扁平苔藓角质形成细胞凋亡与c-fos、c-myc基因表达的关系
作者：周晶 莫志成 宋芳吉
单位：周晶 宋芳吉 110001沈阳，中国医科大学附属第一医院皮肤科；莫志成 中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室
关键词：
中华皮肤科杂志/990614
近来研究表明，原癌基因c-fos、c-myc的表达与细胞凋亡有关。扁平苔藓中角质形成细胞凋亡是其一个重要的形态学特征，但它是否与c-fos、c-myc基因表达调控有关目前尚不清楚。我们通过研究扁平苔藓中角质形成细胞凋亡与c-myc、c-fos蛋白表达的关系来探讨扁平苔藓中角质形成细胞凋亡的机制。
一、材料和方法
1.研究对象：中国医科大学附属第一医院门诊16例扁平苔藓患者，年龄27～74岁，平均46岁，均经病理证实。正常人对照5例，平均年龄54岁，为外科手术患者。
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2.试剂与仪器：凋亡试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)；鼠抗人c-myc多克隆抗体，兔抗人c-fos多克隆抗体(购于福建迈新公司)；计算机图象分析仪(LUZEX-F型，日本)。
3.标本制作：于皮损处作梭形切口切取皮肤组织，深达皮下，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，1张行TUNEL法染色，2张供免疫组化研究。
4.TUNEL原位检测凋亡角质形成细胞：切片常规脱蜡；20μg/mL蛋白酶K37℃孵育15min；0.3%甲醇H2O2室温处理30min；渗透液(TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液，终浓度0.1%)4℃孵育2min；TUNEL反应混合物(含TdT和荧光素-d-UTP)37℃孵育1h；辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体37℃孵育30min；DAB显色2min；苏木素复染5min；以不加反应混合物只加等体积的缓冲液作为阴性对照，其他步骤不变。在细胞核中有棕黄色颗粒者即为凋亡细胞。
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5.SP免疫组化检测：常规脱蜡，分别对标本进行c-fos、c-myc免疫组化染色，DAB显色，苏木素衬染。以PBS代替一抗作阴性对照，其他步骤不变。有棕黄色颗粒出现于细胞浆或细胞核者为阳性。
6.凋亡指数(apoptosisindex，AI)的计算：每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，计算500个角质形成细胞中凋亡细胞所占百分比。
7.定量图象分析：对扁平苔藓和正常人皮肤免疫组化结果进行计算机图象灰度值扫描，每份标本随机取10个视野，比较两组灰度值的平均值，并进行t检验。
8.凋亡与c-myc基因表达相关性分析：计算相关系数r，并做t检验。
二、结果
1.TUNEL原位检测凋亡：扁平苔藓表皮各层可见散在分布凋亡细胞，个别标本可见全层细胞出现凋亡。正常人皮肤中未见或偶见凋亡细胞，阴性对照中未见阳性结果。
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2.免疫组化染色结果：c-fos蛋白仅在1例扁平苔藓中有表达，阳性颗粒见于表皮各层角质形成细胞核。正常人对照中未见c-fos蛋白表达。16例扁平苔藓及5例正常人对照c-myc蛋白均有表达，阳性颗粒主要分布于细胞浆内，少数分布于细胞核内。胞核染色较强，胞浆染色较弱。定量图象分析(见表1)表明，扁平苔藓c-fos表达与正常人皮肤差异无显著性(P>0.05)，c-myc表达明显高于正常人皮肤(P<0.05)。我们发现，凋亡细胞数多，相应标本中c-myc表达较强；反之，c-myc表达较弱。3.c-myc与凋亡的相关性：扁平苔藓中c-myc表达与凋亡呈正相关(r=0.78，t=3.54，P<0.05)。
表1 扁平苔藓患者及正常人皮肤组织中c-fos、c-myc的表达 组别
例数
平均灰度值(
±s)
, http://www.100md.com
c-fos
c-myc
扁平苔藓
16
77.63±4.58
132.94±34.84
正常人皮肤
5
75.87±4.21
97.36±15.12
t值
0.68
, 百拇医药 2.54
P值
>0.05
<0.05
三、讨论
原癌基因c-fos在调节细胞增殖、分化和凋亡中起着一定作用[1]。本研究中16例扁平苔藓仅1例表达c-fos，表明在扁平苔藓细胞凋亡的调节中可能不需要c-fos的激活。原癌基因c-myc的编码蛋白是一种转录因子，在使细胞进入细胞周期、促进细胞增殖中发挥作用。在一定条件下，c-myc增高与凋亡发生相关[2]。c-myc对凋亡的作用与某些其他凋亡相关基因的表达密切相关；在一些体系中，p53的表达对c-myc引起的凋亡有重要意义[3]，Bcl-2则能抑制c-myc高表达引起的凋亡[4]。扁平苔藓皮损中p53表达明显增高[5]，Bcl-2表达降低[6]，本研究中扁平苔藓c-myc表达明显高于正常人对照(P<0.05)，并与凋亡呈正相关。我们认为c-myc对扁平苔藓角质形成细胞凋亡可能有促进作用，其分子机制有待进一步探讨。
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参考文献
1 Smeyne RJ, Vendrell M, Hayward M, et al. Continuous c-fos expression precedes programmed cell death in vivo. Nature, 1993, 363: 166- 169.
2 Evan GI, Wyllie AH, Gilbert CS, et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell, 1992, 69: 119- 128.
3 Prasad VS, LaFond RE, Zhou M, et al. Upregulation of endogenous p53 and induction of in vivo apoptosis in B-lineage lymphomas of Eμ-myc transgenic mice by deregulated c-myc transgene. Mol Carcinogenesis,1997, 18： 66- 77.
, http://www.100md.com
4 Czaja MJ. Induction of hepatoma cell apoptosis by c-myc requires zinc and occurs in the absence of DNA fragmentation. Am J Physiol,1996,270： G60-70.
5 Dekker NP, Lozada Nur F, Lagenaur LA, et al. Apoptosis associated markers in oral lichen planus. J Oral Pathol Med, 1997,26： 170- 175.
6 Boyd A, Nanney L, Cameron G, et al. Expression of bcl-2 in lichen planus, acute graft-versus-host disease, and erythema multiforme. Am J Dermatopathol, 1997, 19： 46-51.
(收稿：1998-12-07修回：1999-03-30), 百拇医药
单位：周晶 宋芳吉 110001沈阳，中国医科大学附属第一医院皮肤科；莫志成 中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室
关键词：
中华皮肤科杂志/990614
近来研究表明，原癌基因c-fos、c-myc的表达与细胞凋亡有关。扁平苔藓中角质形成细胞凋亡是其一个重要的形态学特征，但它是否与c-fos、c-myc基因表达调控有关目前尚不清楚。我们通过研究扁平苔藓中角质形成细胞凋亡与c-myc、c-fos蛋白表达的关系来探讨扁平苔藓中角质形成细胞凋亡的机制。
一、材料和方法
1.研究对象：中国医科大学附属第一医院门诊16例扁平苔藓患者，年龄27～74岁，平均46岁，均经病理证实。正常人对照5例，平均年龄54岁，为外科手术患者。
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2.试剂与仪器：凋亡试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)；鼠抗人c-myc多克隆抗体，兔抗人c-fos多克隆抗体(购于福建迈新公司)；计算机图象分析仪(LUZEX-F型，日本)。
3.标本制作：于皮损处作梭形切口切取皮肤组织，深达皮下，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，1张行TUNEL法染色，2张供免疫组化研究。
4.TUNEL原位检测凋亡角质形成细胞：切片常规脱蜡；20μg/mL蛋白酶K37℃孵育15min；0.3%甲醇H2O2室温处理30min；渗透液(TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液，终浓度0.1%)4℃孵育2min；TUNEL反应混合物(含TdT和荧光素-d-UTP)37℃孵育1h；辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体37℃孵育30min；DAB显色2min；苏木素复染5min；以不加反应混合物只加等体积的缓冲液作为阴性对照，其他步骤不变。在细胞核中有棕黄色颗粒者即为凋亡细胞。
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5.SP免疫组化检测：常规脱蜡，分别对标本进行c-fos、c-myc免疫组化染色，DAB显色，苏木素衬染。以PBS代替一抗作阴性对照，其他步骤不变。有棕黄色颗粒出现于细胞浆或细胞核者为阳性。
6.凋亡指数(apoptosisindex，AI)的计算：每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，计算500个角质形成细胞中凋亡细胞所占百分比。
7.定量图象分析：对扁平苔藓和正常人皮肤免疫组化结果进行计算机图象灰度值扫描，每份标本随机取10个视野，比较两组灰度值的平均值，并进行t检验。
8.凋亡与c-myc基因表达相关性分析：计算相关系数r，并做t检验。
二、结果
1.TUNEL原位检测凋亡：扁平苔藓表皮各层可见散在分布凋亡细胞，个别标本可见全层细胞出现凋亡。正常人皮肤中未见或偶见凋亡细胞，阴性对照中未见阳性结果。
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2.免疫组化染色结果：c-fos蛋白仅在1例扁平苔藓中有表达，阳性颗粒见于表皮各层角质形成细胞核。正常人对照中未见c-fos蛋白表达。16例扁平苔藓及5例正常人对照c-myc蛋白均有表达，阳性颗粒主要分布于细胞浆内，少数分布于细胞核内。胞核染色较强，胞浆染色较弱。定量图象分析(见表1)表明，扁平苔藓c-fos表达与正常人皮肤差异无显著性(P>0.05)，c-myc表达明显高于正常人皮肤(P<0.05)。我们发现，凋亡细胞数多，相应标本中c-myc表达较强；反之，c-myc表达较弱。3.c-myc与凋亡的相关性：扁平苔藓中c-myc表达与凋亡呈正相关(r=0.78，t=3.54，P<0.05)。
表1 扁平苔藓患者及正常人皮肤组织中c-fos、c-myc的表达 组别
例数
平均灰度值(
±s), http://www.100md.com
c-fos
c-myc
扁平苔藓
16
77.63±4.58
132.94±34.84
正常人皮肤
5
75.87±4.21
97.36±15.12
t值
0.68
, 百拇医药 2.54
P值
>0.05
<0.05
三、讨论
原癌基因c-fos在调节细胞增殖、分化和凋亡中起着一定作用[1]。本研究中16例扁平苔藓仅1例表达c-fos，表明在扁平苔藓细胞凋亡的调节中可能不需要c-fos的激活。原癌基因c-myc的编码蛋白是一种转录因子，在使细胞进入细胞周期、促进细胞增殖中发挥作用。在一定条件下，c-myc增高与凋亡发生相关[2]。c-myc对凋亡的作用与某些其他凋亡相关基因的表达密切相关；在一些体系中，p53的表达对c-myc引起的凋亡有重要意义[3]，Bcl-2则能抑制c-myc高表达引起的凋亡[4]。扁平苔藓皮损中p53表达明显增高[5]，Bcl-2表达降低[6]，本研究中扁平苔藓c-myc表达明显高于正常人对照(P<0.05)，并与凋亡呈正相关。我们认为c-myc对扁平苔藓角质形成细胞凋亡可能有促进作用，其分子机制有待进一步探讨。
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参考文献
1 Smeyne RJ, Vendrell M, Hayward M, et al. Continuous c-fos expression precedes programmed cell death in vivo. Nature, 1993, 363: 166- 169.
2 Evan GI, Wyllie AH, Gilbert CS, et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell, 1992, 69: 119- 128.
3 Prasad VS, LaFond RE, Zhou M, et al. Upregulation of endogenous p53 and induction of in vivo apoptosis in B-lineage lymphomas of Eμ-myc transgenic mice by deregulated c-myc transgene. Mol Carcinogenesis,1997, 18： 66- 77.
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4 Czaja MJ. Induction of hepatoma cell apoptosis by c-myc requires zinc and occurs in the absence of DNA fragmentation. Am J Physiol,1996,270： G60-70.
5 Dekker NP, Lozada Nur F, Lagenaur LA, et al. Apoptosis associated markers in oral lichen planus. J Oral Pathol Med, 1997,26： 170- 175.
6 Boyd A, Nanney L, Cameron G, et al. Expression of bcl-2 in lichen planus, acute graft-versus-host disease, and erythema multiforme. Am J Dermatopathol, 1997, 19： 46-51.
(收稿：1998-12-07修回：1999-03-30), 百拇医药