HPLC测定人血清中咖啡因浓度
作者：邓子煜 华剑
单位：蚌埠医学院附属医院药剂科 蚌埠 233004
关键词：咖啡因；高效液相色谱法；血清浓度
中国现代应用药学000214 摘要 目的：建立了反相HPLC测定人血清中咖啡因浓度的方法。方法：甲醇-水为流动相，茶碱为内标，紫外254nm处检测。结果：线性范围2.5～40μg/ml,日内RSD为1.28%～3.78%，日间RSD为2.18%～3.56%，方法平均回收率为99.86%，最低检测浓度为100ng/ml。结论：此法具有操作简便、省时、分离度好等特点，可用于咖啡因临床药动学和药效学研究。
Determination of caffeine in human serum by HPLC
Deng Ziyu(Deng ZY),Hua Jian(Hua J)
, 百拇医药
(Department of Pharmacy,Affiliated of Bengbu Medical College,Bengbu 233004)
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish a reverse-phase HPLC method for the determination of caffeine in human serum.METHOD:The mobile phase was methanol-water.Internal standard was theophylline.The detection wavelength was 254nm.RESULTS:The method was linear within the range of 2.5 to 40μg/ml and the limit of detction was 100ng/ml.The variations of within day ranged from 1.28% to 3.78% and those of day-to-day from 2.18% to 3.56%.The average recovery of caffeine was 99.86%.CONCLUSION:This assay is rapid,accurate,sensitive and simple,and can be applied to the study of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of caffeine in clinical practise.
, 百拇医药
KEY WORDS caffeine,HPLC,serum concentration
咖啡因是一种中枢兴奋药，其有效浓度范围是5～20μg/ml。国内目前关于人体内咖啡因的药动学研究还报道较少，本文参考文献[1，2]，建立了反相HPLC测定人血清中咖啡因浓度的方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Beckman SYSTEN GOLD液相色谱仪(125泵，166检测器)，80-2离心机(上海手术器械厂)，XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，SB-2200超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)。
1.2 试药
咖啡因、茶碱(蚌埠市药品检验所)，甲醇为高效液相色谱试剂，高氯酸为分析纯，水为重蒸水。
, http://www.100md.com
2 方法与结果
2.1 标准溶液及内标液的配制
分别精称25mg的咖啡因及茶碱用水溶解，使其终浓度为1mg/ml,置于冰箱中保存。
2.2 色谱条件
分析柱为ODS C18柱(5μm,250mm×4.6mm),预柱为ODS C18柱(5μm,45mm×4.6mm),流动相：甲醇-水(40∶60),流速：1ml/min,检测波长：254nm,咖啡因与内标的保留时间分别为4.85和4.18min,室温，AUFS=0.1。
2.3 血样处理
取血清0.5ml,加入内标14μl和7%高氯酸200μl,振荡20s,离心10min(4000r/min),用0.5μm滤膜过滤后，取上清液20μl进样。
, 百拇医药
2.4 色谱行为
处理后的空白血清在咖啡因及内标出峰处背景干净，无杂峰干扰，见图1。
图1 色谱图
A-空白血清；B-咖啡因及内标血清；C-健康志愿者血清；1-人体内源物质；2-内标；3-咖啡因
2.5 标准曲线的制备
用空白血清分别配制成2.5,5,10,15,20,30和40μg/ml的咖啡因血清标准系列，按上述“血样处理”操作，以浓度c为横坐标，咖啡因与内标的面积比为纵坐标建立标准曲线。结果显示血样在2.5～40μg/ml范围内线性关系良好:y=0.01915+0.04486c,r=0.9998,最低检测浓度为100ng/ml。
, 百拇医药
2.6 回收率
按上述方法配成浓度为5,15和30μg/ml的样品各5份，以样品与内标峰面积比值计算回收率及RSD，结果见表1。
表1 咖啡因的回收率及精密度试验/n=5 浓度
/μg.ml-1
回收率/%
日内差异/μg.ml-1
日间差异/μg.ml-1
±s
RSD/%±s
, http://www.100md.com
RSD/%±s
RSD/%
5
100.08±1.3
1.3
5.01±0.064
1.28
5.04±0.11
2.18
15
98.13±0.58
, http://www.100md.com
0.6
14.81±0.22
1.49
14.99±0.52
3.47
30
101.37±2.81
2.77
30.96±1.17
3.78
31.22±1.11
3.56
, http://www.100md.com
2.7 精密度
配成浓度为5,15和30μg/ml样品各5分，于同一天不同时间和不同日间提取，按上法求得日间、日内差异(表1)。
2.8 健康志愿者血药浓度
健康志愿者3名，男，20～22岁，体重55～63kg,于早晨8:00空腹一次服药200mg,用200ml温开水送服，结果见表2。表2 血清咖啡因测定结果/μg.ml-1 序号
时间/h
0.5
1.0
1.5
2.0
, http://www.100md.com
2.5
3.0
4.0
6.0
8.0
12.0
24.0
1
2.72
5.63
8.75
10.81
10.93
, 百拇医药
10.01
8.88
6.41
4.19
1.87
0.42
2
1.55
2.60
4.81
6.55
8.13
9.35
, http://www.100md.com
8.10
7.01
5.62
3.96
1.43
3
3.88
6.15
10.30
12.31
12.02
11.33
10.01
, 百拇医药
8.35
6.37
2.14
0.65
3 讨 论
本法简单、易行，灵敏度高，稳定性好，所用流动相为甲醇-水，价廉低毒，相对回收率及精密度试验的RSD均小于5%，可用于咖啡因的血药浓度测定及药动学研究。
参考文献
1，
旌生.一次性采样测定人体咖啡因清除率.中山医科大学学报，1994，(3)∶206.
2，何明三，汪经环，雷永军，等.HPLC法测定痰咳净中咖啡因含量.中国医院药学杂志，1994，14(9)∶391.
收稿日期：1999-04-16, 百拇医药
单位：蚌埠医学院附属医院药剂科 蚌埠 233004
关键词：咖啡因；高效液相色谱法；血清浓度
中国现代应用药学000214 摘要 目的：建立了反相HPLC测定人血清中咖啡因浓度的方法。方法：甲醇-水为流动相，茶碱为内标，紫外254nm处检测。结果：线性范围2.5～40μg/ml,日内RSD为1.28%～3.78%，日间RSD为2.18%～3.56%，方法平均回收率为99.86%，最低检测浓度为100ng/ml。结论：此法具有操作简便、省时、分离度好等特点，可用于咖啡因临床药动学和药效学研究。
Determination of caffeine in human serum by HPLC
Deng Ziyu(Deng ZY),Hua Jian(Hua J)
, 百拇医药
(Department of Pharmacy,Affiliated of Bengbu Medical College,Bengbu 233004)
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish a reverse-phase HPLC method for the determination of caffeine in human serum.METHOD:The mobile phase was methanol-water.Internal standard was theophylline.The detection wavelength was 254nm.RESULTS:The method was linear within the range of 2.5 to 40μg/ml and the limit of detction was 100ng/ml.The variations of within day ranged from 1.28% to 3.78% and those of day-to-day from 2.18% to 3.56%.The average recovery of caffeine was 99.86%.CONCLUSION:This assay is rapid,accurate,sensitive and simple,and can be applied to the study of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of caffeine in clinical practise.
, 百拇医药
KEY WORDS caffeine,HPLC,serum concentration
咖啡因是一种中枢兴奋药，其有效浓度范围是5～20μg/ml。国内目前关于人体内咖啡因的药动学研究还报道较少，本文参考文献[1，2]，建立了反相HPLC测定人血清中咖啡因浓度的方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Beckman SYSTEN GOLD液相色谱仪(125泵，166检测器)，80-2离心机(上海手术器械厂)，XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，SB-2200超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)。
1.2 试药
咖啡因、茶碱(蚌埠市药品检验所)，甲醇为高效液相色谱试剂，高氯酸为分析纯，水为重蒸水。
, http://www.100md.com
2 方法与结果
2.1 标准溶液及内标液的配制
分别精称25mg的咖啡因及茶碱用水溶解，使其终浓度为1mg/ml,置于冰箱中保存。
2.2 色谱条件
分析柱为ODS C18柱(5μm,250mm×4.6mm),预柱为ODS C18柱(5μm,45mm×4.6mm),流动相：甲醇-水(40∶60),流速：1ml/min,检测波长：254nm,咖啡因与内标的保留时间分别为4.85和4.18min,室温，AUFS=0.1。
2.3 血样处理
取血清0.5ml,加入内标14μl和7%高氯酸200μl,振荡20s,离心10min(4000r/min),用0.5μm滤膜过滤后，取上清液20μl进样。
, 百拇医药
2.4 色谱行为
处理后的空白血清在咖啡因及内标出峰处背景干净，无杂峰干扰，见图1。
图1 色谱图
A-空白血清；B-咖啡因及内标血清；C-健康志愿者血清；1-人体内源物质；2-内标；3-咖啡因
2.5 标准曲线的制备
用空白血清分别配制成2.5,5,10,15,20,30和40μg/ml的咖啡因血清标准系列，按上述“血样处理”操作，以浓度c为横坐标，咖啡因与内标的面积比为纵坐标建立标准曲线。结果显示血样在2.5～40μg/ml范围内线性关系良好:y=0.01915+0.04486c,r=0.9998,最低检测浓度为100ng/ml。
, 百拇医药
2.6 回收率
按上述方法配成浓度为5,15和30μg/ml的样品各5份，以样品与内标峰面积比值计算回收率及RSD，结果见表1。
表1 咖啡因的回收率及精密度试验/n=5 浓度
/μg.ml-1
回收率/%
日内差异/μg.ml-1
日间差异/μg.ml-1
±sRSD/%
±s, http://www.100md.com
RSD/%
±sRSD/%
5
100.08±1.3
1.3
5.01±0.064
1.28
5.04±0.11
2.18
15
98.13±0.58
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0.6
14.81±0.22
1.49
14.99±0.52
3.47
30
101.37±2.81
2.77
30.96±1.17
3.78
31.22±1.11
3.56
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2.7 精密度
配成浓度为5,15和30μg/ml样品各5分，于同一天不同时间和不同日间提取，按上法求得日间、日内差异(表1)。
2.8 健康志愿者血药浓度
健康志愿者3名，男，20～22岁，体重55～63kg,于早晨8:00空腹一次服药200mg,用200ml温开水送服，结果见表2。表2 血清咖啡因测定结果/μg.ml-1 序号
时间/h
0.5
1.0
1.5
2.0
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2.5
3.0
4.0
6.0
8.0
12.0
24.0
1
2.72
5.63
8.75
10.81
10.93
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10.01
8.88
6.41
4.19
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0.42
2
1.55
2.60
4.81
6.55
8.13
9.35
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8.10
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3
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6.15
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11.33
10.01
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8.35
6.37
2.14
0.65
3 讨 论
本法简单、易行，灵敏度高，稳定性好，所用流动相为甲醇-水，价廉低毒，相对回收率及精密度试验的RSD均小于5%，可用于咖啡因的血药浓度测定及药动学研究。
参考文献
1，
旌生.一次性采样测定人体咖啡因清除率.中山医科大学学报，1994，(3)∶206.2，何明三，汪经环，雷永军，等.HPLC法测定痰咳净中咖啡因含量.中国医院药学杂志，1994，14(9)∶391.
收稿日期：1999-04-16, 百拇医药