SD鼠未成熟心肌细胞缺氧/复氧期c-fos，c-myc mRNA的表达
作者：康进朝 刘维永 蔡振杰 李彤
单位：康进朝(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；蔡振杰(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；李彤(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：原癌基因；心肌细胞；缺氧/复氧损伤
第四军医大学学报000521 摘 要： 目的 研究未成熟心肌细胞缺氧/复氧期间c-fos，c-myc的表达. 方法 建立SD大鼠未成熟心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型，应用原位分子杂交技术，观察c-fos，c-myc在心肌细胞核内的表达. 结果 未成熟心肌细胞在缺氧前c-fos，c-myc mRNA无表达， 对照(Ⅰ)组和(Ⅱ)组c-fos，c-myc mRNA在缺氧120 min开始表达，复氧60 min表达程度进一步升高. 牛磺酸保护组(Ⅲ组)在缺氧120 min时c-fos，c-myc mRNA为阴性表达，在复氧60 min时仅有弱阳性表达. 结论 c-fos，c-myc mRNA表达程度与心肌细胞损伤程度以及心肌细胞内游离钙浓度的变化密切相关，c-fos，c-myc基因表达可能对心肌细胞的损伤、修复或增殖起调控作用.
, http://www.100md.com
中图号：R654.1 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0586-03
Expression of oncogene c-fos, c-myc in SD rat immature myocardium during hypoxia/reoxygenation
KANG Jin-Chao, LIU Wei-Yong, CAI Zhen-Jie, LI Tong
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To study the expression and significance of oncogene c-fos, c-myc mRNA in hypoxia and reoxygenation of immature myocytes. METHODS A model of original cultural myocytes of neonatal SD rat and hypoxia-reoxygenation injury of immature myocytes was established. By in situ hybridization methods, we studied the expression of oncogene c-fos, c-myc mRNA in hypoxia and reoxygenation injury of immature cardiac myocytes. RESULTS The c-fos， c-myc mRNA of immature myocytes were negative expression before hypoxia. Group I and Ⅱ showed positive expression at 120 min after hypoxia. The expression of c-fos，c-myc mRAN was strong at 60 min after reoxygenation. In group Ⅲ, the expression of c-fos， c-myc mRNA was negative at 120 min after hypoxia. The c-fos， c-myc mRNA expressed slightly only at 60 min after reoxygenation in group Ⅲ. CONCLUSION Expression of c-fos and c-myc mRNA may be closely related to damage and repairing of myocardial cell as well as intracellular free Ca2+ concentration. The expression of c-fos， c-myc mRNA might act as modulators of the procedure of injury, repairing or and proliferating of cardiac myocytes.
, 百拇医药
Keywords: protooncogene; myocytes; hypoxia-reoxygenation injury
0 引言
近年来，对未成熟心肌细胞缺血再灌注损伤及其保护的研究，已深入到亚细胞和分子水平. 我们应用原位分子杂交技术，对未成熟心肌细胞缺氧/复氧期间原癌基因c-fos，c-myc的表达进行研究. 并应用牛磺酸对缺氧/复氧未成熟心肌细胞进行保护，以探讨c-fos, c-myc基因表达与未成熟心肌细胞缺氧/复氧损伤的关系，从分子水平来研究缺氧/复氧损伤的发生机制.
1 材料和方法
1.1 材料 SD乳鼠心肌细胞培养按李连达[1]的方法稍加改进，取出生1～3 d SD乳鼠心肌细胞分离培养3～4 d，培养液用DMEM培养基含200 mL.L-1小牛血清. 未成熟心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型的建立：取培养3 d，生长良好的SD鼠未成熟心肌细胞，预先用999 mL.L-1高纯氮气饱和无糖Hanks液及各组保护液分别代替培养液，并通过7号针头充入上述高纯氮气1 min， 以置换培养瓶内空气，氮气流量为1 L.min-1，然后塞紧瓶塞，静止培养(37℃ CO2培养箱内).
, 百拇医药
1.2 方法 在培养瓶内先放入盖玻片条，使心肌细胞在盖玻片上贴壁生长，培养3～4 d，取生长良好的18瓶未成熟心肌细胞，随机分为： ①对照(Ⅰ)组(缺氧缺糖后再复氧给糖组)， 缺氧缺糖120 min后再换入正常培养液， 而模拟“再复氧”60 min； ②St. Thomas'Ⅱ号液保护(Ⅱ)组，缺氧120 min再复氧60 min；③St. Thomas'Ⅱ液+牛磺酸(Ⅲ)组(牛磺酸20 mmol.L-1). 对照实验，阳性对照：已知SD胎鼠心肌细胞c-fos，c-myc基因为阳性表达；空白对照：0.01 mol.L-1 PBS替代cDNA探针；替代对照：人乳头状病毒HPV基因探针替代cDNA探针. 应用原位分子杂交技术(药品由北京中山生物技术有限公司及德国Bochringer Maanheim公司提供). 标本先用丙酮4℃下固定15～20 min. 杂交具体步骤: ①0.01 mol.L-1 PBS冲洗2～3次. ②用3 mL.L-1双氧水封密30 min. ③ 0.2 mol.L-1盐酸浸泡10 min， 0.01 mol.L-1 PBS冲洗3次5 min. ④25 mg.L-1蛋白酶K消化. ⑤杂交变性：滴加杂交液(内含cDNA探针). (每张标本25 μL)放入铝饭盒中，上加清洁盖玻片，96℃～98℃变性10 min. 凉水(15℃)至冷5 min. 置于42℃温箱中杂交过夜. ⑥洗涤显色，2×SSC共35 min，1×SSC 37℃ 15 min，室温15 min. ⑦正常羊血清(NSS)封密，滴加抗体复合物500 μL及NSS+(dig-AP) 1 μL. ⑧洗涤、显色、终止反应，自来水冲洗，镜下控制. ⑨树脂胶封片，光学显微镜拍照，随机15～20个视野进行拍摄(OLYMPUS-1，照像系统OLYMPUSBH-2). ⑩ MISA-300型图像自动分析仪图像分析. 应用荧光指示剂法[2,3]测定心肌内游离钙离子的浓度，细胞孵育液内肌酸磷酸激酶(CPK)用美国Beckman-700型自动生化分析仪测定各时间点的变化，含量以标准国际单位表示(U.L-1).
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2 结果
2.1 c-fos, c-myc基因的表达 对照(Ⅰ)组：缺氧前c-fos，c-myc mRNA为阴性表达，缺氧120 min在心肌细胞核内出现阳性表达，复氧30和60 min保持较高水平表达，呈强阳性. St. Thomas'Ⅱ液(Ⅱ)组：缺氧前c-fos，c-myc mRNA无表达，缺氧120 min呈弱阳性表达，复氧30和60 min均为阳性表达，与对照组相比表达程度明显减弱(P<0.05, Tab 1). St. Thomas'Ⅱ液+牛磺酸(Ⅲ)组：缺氧前及缺氧120 min, c-fos， c-myc mRNA均无表达，复氧60 min为弱阳性表达，与对照组相比表达程度显著减弱(P<0.01)，与Ⅱ组比较表达程度也明显下降(P<0.05).
表1 c-fos, c-myc基因在缺氧/复氧期的表达
Tab 1 c-fos & c-myc mRNA expression
, 百拇医药
during hypoxia/reoxygenation (A value, n=6,
±s) Gene
Group
Before
hypoxia
Hypoxia
120 min
Reoxygena-
tion 30 min
Reoxygena-
tion 60 min
, 百拇医药
c-fos
Ⅰ
48±13
166±28
236±41
234±45
Ⅱ
46±11
109±19a
168±33a
158±37a
Ⅲ
, http://www.100md.com
49±14
67±18b
92±25b
129±23b
c-myc
Ⅰ
38± 9
170±34
210±43
221±48
Ⅱ
36± 7
, http://www.100md.com
137±28a
163±37a
170±42a
Ⅲ
39±10
50±12b
87±21b
109±18b
aP<0.05, bP<0.01 vs Ⅰ.2.2 细胞内游离钙浓度的变化 对照(Ⅰ)组：缺氧120 min游离钙浓度无明显变化，复氧30 min明显升高，到60 min有回落，但仍明显高于缺氧前水平(P<0.01, Tab 2). St. Thomas'Ⅱ液(Ⅱ)组：缺氧120 min心肌细胞内游离钙浓度无明显改变，复氧30和60 min显著升高，然仍低于对照组相应时间点的细胞内游离钙水平(P<0.01). St. Thomas'Ⅱ液+牛磺酸(Ⅲ)组：缺氧120 min细胞内游离钙浓度略有下降，复氧30和60 min时心肌细胞内游离钙浓度有所升高，但与缺氧前及缺氧120 min的游离钙水平相比较，无显著差异(P<0.05)；与Ⅱ组相比在复氧各相应时间点则有明显下降(P<0.01).
, 百拇医药
表2 缺氧/复氧期间心肌细胞内游离钙浓度和肌酸磷酸激酶释放的变化
Tab 2 Intracellular free Ca2+ concentration and CPK release from myocytes during hypoxia and reoxygenation (n=6,±s) Item
Group
Before hypoxia
Hypoxia 120 min
Reoxygenation 30 min
Reoxygenation 60 min
, http://www.100md.com
c(free Ca2+)/(nmol.L-1)
Ⅰ
203 ±40
201 ±38
1012 ±123
1008 ±118
Ⅱ
208 ±33
196 ±32
488 ± 80a
472 ± 69a
, 百拇医药
Ⅲ
210 ±42
200 ±38
280 ± 41b
270 ± 36b
b(CPK)/(U.L-1)
Ⅰ
8.25± 1.82
34.62± 4.57
52.58± 7.32
50.61± 7.39
, 百拇医药
Ⅱ
8.36± 1.83
16.19± 2.98a
25.37± 4.05a
24.17± 3.96a
Ⅲ
9.12± 2.12
11.07± 2.53b
13.78± 2.49b
13.63± 2.51b
, 百拇医药
aP<0.05, bP<0.01 vs Ⅰ.2.3 心肌细胞肌酸磷酸激酶释放的变化 对照组(Ⅰ)组：缺氧120 min心肌细胞CPK释放较缺氧前明显升高(P<0.05)，复氧30和60 min急剧上升且保持较高水平. Ⅱ组：缺氧120 min，复氧30和60 min较缺氧前有明显增高(P<0.05)，但均显著低于对照组相应时间点的CPK释放量(P<0.05). Ⅲ组：缺氧120 min，复氧30和60 min，心肌细胞CPK释放量均较缺氧前有所升高，但升高不显著(P<0.05)，且在各相应时间点较Ⅱ组的细胞CPK释放量为低(P<0.01).
3 讨论
心肌缺血再灌注损伤会诱导原癌基因c-fos，c-myc和c-Jun的表达[4]. c-myc基因的表达与细胞增殖和细胞凋亡密切相关，凋亡现象可能存在于心肌细胞缺血再灌注损伤过程中，并有可能成为各种损伤因素如氧自由基及钙超载的始发环节[5,6]. 本实验对照(Ⅰ)组和St. Thomas'Ⅱ液(Ⅱ)组心肌细胞缺氧120 min、复氧30和60 min均有c-fos，c-myc原癌基因的表达，伴有明显的细胞内游离钙超载. c-fos，c-myc基因表达程度与细胞损伤程度以及细胞内游离钙水平有相关性，而且在本组条件下心肌细胞复氧期损伤较重，细胞内游离钙水平越高，c-fos，c-myc基因表达也就越显著. 在牛磺酸保护(Ⅲ)组，细胞内游离钙在复氧时升高不明显，此期间c-fos，c-myc基因在心肌细胞核内的表达程度也较轻. 在心肌细胞缺氧120 min后Ⅰ，Ⅱ组心肌细胞即出现c-fos， c-myc基因的表达，说明在细胞内钙超载产生之前已经有c-fos，c-myc癌基因的表达，心肌细胞在缺氧/复氧期间可产生大量的氧自由基，氧自由基可诱导原癌基因的表达[7]. 胞质内游离钙浓度的升高可通过激活蛋白激酶C，特别是Ca/CaM激酶，对转录因子进行磷酸化修饰等途径诱导心肌细胞c-fos，c-myc mRNA的表达[8]. 由于c-fos，c-myc mRNA对细胞生长、增殖起调控作用，与细胞损伤后的修复过程及细胞内游离钙浓度可能有关，因此c-fos，c-myc基因一方面可影响缺血-再灌注期间氧自由基生成以及细胞内钙的超载；再给氧期间，由于氧和能量的提供，损伤的细胞膜和细胞核以及其他细胞器开始修复. c-fos，c-myc原癌基因的阳性表达又可能就是细胞对损伤及其修复的一种反应[9]. 在这里c-fos，c-myc基因的表达不是意味着细胞不可逆的损伤发生和ATP的耗竭，而有可能作为预示细胞对损伤产生保护和再修复作用的一个指标.
, 百拇医药
作者简介：康进朝(1964-)， 男(汉族)， 河北省辛集人. 博士, 主治医师， 讲师. Tel.(0533)4650000 Ext.8200
参考文献：
[1] 李连达. 野菊花提取物CI-2对体外培养乳鼠心肌细胞缺氧缺糖性损伤的保护作用[J]. 中西医结合杂志，1981;1(2):93-96.
[2] Grynkyewiez GM. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties [J]. J Biol Chem， 1985;260(12):3440-3450.
[3] Tisien RY. Fluorescence ratio imaging: A new window into intracellular ionic signaling [J]. Trends Biochem Sci, 1986; 11(3): 450-455.
, 百拇医药
[4] McDonald K, carlyle P, Hauer K et al. Early ventricular remodeling after myocardial damage in the dog and its prevention by converting enzyme inhibition [abstr][J]. Clin Res, 1990; 38(3): 414-418.
[5] James TN. Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heart [J]. Circulation, 1994; 90(4): 556-573.
[6] Tanaka M, Ito H, Adachi S et al. Hypoxia induces apoptosis with enhancede expression of Fas antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cardiomyocytes [J]. Circ Res, 1994; 75(4): 426-430.
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[7] Ambrosio G, Tritto I, Shang VL et al. Oxygen radicals may exert negative inotropic effects via k-channel stimulation [J]. Circulation, 1994; 90(4 part 2): 428.
[8] Harshvardhan B, Mehta, Brett K, Poporich wolfgand H. Dillmann. Ischemia induces changes in the level of mRNAs coding for stress protein 71 and creatine kinase M [J]. Circ Res, 1988; 63(4):512-517.
[9] Keith A, Dary J, Nanetle H. Bishopric. Induction and nuclear accumulation of Fos and Jun proto-oncogenes in hypoxia cardiac myocytes [J]. J Biol Chem, 1993; 268(22): 16852-16858.
收稿日期：1999-07-08； 修回日期：1999-12-28, 百拇医药
单位：康进朝(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；蔡振杰(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；李彤(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：原癌基因；心肌细胞；缺氧/复氧损伤
第四军医大学学报000521 摘 要： 目的 研究未成熟心肌细胞缺氧/复氧期间c-fos，c-myc的表达. 方法 建立SD大鼠未成熟心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型，应用原位分子杂交技术，观察c-fos，c-myc在心肌细胞核内的表达. 结果 未成熟心肌细胞在缺氧前c-fos，c-myc mRNA无表达， 对照(Ⅰ)组和(Ⅱ)组c-fos，c-myc mRNA在缺氧120 min开始表达，复氧60 min表达程度进一步升高. 牛磺酸保护组(Ⅲ组)在缺氧120 min时c-fos，c-myc mRNA为阴性表达，在复氧60 min时仅有弱阳性表达. 结论 c-fos，c-myc mRNA表达程度与心肌细胞损伤程度以及心肌细胞内游离钙浓度的变化密切相关，c-fos，c-myc基因表达可能对心肌细胞的损伤、修复或增殖起调控作用.
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中图号：R654.1 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0586-03
Expression of oncogene c-fos, c-myc in SD rat immature myocardium during hypoxia/reoxygenation
KANG Jin-Chao, LIU Wei-Yong, CAI Zhen-Jie, LI Tong
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To study the expression and significance of oncogene c-fos, c-myc mRNA in hypoxia and reoxygenation of immature myocytes. METHODS A model of original cultural myocytes of neonatal SD rat and hypoxia-reoxygenation injury of immature myocytes was established. By in situ hybridization methods, we studied the expression of oncogene c-fos, c-myc mRNA in hypoxia and reoxygenation injury of immature cardiac myocytes. RESULTS The c-fos， c-myc mRNA of immature myocytes were negative expression before hypoxia. Group I and Ⅱ showed positive expression at 120 min after hypoxia. The expression of c-fos，c-myc mRAN was strong at 60 min after reoxygenation. In group Ⅲ, the expression of c-fos， c-myc mRNA was negative at 120 min after hypoxia. The c-fos， c-myc mRNA expressed slightly only at 60 min after reoxygenation in group Ⅲ. CONCLUSION Expression of c-fos and c-myc mRNA may be closely related to damage and repairing of myocardial cell as well as intracellular free Ca2+ concentration. The expression of c-fos， c-myc mRNA might act as modulators of the procedure of injury, repairing or and proliferating of cardiac myocytes.
, 百拇医药
Keywords: protooncogene; myocytes; hypoxia-reoxygenation injury
0 引言
近年来，对未成熟心肌细胞缺血再灌注损伤及其保护的研究，已深入到亚细胞和分子水平. 我们应用原位分子杂交技术，对未成熟心肌细胞缺氧/复氧期间原癌基因c-fos，c-myc的表达进行研究. 并应用牛磺酸对缺氧/复氧未成熟心肌细胞进行保护，以探讨c-fos, c-myc基因表达与未成熟心肌细胞缺氧/复氧损伤的关系，从分子水平来研究缺氧/复氧损伤的发生机制.
1 材料和方法
1.1 材料 SD乳鼠心肌细胞培养按李连达[1]的方法稍加改进，取出生1～3 d SD乳鼠心肌细胞分离培养3～4 d，培养液用DMEM培养基含200 mL.L-1小牛血清. 未成熟心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型的建立：取培养3 d，生长良好的SD鼠未成熟心肌细胞，预先用999 mL.L-1高纯氮气饱和无糖Hanks液及各组保护液分别代替培养液，并通过7号针头充入上述高纯氮气1 min， 以置换培养瓶内空气，氮气流量为1 L.min-1，然后塞紧瓶塞，静止培养(37℃ CO2培养箱内).
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1.2 方法 在培养瓶内先放入盖玻片条，使心肌细胞在盖玻片上贴壁生长，培养3～4 d，取生长良好的18瓶未成熟心肌细胞，随机分为： ①对照(Ⅰ)组(缺氧缺糖后再复氧给糖组)， 缺氧缺糖120 min后再换入正常培养液， 而模拟“再复氧”60 min； ②St. Thomas'Ⅱ号液保护(Ⅱ)组，缺氧120 min再复氧60 min；③St. Thomas'Ⅱ液+牛磺酸(Ⅲ)组(牛磺酸20 mmol.L-1). 对照实验，阳性对照：已知SD胎鼠心肌细胞c-fos，c-myc基因为阳性表达；空白对照：0.01 mol.L-1 PBS替代cDNA探针；替代对照：人乳头状病毒HPV基因探针替代cDNA探针. 应用原位分子杂交技术(药品由北京中山生物技术有限公司及德国Bochringer Maanheim公司提供). 标本先用丙酮4℃下固定15～20 min. 杂交具体步骤: ①0.01 mol.L-1 PBS冲洗2～3次. ②用3 mL.L-1双氧水封密30 min. ③ 0.2 mol.L-1盐酸浸泡10 min， 0.01 mol.L-1 PBS冲洗3次5 min. ④25 mg.L-1蛋白酶K消化. ⑤杂交变性：滴加杂交液(内含cDNA探针). (每张标本25 μL)放入铝饭盒中，上加清洁盖玻片，96℃～98℃变性10 min. 凉水(15℃)至冷5 min. 置于42℃温箱中杂交过夜. ⑥洗涤显色，2×SSC共35 min，1×SSC 37℃ 15 min，室温15 min. ⑦正常羊血清(NSS)封密，滴加抗体复合物500 μL及NSS+(dig-AP) 1 μL. ⑧洗涤、显色、终止反应，自来水冲洗，镜下控制. ⑨树脂胶封片，光学显微镜拍照，随机15～20个视野进行拍摄(OLYMPUS-1，照像系统OLYMPUSBH-2). ⑩ MISA-300型图像自动分析仪图像分析. 应用荧光指示剂法[2,3]测定心肌内游离钙离子的浓度，细胞孵育液内肌酸磷酸激酶(CPK)用美国Beckman-700型自动生化分析仪测定各时间点的变化，含量以标准国际单位表示(U.L-1).
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2 结果
2.1 c-fos, c-myc基因的表达 对照(Ⅰ)组：缺氧前c-fos，c-myc mRNA为阴性表达，缺氧120 min在心肌细胞核内出现阳性表达，复氧30和60 min保持较高水平表达，呈强阳性. St. Thomas'Ⅱ液(Ⅱ)组：缺氧前c-fos，c-myc mRNA无表达，缺氧120 min呈弱阳性表达，复氧30和60 min均为阳性表达，与对照组相比表达程度明显减弱(P<0.05, Tab 1). St. Thomas'Ⅱ液+牛磺酸(Ⅲ)组：缺氧前及缺氧120 min, c-fos， c-myc mRNA均无表达，复氧60 min为弱阳性表达，与对照组相比表达程度显著减弱(P<0.01)，与Ⅱ组比较表达程度也明显下降(P<0.05).
表1 c-fos, c-myc基因在缺氧/复氧期的表达
Tab 1 c-fos & c-myc mRNA expression
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during hypoxia/reoxygenation (A value, n=6,
±s) GeneGroup
Before
hypoxia
Hypoxia
120 min
Reoxygena-
tion 30 min
Reoxygena-
tion 60 min
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c-fos
Ⅰ
48±13
166±28
236±41
234±45
Ⅱ
46±11
109±19a
168±33a
158±37a
Ⅲ
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49±14
67±18b
92±25b
129±23b
c-myc
Ⅰ
38± 9
170±34
210±43
221±48
Ⅱ
36± 7
, http://www.100md.com
137±28a
163±37a
170±42a
Ⅲ
39±10
50±12b
87±21b
109±18b
aP<0.05, bP<0.01 vs Ⅰ.2.2 细胞内游离钙浓度的变化 对照(Ⅰ)组：缺氧120 min游离钙浓度无明显变化，复氧30 min明显升高，到60 min有回落，但仍明显高于缺氧前水平(P<0.01, Tab 2). St. Thomas'Ⅱ液(Ⅱ)组：缺氧120 min心肌细胞内游离钙浓度无明显改变，复氧30和60 min显著升高，然仍低于对照组相应时间点的细胞内游离钙水平(P<0.01). St. Thomas'Ⅱ液+牛磺酸(Ⅲ)组：缺氧120 min细胞内游离钙浓度略有下降，复氧30和60 min时心肌细胞内游离钙浓度有所升高，但与缺氧前及缺氧120 min的游离钙水平相比较，无显著差异(P<0.05)；与Ⅱ组相比在复氧各相应时间点则有明显下降(P<0.01).
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表2 缺氧/复氧期间心肌细胞内游离钙浓度和肌酸磷酸激酶释放的变化
Tab 2 Intracellular free Ca2+ concentration and CPK release from myocytes during hypoxia and reoxygenation (n=6,
±s) ItemGroup
Before hypoxia
Hypoxia 120 min
Reoxygenation 30 min
Reoxygenation 60 min
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c(free Ca2+)/(nmol.L-1)
Ⅰ
203 ±40
201 ±38
1012 ±123
1008 ±118
Ⅱ
208 ±33
196 ±32
488 ± 80a
472 ± 69a
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Ⅲ
210 ±42
200 ±38
280 ± 41b
270 ± 36b
b(CPK)/(U.L-1)
Ⅰ
8.25± 1.82
34.62± 4.57
52.58± 7.32
50.61± 7.39
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Ⅱ
8.36± 1.83
16.19± 2.98a
25.37± 4.05a
24.17± 3.96a
Ⅲ
9.12± 2.12
11.07± 2.53b
13.78± 2.49b
13.63± 2.51b
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aP<0.05, bP<0.01 vs Ⅰ.2.3 心肌细胞肌酸磷酸激酶释放的变化 对照组(Ⅰ)组：缺氧120 min心肌细胞CPK释放较缺氧前明显升高(P<0.05)，复氧30和60 min急剧上升且保持较高水平. Ⅱ组：缺氧120 min，复氧30和60 min较缺氧前有明显增高(P<0.05)，但均显著低于对照组相应时间点的CPK释放量(P<0.05). Ⅲ组：缺氧120 min，复氧30和60 min，心肌细胞CPK释放量均较缺氧前有所升高，但升高不显著(P<0.05)，且在各相应时间点较Ⅱ组的细胞CPK释放量为低(P<0.01).
3 讨论
心肌缺血再灌注损伤会诱导原癌基因c-fos，c-myc和c-Jun的表达[4]. c-myc基因的表达与细胞增殖和细胞凋亡密切相关，凋亡现象可能存在于心肌细胞缺血再灌注损伤过程中，并有可能成为各种损伤因素如氧自由基及钙超载的始发环节[5,6]. 本实验对照(Ⅰ)组和St. Thomas'Ⅱ液(Ⅱ)组心肌细胞缺氧120 min、复氧30和60 min均有c-fos，c-myc原癌基因的表达，伴有明显的细胞内游离钙超载. c-fos，c-myc基因表达程度与细胞损伤程度以及细胞内游离钙水平有相关性，而且在本组条件下心肌细胞复氧期损伤较重，细胞内游离钙水平越高，c-fos，c-myc基因表达也就越显著. 在牛磺酸保护(Ⅲ)组，细胞内游离钙在复氧时升高不明显，此期间c-fos，c-myc基因在心肌细胞核内的表达程度也较轻. 在心肌细胞缺氧120 min后Ⅰ，Ⅱ组心肌细胞即出现c-fos， c-myc基因的表达，说明在细胞内钙超载产生之前已经有c-fos，c-myc癌基因的表达，心肌细胞在缺氧/复氧期间可产生大量的氧自由基，氧自由基可诱导原癌基因的表达[7]. 胞质内游离钙浓度的升高可通过激活蛋白激酶C，特别是Ca/CaM激酶，对转录因子进行磷酸化修饰等途径诱导心肌细胞c-fos，c-myc mRNA的表达[8]. 由于c-fos，c-myc mRNA对细胞生长、增殖起调控作用，与细胞损伤后的修复过程及细胞内游离钙浓度可能有关，因此c-fos，c-myc基因一方面可影响缺血-再灌注期间氧自由基生成以及细胞内钙的超载；再给氧期间，由于氧和能量的提供，损伤的细胞膜和细胞核以及其他细胞器开始修复. c-fos，c-myc原癌基因的阳性表达又可能就是细胞对损伤及其修复的一种反应[9]. 在这里c-fos，c-myc基因的表达不是意味着细胞不可逆的损伤发生和ATP的耗竭，而有可能作为预示细胞对损伤产生保护和再修复作用的一个指标.
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作者简介：康进朝(1964-)， 男(汉族)， 河北省辛集人. 博士, 主治医师， 讲师. Tel.(0533)4650000 Ext.8200
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收稿日期：1999-07-08； 修回日期：1999-12-28, 百拇医药