAg和HBeAg含量，采用双抗体夹心法，酶标仪读数，结果以阳性孔A值/阴性孔A值(P/N值)表示。另设不含药物的2.2.15细胞作对照，并与实验组同步测定HBsAg和HBeAg含量。ASON对HBsAg和HBeAg的抑制率由如下公式计算：
抑制率=(实验孔X-对照孔X)÷(对照孔X-2.1)×100%
, 百拇医药
(X为HBsAg或HBeAg的P/N值)
(四)细胞和活细胞计数以及细胞毒性试验[2] 细胞计数用常规血球计数板计数；活细胞计数用0.5%台酚蓝与等量细胞液混合，染色3～5分钟进行计数，着色细胞为死细胞，不着色细胞为活细胞。
(五)统计学处理 数值比较用卡方及其分割检验。
结果
一、2.2.15细胞病毒抗原分泌规律
将2.2.15细胞按1×105/孔接种于24孔培养板中，每孔含培养液1ml，每天收集培养上清液200μl用于检测HBsAg和HBeAg，并更换培养液。2.2.15细胞经传代后第1天即可在培养上清液中检测出HBsAg和HBeAg，随着培养时间的延长，病毒抗原的分泌量逐渐增加，至培养后第8天达到高峰，并趋于稳定分泌(表2)。
, 百拇医药
表2 HBsAg和HBeAg的分泌量(P/N值) 抗 原
培 养 天 数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
HBsAg
, 百拇医药
2.4
3.6
4.2
5.7
7.1
7.3
7.7
9.1
9.0
9.2
HBeAg
3.5
4.5
, http://www.100md.com
5.7
6.8
9.5
9.8
11.2
12.5
12.8
12.7
二、ASON对病毒蛋白分泌的抑制作用
2.2.15细胞在传代后当天即加入ASON序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以及Ⅰ～Ⅳ的混合序列，根据预试结果，ASON的作用浓度选用2μmol/L。以后每天取200μl测定HBsAg和HBeAg，并换含药培养液，连续测定10天。同时设序列Ⅴ为对照组，用药浓度及其他实验条件与实验组相同。
, 百拇医药
ASON对HBsAg分泌的抑制作用在加药后第1天即出现，一般在第5天达到高峰，抑制率在75%～88%左右，其中以序列Ⅰ抑制作用最强，可达88%，随后抑制作用逐渐减弱，序列Ⅰ～Ⅳ和联合用药组对HBsAg的抑制强度依次为Ⅰ>Ⅳ>联合用药>Ⅲ>Ⅱ。无关序列Ⅴ对HBsAg的抑制率甚微，为6%～11%之间。
与此同时，在用药后第1天，ASON对HBeAg也产生一定的抑制作用，到第5～6天抑制率最强，大约在50%～70%左右，其中序列Ⅱ抑制率最强为75%，高峰抑制效应持续时间相对短暂，1～2天后即较快减弱。序列Ⅰ～Ⅳ和联合用药组对HBeAg的抑制强度依次为Ⅱ>Ⅲ>联合用药>Ⅳ>Ⅰ。无关序列Ⅴ对HBeAg的抑制率为8%～15%。
三、ASON抗病毒作用的比较研究
2.2.15细胞按上述方法培养并加入ASON，至培养第5天检测上清液HBsAg和HBeAg水平如表3所示。
, 百拇医药
表3 ASON对病毒抗原分泌抑制作用的比较 样 本
抑 制 率 (%)
HBsAg
HBeAg
Ⅰ
88
55
Ⅱ
75
75
Ⅲ
77
71
, http://www.100md.com
Ⅳ
85
50
Ⅰ～Ⅳ
83
59
Ⅴ
7
9
经χ2及其分割检验证实，与对照组相比ASON能显著抑制2.2.15细胞HBsAg或HBeAg的分泌(P<0.001)，其中针对HBsAg而言，序列Ⅰ抑制作用比序列Ⅱ和Ⅲ强(P<0.02和P<0.05)；针对HBeAg而言，序列Ⅱ和Ⅲ的抑制作用比序列Ⅰ和Ⅳ强(P<0.01)，其他组间差异无显著性。
, http://www.100md.com
四、ASON对细胞的毒性观察
在培养时间内，含寡核苷酸的2.2.15细胞的生长、形态和活细胞比例与不加药物的细胞相比无明显差别，各段寡核苷酸在浓度为0.1、1、10和100μmol/L时，在同等培养条件下未见明显细胞病变。
讨论
我们设计的4段ASON中，序列Ⅰ和Ⅳ分别为针对S基因和Pre-S2基因翻译起始区(含ATG)与mRNA互补的16聚ASON。两者对HBsAg的抑制率分别为88%和85%，对HBeAg的抑制率为55%和50%。这一结果与其他作者在类似实验条件下所获得的结果基本一致[3]，而略低于从PLC/PRF/5细胞中所观察到的研究结果[4]，推测可能是由于不同的作用细胞对ASON敏感性不同所致。
序列Ⅱ、Ⅲ是根据Pre-C和C基因的高度保守区设计的。序列Ⅱ是与C基因起始码5′端上游(包括ATG)16个核苷酸互补的ASON，其对HBeAg表现为较强的抑制作用，抑制率为75%。作者目前尚未见到有关在该区域设计ASON的报道。序列Ⅲ位于Poly A增加信号序列，对HBeAg的产生也呈现较高的抑制率(71%)，明显高于在该区设计的21聚ASON[5]，可见ASON的长度不同对其活性也有较大影响。
, 百拇医药
4段ASON均能明显抑制2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌，而无关序列的抑制作用甚微。从总体来讲，针对S基因的ASON对HBsAg的抑制作用优于针对Pre-C和C基因区的ASON；相反，后者对HBeAg的抑制作用又优于前者。由此可见，ASON的抗HBV作用是由序列特异性所决定的，针对不同基因区设计的ASON对该基因区相应的编码蛋白也显示出较强的抑制作用。此外在本实验中未观察到ASON的细胞毒作用。
本研究还发现，ASON的联合用药对HBV的抑制作用并不完全优于单独用药，其原因还不清楚，是否与ASON间相互形成二聚体或多聚体从而降低其透膜性和杂交能力有关还有待进一步的实验加以证实。
本课题获国家自然科学基金资助
参考文献
1 钟森，张定凤，温守明，等.反义寡核苷酸靶向肝细胞体外抗乙型肝炎病毒实验研究.中华医学杂志，1995，75：392-395.
, 百拇医药
2 吴祥甫，汪垣，李载平，等.互补寡核苷酸-多聚赖氨酸对乙肝病毒表面抗原表达的抑制.生物化学与生物物理学报， 1992，24：219-223.
3 姚志强，周永兴，王爱莲，等.反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒的体外抗病毒作用.中华医学杂志，1994，72：74-76.
4 Goodarzi G, Gross SC, Tewari A, et al. Antisense oligodeoxy-
ribonucleotides inhibit the expression of the gene of hepatitis B virus surface antigen. J Gen Virol,1990,71:3021-3025.
5 Wu GY, Wu CH. Specific inhibition of hepatitis B viral gene expression in vitro by targeted antisense oligonucleotides. J Biol Chem,1992,267:12436-12439., 百拇医药