不同年龄妇女卵母细胞质量差异的分析
作者：吴际 张丽珠
单位：100083 北京医科大学第三临床医学院妇产科
关键词：卵母细胞；脱噬作用
中华妇产科杂志980711 【摘要】 目的 从细胞凋亡探讨不同年龄妇女卵母细胞的质量差异。方法 应用细胞培养技术，和原位DNA片段末端标记(ISEL)方法，对58例卵巢囊肿、畸胎瘤患者的206个卵母细胞按不同年龄组进行观察和研究。结果 卵母细胞的凋亡过程与其它细胞一样，开始细胞容积缩小，形态不规则，最后凋亡小体形成等；41～50岁年龄组妇女卵母细胞凋亡较21～30岁与31～40岁年龄组进展快(凋亡过程时间短，P<0.005)及凋亡率高(P<0.01)。结论 41～45岁年龄组卵母细胞质量差及对促超排卵反应低的原因，可能是在此年龄组中有较多的卵母细胞发生凋亡。
Apoptosis of Human Oocytes is Age-Related Wu Ji, Zhang Lizhu. The Third Clinical Medical College, Beijing Medical University, Beijing 100083
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the morphological characteristics, and rate of apoptosis of human oocytes in relation to age. Methods 206 oocytes were aspirated from antral follicles 4～6 mm in diameter from 58 patients who had surgery done for ovarian cysts. These oocytes were incubated in Ham's F10 with 10% fetal cord serum (FCS) for 48～120 hours, and examined under inverted microscope every 6～8 hours to see their morphological changes. In situ end-labeling (ISEL) of fragmented DNA was used to confirm apoptosis. Results The characteristics of apoptosis are:(1)shape change of oocytes. (2) oocyte shrinkage. (3) chromatic condensation and apoptotic body formation. (4) internucleosomal DNA cleavage was shown by ISEL. Apoptosis occurred in 13.9% (women aged 21～30), 37.7% (women aged 31～40), and 61.5% (women aged 41～50) respectively. The rate of apoptosis was much higher in women aged 41～50 than that in the other two groups. Conclusion The rate of apoptosis of human immature oocytes cultured in vitro is much higher in older women aged 41～50 than in those aged 21～40, which may account for the poor response to superovulation stimulation and low oocyte quality in older women.
, 百拇医药
【Key words】 Oocytes Apoptosis
生育年龄的妇女，在一个优势卵泡发育成熟到排卵的同时，有多个卵泡闭锁。因此，随着年龄的增长，卵母细胞在数量上逐渐减少，约99%卵泡发生闭锁。更年期不但卵母细胞数量极少，且其质量差，此时生育能力显著降低。本研究从细胞凋亡探讨不同年龄妇女卵母细胞质和量的差异。
材料与方法
一、未成熟卵母细胞的收集和培养
1.卵巢标本来源：标本自1995年4月至1996年9月间，从卵巢囊肿、畸胎瘤患者手术中所获得正常部分的卵巢组织，共58例，患者年龄为21～50岁。共获得卵母细胞206个，平均每例获得卵母细胞2～8个。
2.卵母细胞的获得：卵巢组织切下后立即保温，用34℃生理盐水冲洗卵巢组织，去除血块后再冲洗多次。然后用21号针从4～10 mm直径大小的有腔卵泡中抽吸卵母细胞。
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3.卵母细胞的培养及分组：将抽吸的卵母细胞立即置于盛有Ham's F10(Flow laboratories产品)和15%脐血清的四孔板(丹麦产品)内，37℃，5% CO2恒温培养48～120小时。每孔放入卵母细胞1～2个。根据患者年龄将卵母细胞分成3组，即21～30岁组，卵母细胞72个；31～40岁组，卵母细胞69个；41～50岁组，卵母细胞65个。
二、卵母细胞凋亡的检测
1.卵母细胞凋亡过程的形态学观察：将培养24小时后的卵母细胞在倒置显微镜下观察，自发现卵母细胞出现凋亡的早期变化，即细胞表面皱缩、形态不规则开始，每隔6～8小时观察1次，直到凋亡小体形成。并记录从出现凋亡早期变化到凋亡小体形成的时间。
2.原位DNA片段末端标记(ISEL)：参照有关文献，按如下步骤进行[1～3]：(1)将卵母细胞从四孔板内吸出，于磷酸缓冲液(PBS)中洗2次，然后将卵母细胞吸到玻片上，加盐酸+吐温20 (HCl+Tween 20)溶液作用30秒钟至2分钟，消化透明带；(2)PBS洗后，空气中干燥5～10分钟；(3)逐级乙醇脱水；(4)蛋白酶K作用5分钟，蒸馏水洗3次，然后用3%过氧化氢处理15分钟；(5)蒸馏水洗后，标记缓冲液作用1分钟；(6)末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT)、生物素化的dUTP (Biotin-11-dUTP)及标记缓冲液混匀后37℃标记1小时；(7)PBS洗涤后，封闭液处理10分钟；(8)亲和素-辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，37℃反应30分钟；(9)PBS洗涤后，3，3二氨基联苯胺(DAB)显色8～10分钟；(10)苏木素复染，常规封片、镜检；(11)阴性对照为不加TDT者；(12)结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。
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三、统计分析
本研究采用t检验和χ2检验，分析不同年龄组卵母细胞凋亡的时间和凋亡率的差异。
结果
一、卵母细胞的形态学变化
凋亡的卵母细胞首先出现形态不规则，表面皱缩，容积缩小，与透明带的间隙变宽，染色质变得非常致密，然后染色体凝固，核片段化，形成凋亡小体(图1，2)。41～50岁组凋亡过程进展最快，21～30岁组进展最慢，31～40岁组介于前两者之间，3者之间差异有极显著性(P<0.005)。见表1。
表1 各组卵母细胞凋亡数及凋亡时间 组别
凋亡卵母细胞数
(个)
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凋亡过程时间
(小时，
±s)
21～30岁组
10
39.4±4.2
31～40岁组
15
30.3±3.2
41～50岁组
16
24.5±4.2
, 百拇医药
*与31～40岁组比较，P<0.005
二、不同年龄组卵母细胞凋亡率的差异
用ISEL方法结合形态学观察分析3组卵母细胞凋亡情况，结果为41～50岁组卵母细胞凋亡率最高(P<0.01)，31～40岁组次之，21～30岁组则最低。见表2，图3。
表2 各组卵母细胞凋亡率比较 组别
例数
卵母细胞数
(个)
卵母细胞
凋亡数(个)
凋亡率
, 百拇医药
(%)
21～30岁组
19
72
10
13.9
31～40岁组
20
69
26
37.7
41～50岁组
19
, 百拇医药
65
40
61.5
*与31～40岁组比较，P<0.01讨论
细胞凋亡是在生理条件下的细胞程序化死亡。细胞在凋亡过程中，有细胞膜起泡、细胞收缩、染色质固缩、核片段化、核小体间DNA断裂。
一、原位DNA片段ISEL
ISEL原理是凋亡细胞的内切酶被激活，细胞自身DNA被切割，并产生与DNA断点数目相同的3’-羟基末端。而TDT可将Biotin-11dUTP标记至3’-羟基末端，该生物素可以通过与亲和素的特异结合，使Avidin-HRP结合在DNA断点部位，加入HRP显色底物后在原位出现有色沉淀，从而可以在显微镜下观察到被着色的凋亡细胞。卵母细胞的特点是细胞体积大、其周围有透明带。为避免卵母细胞从玻片中丢失，必须先消化透明带，使细胞紧贴玻片。另外，每个卵母细胞消化透明带的时间不一致，如消化时间太长，卵母细胞会全部被消化。因此，应选择合适的消化透明带时间和方法。
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二、凋亡过程中卵母细胞形态变化及年龄相关性的差异
本研究观察到，卵母细胞的凋亡过程也与其它类型的细胞[4]一样，首先出现形态不规则，容积缩小，表面皱缩，然后染色质固缩、片段化，最后凋亡小体形成。与其它细胞的形态差异是该细胞有透明带，故看到细胞与透明带的间隙变宽。另一方面，41～50岁组凋亡过程进展快于其它两组，凋亡率也最高，且差异有显著性(P<0.005, P<0.01)。这与有关文献报道的老年组小鼠卵母细胞凋亡率高于青年组的结果相一致[5]。由此说明，41～50岁组有更多的卵母细胞发生凋亡。提示41～50岁组卵母细胞质量差的原因，可能是卵母细胞凋亡过程进展快，发生率高所致。即使每周期都有发育，但达到一定程度即凋亡，对促排卵药物反应低，即使有排卵，其质量也差。从而解释了41～50岁组生育能力降低。
图1 卵母细胞发生固缩，染色质非常致密。×400 图2 凋亡小体，其内有致密染色质。×400图3 凋亡卵母细胞，细胞内可见颗粒。×1000
, 百拇医药
参考文献
1 Edith C, John CMD, Frans CSR, et al. Optimal preparation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in situ hybridization. Hum Reprod, 1994,9:533-537.
2 Gold R, Schmied M, Rothe G, et al. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue section. J Histochem Cytochem, 1993, 41:1023-1026.
3 Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin section: in situ end-labeling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem, 1993, 41:7-10.
, 百拇医药
4 Kerr JR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972, 26:239-243.
5 Fujino Y, Ito F, Matsuoka I. Apoptosis of ovulated oocytes in aged mouse. Fert Steril, 1995, 64(Suppl):247-251.
(收稿：1997-08-07 修回：1997-11-16), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学第三临床医学院妇产科
关键词：卵母细胞；脱噬作用
中华妇产科杂志980711 【摘要】 目的 从细胞凋亡探讨不同年龄妇女卵母细胞的质量差异。方法 应用细胞培养技术，和原位DNA片段末端标记(ISEL)方法，对58例卵巢囊肿、畸胎瘤患者的206个卵母细胞按不同年龄组进行观察和研究。结果 卵母细胞的凋亡过程与其它细胞一样，开始细胞容积缩小，形态不规则，最后凋亡小体形成等；41～50岁年龄组妇女卵母细胞凋亡较21～30岁与31～40岁年龄组进展快(凋亡过程时间短，P<0.005)及凋亡率高(P<0.01)。结论 41～45岁年龄组卵母细胞质量差及对促超排卵反应低的原因，可能是在此年龄组中有较多的卵母细胞发生凋亡。
Apoptosis of Human Oocytes is Age-Related Wu Ji, Zhang Lizhu. The Third Clinical Medical College, Beijing Medical University, Beijing 100083
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the morphological characteristics, and rate of apoptosis of human oocytes in relation to age. Methods 206 oocytes were aspirated from antral follicles 4～6 mm in diameter from 58 patients who had surgery done for ovarian cysts. These oocytes were incubated in Ham's F10 with 10% fetal cord serum (FCS) for 48～120 hours, and examined under inverted microscope every 6～8 hours to see their morphological changes. In situ end-labeling (ISEL) of fragmented DNA was used to confirm apoptosis. Results The characteristics of apoptosis are:(1)shape change of oocytes. (2) oocyte shrinkage. (3) chromatic condensation and apoptotic body formation. (4) internucleosomal DNA cleavage was shown by ISEL. Apoptosis occurred in 13.9% (women aged 21～30), 37.7% (women aged 31～40), and 61.5% (women aged 41～50) respectively. The rate of apoptosis was much higher in women aged 41～50 than that in the other two groups. Conclusion The rate of apoptosis of human immature oocytes cultured in vitro is much higher in older women aged 41～50 than in those aged 21～40, which may account for the poor response to superovulation stimulation and low oocyte quality in older women.
, 百拇医药
【Key words】 Oocytes Apoptosis
生育年龄的妇女，在一个优势卵泡发育成熟到排卵的同时，有多个卵泡闭锁。因此，随着年龄的增长，卵母细胞在数量上逐渐减少，约99%卵泡发生闭锁。更年期不但卵母细胞数量极少，且其质量差，此时生育能力显著降低。本研究从细胞凋亡探讨不同年龄妇女卵母细胞质和量的差异。
材料与方法
一、未成熟卵母细胞的收集和培养
1.卵巢标本来源：标本自1995年4月至1996年9月间，从卵巢囊肿、畸胎瘤患者手术中所获得正常部分的卵巢组织，共58例，患者年龄为21～50岁。共获得卵母细胞206个，平均每例获得卵母细胞2～8个。
2.卵母细胞的获得：卵巢组织切下后立即保温，用34℃生理盐水冲洗卵巢组织，去除血块后再冲洗多次。然后用21号针从4～10 mm直径大小的有腔卵泡中抽吸卵母细胞。
, http://www.100md.com
3.卵母细胞的培养及分组：将抽吸的卵母细胞立即置于盛有Ham's F10(Flow laboratories产品)和15%脐血清的四孔板(丹麦产品)内，37℃，5% CO2恒温培养48～120小时。每孔放入卵母细胞1～2个。根据患者年龄将卵母细胞分成3组，即21～30岁组，卵母细胞72个；31～40岁组，卵母细胞69个；41～50岁组，卵母细胞65个。
二、卵母细胞凋亡的检测
1.卵母细胞凋亡过程的形态学观察：将培养24小时后的卵母细胞在倒置显微镜下观察，自发现卵母细胞出现凋亡的早期变化，即细胞表面皱缩、形态不规则开始，每隔6～8小时观察1次，直到凋亡小体形成。并记录从出现凋亡早期变化到凋亡小体形成的时间。
2.原位DNA片段末端标记(ISEL)：参照有关文献，按如下步骤进行[1～3]：(1)将卵母细胞从四孔板内吸出，于磷酸缓冲液(PBS)中洗2次，然后将卵母细胞吸到玻片上，加盐酸+吐温20 (HCl+Tween 20)溶液作用30秒钟至2分钟，消化透明带；(2)PBS洗后，空气中干燥5～10分钟；(3)逐级乙醇脱水；(4)蛋白酶K作用5分钟，蒸馏水洗3次，然后用3%过氧化氢处理15分钟；(5)蒸馏水洗后，标记缓冲液作用1分钟；(6)末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT)、生物素化的dUTP (Biotin-11-dUTP)及标记缓冲液混匀后37℃标记1小时；(7)PBS洗涤后，封闭液处理10分钟；(8)亲和素-辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，37℃反应30分钟；(9)PBS洗涤后，3，3二氨基联苯胺(DAB)显色8～10分钟；(10)苏木素复染，常规封片、镜检；(11)阴性对照为不加TDT者；(12)结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。
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三、统计分析
本研究采用t检验和χ2检验，分析不同年龄组卵母细胞凋亡的时间和凋亡率的差异。
结果
一、卵母细胞的形态学变化
凋亡的卵母细胞首先出现形态不规则，表面皱缩，容积缩小，与透明带的间隙变宽，染色质变得非常致密，然后染色体凝固，核片段化，形成凋亡小体(图1，2)。41～50岁组凋亡过程进展最快，21～30岁组进展最慢，31～40岁组介于前两者之间，3者之间差异有极显著性(P<0.005)。见表1。
表1 各组卵母细胞凋亡数及凋亡时间 组别
凋亡卵母细胞数
(个)
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凋亡过程时间
(小时，
±s)21～30岁组
10
39.4±4.2
31～40岁组
15
30.3±3.2
41～50岁组
16
24.5±4.2
, 百拇医药
*与31～40岁组比较，P<0.005
二、不同年龄组卵母细胞凋亡率的差异
用ISEL方法结合形态学观察分析3组卵母细胞凋亡情况，结果为41～50岁组卵母细胞凋亡率最高(P<0.01)，31～40岁组次之，21～30岁组则最低。见表2，图3。
表2 各组卵母细胞凋亡率比较 组别
例数
卵母细胞数
(个)
卵母细胞
凋亡数(个)
凋亡率
, 百拇医药
(%)
21～30岁组
19
72
10
13.9
31～40岁组
20
69
26
37.7
41～50岁组
19
, 百拇医药
65
40
61.5
*与31～40岁组比较，P<0.01讨论
细胞凋亡是在生理条件下的细胞程序化死亡。细胞在凋亡过程中，有细胞膜起泡、细胞收缩、染色质固缩、核片段化、核小体间DNA断裂。
一、原位DNA片段ISEL
ISEL原理是凋亡细胞的内切酶被激活，细胞自身DNA被切割，并产生与DNA断点数目相同的3’-羟基末端。而TDT可将Biotin-11dUTP标记至3’-羟基末端，该生物素可以通过与亲和素的特异结合，使Avidin-HRP结合在DNA断点部位，加入HRP显色底物后在原位出现有色沉淀，从而可以在显微镜下观察到被着色的凋亡细胞。卵母细胞的特点是细胞体积大、其周围有透明带。为避免卵母细胞从玻片中丢失，必须先消化透明带，使细胞紧贴玻片。另外，每个卵母细胞消化透明带的时间不一致，如消化时间太长，卵母细胞会全部被消化。因此，应选择合适的消化透明带时间和方法。
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二、凋亡过程中卵母细胞形态变化及年龄相关性的差异
本研究观察到，卵母细胞的凋亡过程也与其它类型的细胞[4]一样，首先出现形态不规则，容积缩小，表面皱缩，然后染色质固缩、片段化，最后凋亡小体形成。与其它细胞的形态差异是该细胞有透明带，故看到细胞与透明带的间隙变宽。另一方面，41～50岁组凋亡过程进展快于其它两组，凋亡率也最高，且差异有显著性(P<0.005, P<0.01)。这与有关文献报道的老年组小鼠卵母细胞凋亡率高于青年组的结果相一致[5]。由此说明，41～50岁组有更多的卵母细胞发生凋亡。提示41～50岁组卵母细胞质量差的原因，可能是卵母细胞凋亡过程进展快，发生率高所致。即使每周期都有发育，但达到一定程度即凋亡，对促排卵药物反应低，即使有排卵，其质量也差。从而解释了41～50岁组生育能力降低。
图1 卵母细胞发生固缩，染色质非常致密。×400 图2 凋亡小体，其内有致密染色质。×400图3 凋亡卵母细胞，细胞内可见颗粒。×1000
, 百拇医药
参考文献
1 Edith C, John CMD, Frans CSR, et al. Optimal preparation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in situ hybridization. Hum Reprod, 1994,9:533-537.
2 Gold R, Schmied M, Rothe G, et al. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue section. J Histochem Cytochem, 1993, 41:1023-1026.
3 Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin section: in situ end-labeling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem, 1993, 41:7-10.
, 百拇医药
4 Kerr JR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972, 26:239-243.
5 Fujino Y, Ito F, Matsuoka I. Apoptosis of ovulated oocytes in aged mouse. Fert Steril, 1995, 64(Suppl):247-251.
(收稿：1997-08-07 修回：1997-11-16), 百拇医药