5-HT免疫组化染色观察尼莫地平于脊髓损伤中的保护作用
作者：赵凤东 王坤正范顺武 赵凯 党晓谦 白明辉
单位：赵凤东 范顺武 赵凯(浙江大学附属邵逸夫医院骨科, 杭州 310016)；王坤正 党晓谦(西安医科大学第二临床医学院骨科)；白明辉(陕西中医学院药学系)
关键词：尼莫地平；脊髓损伤；5-羟色胺(5-HT)
中国矫形外科杂志001212 摘 要 目的：评估尼莫地平对夹挫式脊髓损伤的神经保护作用。方法：健康SD大鼠30只，动脉瘤夹压迫法制作脊髓损伤模型，使近于全瘫，随机分尼莫地平治疗组及对照组，饲养4周，于4周末行Tarlov评分及斜板试验、脊髓体感诱发电位(SCEP)检测，取材行HE、Cajal银染色并行计算机图像分析，损伤段下方行5-HT免疫组化染色。结果：Tarlov评分及斜板试验结果：治疗组均较对照组有显著增高(P<0.01),SCEP恢复百分率及图像分析残留组织百分率均显示治疗组明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)，5-HT免疫组化染色：治疗组前角表达明显强于对照组。结论：尼莫地平结合肾上腺素应用于早期脊髓损伤中具有神经保护作用。
, 百拇医药
中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1181-03
Evaluating the Protective Effects of Nimodipine in Early Spinal Cord Injury by means of Immunohistochemical Staining of 5-HT in Ventral Horn of Spinal Cord
ZHAO Feng-dong,WANG Kun-zheng,FAN Shun-wu
(Orthopedics Department of SIR RUN SHAW Hospital,ZheJiang University, Hangzhou 310016.)
Abstract Objective: To evaluate the neuro-protective effects of Nimodipine by means of making rat model of spinal cord injury,performing immunohistochemical staining of 5-HT and testing spinal cord evoked potential (SCEP),Tarlov scale and inclined plane test,as well as pathological methods. Method:Thirty health SD rats were injured to almost paralysis by aneurysm clip and randomly allocated into nimodipine group and control group.At the end of post-operative 4th week,a series of tests were performed,included Tarlov scale,inclinng plane test,spinal cord evoked potential,pathohistological changes and immunohistochemical activity of 5-HT in ventral horn of spinal cord,as well as image analysis.Result:The results of Tarlov scale and inclined plane test showed that of Nimodipine group increased more significantly than of control group(P<0.01).The recovery rate of SCEP and reserved spinal cord tissue showed that of Nimodipine group higher than that of control group(P<0.05 or P<0.01).The immunohistochemicl staining of 5-HT showed there was absent of 5-HT fibers in ventral horn of control group but that of treated group was more obviously present.Conclusion:Nimodipine conjunctive with adren aline showed neuro-protective effects in treating of early spinal cord injury.The model of spinal cord injury produced by aneurysm clip was reliable.
, 百拇医药
Key words Nimodipine Spinal Cord Injury 5-HT
脊髓损伤系原发损伤及继发损伤共同作用的结果。继发损伤包括血管机制及神经生化机制，而钙离子积聚则为其中重要环节。尼莫地平作为一种Ca2+通道阻滞剂，可以防止伤区细胞内钙离子积聚，并扩张小血管，对抗TXA2而改善微循环，故可保护神经组织免于进一步破坏；但其所致的全身性低血压可抵消上述作用，故也有学者认为其临床意义不大。本实验用5-HT免疫组化染色、SCEP及病理学分析等方法、观察尼莫地平对夹挫式大鼠脊髓损伤模型的神经保护作用。
1 材料与方法
1.1动物模型的制作
健康雌性SD大鼠30只，体重220～270g，随机分2组，参照动脉瘤夹压迫法[1]制作大鼠脊髓损伤模型，氯胺酮10mg/100g腹腔麻醉，俯卧位，后正中切口，T10行椎板切除，硬脊膜与椎管壁间置动脉瘤夹横行夹持压迫脊髓5s，压迫力量120g，经SCEP测定证实为全瘫。术后5日内，每日Penicillin20万u/只肌注,挤压下腹排尿2次/d[2～3]，至自主排尿恢复。术后饲养4周，其间，尼莫地平组死亡6只，对照组死亡7只。
, 百拇医药
1.2 给药方法
尼莫地平：按0.05mg/kg/h[4]共48h[5]，每6h静注给药一次，结合应用肾上腺素0.001mg/kg/次肌注。伤后30min开始应用，均随尼莫地平后给入。对照组：予等量生理盐水。
1.3 观察指标
1.3.1 Tarlov评分[6]及斜板试验均于伤后4周进行，Tarlov评分盲法原则。
1.3.2 病理学检查 于4周末将大鼠全部处死，采用灌注固定方法取材，于损伤中心为中点横行剖开，置于10%中性福尔马林中固定1周，行HE染色及Cajal法银染，并于北航产图像分析系统下行4倍图像分析，计量残留神经组织占全部面积百分比。
1.3.3 取L1段行福尔马林固定，石蜡包埋，行5-HT免疫组化染色，观察前角表达情况。
, 百拇医药
1.3.4 脊髓诱发电位(SCEP)检查 使用Dantec.Keypoint 四导诱发电位仪于屏蔽室内检测。刺激电极为双极针电极，置于膝关节上方坐骨神经分叉处皮下，方波0.2ms，频率3Hz，强度0.6mA,记录电极置于T5～6棘间韧带，参考电极置于相应水平的椎旁肌。地极置于刺激电极与记录电极之间的腰部。截频为20Hz～2KHz，叠加1?000次，所有动物分别于伤前、伤后即刻、伤后4周行SCEP检查。
1.4 材料来源
1.4.1 SD大鼠 第四军医大学动物实验中心提供。
1.4.2 图象处理系统 北航CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统。
1.4.3 诱发电位仪 丹麦生产Dantec公司Keypoint四导诱发电位仪。
, 百拇医药 1.4.4 图象输入显微镜 Olympus Bx40型。
1.4.5 尼莫地平 山东新华制药厂。
1.4.6 5-HT单克隆抗体 第四军医大学组胚教研室提供。
1.4.7 SABC试剂盒 Sigma公司产品。
1.4.8 DAB 上海化学试剂。
1.5 统计学处理
Tarlov评分及斜板试验以
±s表示，行t检验，神经组织残留率以±s表示，行t检验，SCEP按恢复率行x2检验，设α=0.05为检验标准。
, 百拇医药
2 结 果
2.1Tarlov评分(见表1)。
表1 Tarlov评分结果 分组
N±s
P
对照
8
18.7±6.4
<0.01
尼莫地平
9
, http://www.100md.com
43.3±17.3△
差异非常显著
2.2 斜板试验(见表2)。表2 斜板试验最大角度4周结果 分组
N±s
P
对照
8
29.8±3.8
<0.01
尼莫地平
, 百拇医药 9
52.6±7.8△
差异非常显著
2.3 病理学检查
两组均有轴突肿胀、液化坏死、空腔形成及胶质增生，但对照组较为严重。图象分析残留神经组织百分率结果见表3。治疗组对照组差异有显著性。表3 图像分析神经组织残留率(X%) 分组
N±s
P
对照
8
5.9±1.4
, http://www.100md.com
<0.05
尼莫地平
9
34.5±6.1△
差异显著
2.4 SCEP检查结果(见表4)表4 损伤后4周 SCEP恢复情况 分组
N
恢复数
恢复百分率
P
对照
8
, http://www.100md.com
1
12.5%
<0.05
尼莫地平
9
7
77.7%
差异显著
2.5 5-HT免疫组化染色结果
尼莫地平L1段5-HT染色可见前角表达明显，见大量5-HT能神经纤维，而对照组则表达明显减弱。
3 讨 论
, http://www.100md.com 脊髓损伤继发改变机制，可概括为血管和神经生化两方面[4]。前者为机械损伤后即刻的小血管断裂、出血、血管痉挛、血栓形成和脊髓血流量(SCBF)自稳调节紊乱引起SCBF进行性下降等微循环紊乱而致的伤区和邻近节段缺血等的局部反应，而全身性低血压、神经源性休克、外周阻力降低及心输出量减少，则进一步加重局部缺血，直至脊髓缺血变性坏死。伤后缺血与损伤程度呈线性的剂量——反应关系。生化方面为缺血致脂质过氧化，氧自由基产生、血管通透性增加，Ca2+积聚从而触发一系列病理生理反应，致脊髓组织变性坏死。Richard D.Happel[5]等人研究表明：伤后45min，髓内Ca2+开始升高，24h达高峰，并持续到伤后72h。由于微循环障碍，血管通透性改变，大量Ca2+内流进入细胞内，可激活多种蛋白酶和磷脂酶A2，磷脂酶降解，游离脂肪酸(FFA)释出花生四烯酸增加，产生大量自由基。故Ca2+内流可能是损伤反应的始动因子。一方面Ca2+内流产生大量氧自由基，另一方面后者又可使血管内皮损害加重，渗透性增加，形成恶性循环[6]。本实验在脊髓损伤早期开始尼莫地平治疗，持续48h，从而能拮抗Ca2+积聚，减轻其继发病理改变，阻断了各种连锁反应。实验结果表明，疗效显著。Tarlov评分及斜板试验均较对照组为高(P<0.01)。结构是功能的基础，SCEP检测进一步肯定了尼莫地平的神经保护作用。
, 百拇医药
脑干中缝核群中有大量5-HT能神经元，其下行投射系统主要投射于脊髓的前角、侧角运动神经元，以使其保持兴奋性[7]。如T10损伤段变性坏死程度轻可保留部分5-HT纤维，于脊髓L1节段前角免疫组化染色中见到5-HT的存在。本研究应用免疫组化方法，证实治疗组L1前角5-HT表达明显，而对照组则表达较弱，故应用尼莫地平可保存大量5-HT能纤维不致变性坏死。
以往实验均采用1911年Allen设计的WD法制作脊髓损伤模型。本实验采用动脉瘤夹压迫法，一定压力，一定时间，使损伤量化，结果表明本方法可重复性强，方法简便、控制性好。
本课题系国家卫生部科研基金资助项目(编号：982370)
作者简介：赵凤东(1968-)，男，辽宁朝阳人，医学硕士。研究方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0571)5932510
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 Rivlin AS,Tator CH.Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute spinal cord injury model in the rat[J].Surg Neurol,1978，10:39～43.
〔2〕 胡侦明.三七总皂甙治疗早期脊髓损伤的实验研究[J].中国脊柱脊髓杂志，1996，6：384～387.
〔3〕 Braughlar JM,Hall ED,et al.Uptake and elimination of MP from contused cat spinal cord following intravenous injection of the sodium succinate ester[J].J.Neurosurgery,1983，538～542.
, 百拇医药
〔4〕 CHARLES H.Tator,M.D.Review of the scecondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms[J].J Neuro Surg,1991，75:15～26.
〔5〕 Richard D,Happel et al.C-accumulation in experimental spinal cord trauma[J].Brain Research,1981，211:476～479.
〔6〕 郭世绂，等.应用尼莫地平观察脊髓损伤后自由基改变[J].中华骨科杂志，1992，12(3):209～212.
〔7〕 刘湘梅.神经生长的生物学与病理学[M].科学出版社，1985，78～82.
(收稿：2000-03-27 修回：2000-07-11), 百拇医药
单位：赵凤东 范顺武 赵凯(浙江大学附属邵逸夫医院骨科, 杭州 310016)；王坤正 党晓谦(西安医科大学第二临床医学院骨科)；白明辉(陕西中医学院药学系)
关键词：尼莫地平；脊髓损伤；5-羟色胺(5-HT)
中国矫形外科杂志001212 摘 要 目的：评估尼莫地平对夹挫式脊髓损伤的神经保护作用。方法：健康SD大鼠30只，动脉瘤夹压迫法制作脊髓损伤模型，使近于全瘫，随机分尼莫地平治疗组及对照组，饲养4周，于4周末行Tarlov评分及斜板试验、脊髓体感诱发电位(SCEP)检测，取材行HE、Cajal银染色并行计算机图像分析，损伤段下方行5-HT免疫组化染色。结果：Tarlov评分及斜板试验结果：治疗组均较对照组有显著增高(P<0.01),SCEP恢复百分率及图像分析残留组织百分率均显示治疗组明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)，5-HT免疫组化染色：治疗组前角表达明显强于对照组。结论：尼莫地平结合肾上腺素应用于早期脊髓损伤中具有神经保护作用。
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中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1181-03
Evaluating the Protective Effects of Nimodipine in Early Spinal Cord Injury by means of Immunohistochemical Staining of 5-HT in Ventral Horn of Spinal Cord
ZHAO Feng-dong,WANG Kun-zheng,FAN Shun-wu
(Orthopedics Department of SIR RUN SHAW Hospital,ZheJiang University, Hangzhou 310016.)
Abstract Objective: To evaluate the neuro-protective effects of Nimodipine by means of making rat model of spinal cord injury,performing immunohistochemical staining of 5-HT and testing spinal cord evoked potential (SCEP),Tarlov scale and inclined plane test,as well as pathological methods. Method:Thirty health SD rats were injured to almost paralysis by aneurysm clip and randomly allocated into nimodipine group and control group.At the end of post-operative 4th week,a series of tests were performed,included Tarlov scale,inclinng plane test,spinal cord evoked potential,pathohistological changes and immunohistochemical activity of 5-HT in ventral horn of spinal cord,as well as image analysis.Result:The results of Tarlov scale and inclined plane test showed that of Nimodipine group increased more significantly than of control group(P<0.01).The recovery rate of SCEP and reserved spinal cord tissue showed that of Nimodipine group higher than that of control group(P<0.05 or P<0.01).The immunohistochemicl staining of 5-HT showed there was absent of 5-HT fibers in ventral horn of control group but that of treated group was more obviously present.Conclusion:Nimodipine conjunctive with adren aline showed neuro-protective effects in treating of early spinal cord injury.The model of spinal cord injury produced by aneurysm clip was reliable.
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Key words Nimodipine Spinal Cord Injury 5-HT
脊髓损伤系原发损伤及继发损伤共同作用的结果。继发损伤包括血管机制及神经生化机制，而钙离子积聚则为其中重要环节。尼莫地平作为一种Ca2+通道阻滞剂，可以防止伤区细胞内钙离子积聚，并扩张小血管，对抗TXA2而改善微循环，故可保护神经组织免于进一步破坏；但其所致的全身性低血压可抵消上述作用，故也有学者认为其临床意义不大。本实验用5-HT免疫组化染色、SCEP及病理学分析等方法、观察尼莫地平对夹挫式大鼠脊髓损伤模型的神经保护作用。
1 材料与方法
1.1动物模型的制作
健康雌性SD大鼠30只，体重220～270g，随机分2组，参照动脉瘤夹压迫法[1]制作大鼠脊髓损伤模型，氯胺酮10mg/100g腹腔麻醉，俯卧位，后正中切口，T10行椎板切除，硬脊膜与椎管壁间置动脉瘤夹横行夹持压迫脊髓5s，压迫力量120g，经SCEP测定证实为全瘫。术后5日内，每日Penicillin20万u/只肌注,挤压下腹排尿2次/d[2～3]，至自主排尿恢复。术后饲养4周，其间，尼莫地平组死亡6只，对照组死亡7只。
, 百拇医药
1.2 给药方法
尼莫地平：按0.05mg/kg/h[4]共48h[5]，每6h静注给药一次，结合应用肾上腺素0.001mg/kg/次肌注。伤后30min开始应用，均随尼莫地平后给入。对照组：予等量生理盐水。
1.3 观察指标
1.3.1 Tarlov评分[6]及斜板试验均于伤后4周进行，Tarlov评分盲法原则。
1.3.2 病理学检查 于4周末将大鼠全部处死，采用灌注固定方法取材，于损伤中心为中点横行剖开，置于10%中性福尔马林中固定1周，行HE染色及Cajal法银染，并于北航产图像分析系统下行4倍图像分析，计量残留神经组织占全部面积百分比。
1.3.3 取L1段行福尔马林固定，石蜡包埋，行5-HT免疫组化染色，观察前角表达情况。
, 百拇医药
1.3.4 脊髓诱发电位(SCEP)检查 使用Dantec.Keypoint 四导诱发电位仪于屏蔽室内检测。刺激电极为双极针电极，置于膝关节上方坐骨神经分叉处皮下，方波0.2ms，频率3Hz，强度0.6mA,记录电极置于T5～6棘间韧带，参考电极置于相应水平的椎旁肌。地极置于刺激电极与记录电极之间的腰部。截频为20Hz～2KHz，叠加1?000次，所有动物分别于伤前、伤后即刻、伤后4周行SCEP检查。
1.4 材料来源
1.4.1 SD大鼠 第四军医大学动物实验中心提供。
1.4.2 图象处理系统 北航CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统。
1.4.3 诱发电位仪 丹麦生产Dantec公司Keypoint四导诱发电位仪。
, 百拇医药 1.4.4 图象输入显微镜 Olympus Bx40型。
1.4.5 尼莫地平 山东新华制药厂。
1.4.6 5-HT单克隆抗体 第四军医大学组胚教研室提供。
1.4.7 SABC试剂盒 Sigma公司产品。
1.4.8 DAB 上海化学试剂。
1.5 统计学处理
Tarlov评分及斜板试验以
±s表示，行t检验，神经组织残留率以±s表示，行t检验，SCEP按恢复率行x2检验，设α=0.05为检验标准。, 百拇医药
2 结 果
2.1Tarlov评分(见表1)。
表1 Tarlov评分结果 分组
N
±sP
对照
8
18.7±6.4
<0.01
尼莫地平
9
, http://www.100md.com
43.3±17.3△
差异非常显著
2.2 斜板试验(见表2)。表2 斜板试验最大角度4周结果 分组
N
±sP
对照
8
29.8±3.8
<0.01
尼莫地平
, 百拇医药 9
52.6±7.8△
差异非常显著
2.3 病理学检查
两组均有轴突肿胀、液化坏死、空腔形成及胶质增生，但对照组较为严重。图象分析残留神经组织百分率结果见表3。治疗组对照组差异有显著性。表3 图像分析神经组织残留率(X%) 分组
N
±sP
对照
8
5.9±1.4
, http://www.100md.com
<0.05
尼莫地平
9
34.5±6.1△
差异显著
2.4 SCEP检查结果(见表4)表4 损伤后4周 SCEP恢复情况 分组
N
恢复数
恢复百分率
P
对照
8
, http://www.100md.com
1
12.5%
<0.05
尼莫地平
9
7
77.7%
差异显著
2.5 5-HT免疫组化染色结果
尼莫地平L1段5-HT染色可见前角表达明显，见大量5-HT能神经纤维，而对照组则表达明显减弱。
3 讨 论
, http://www.100md.com 脊髓损伤继发改变机制，可概括为血管和神经生化两方面[4]。前者为机械损伤后即刻的小血管断裂、出血、血管痉挛、血栓形成和脊髓血流量(SCBF)自稳调节紊乱引起SCBF进行性下降等微循环紊乱而致的伤区和邻近节段缺血等的局部反应，而全身性低血压、神经源性休克、外周阻力降低及心输出量减少，则进一步加重局部缺血，直至脊髓缺血变性坏死。伤后缺血与损伤程度呈线性的剂量——反应关系。生化方面为缺血致脂质过氧化，氧自由基产生、血管通透性增加，Ca2+积聚从而触发一系列病理生理反应，致脊髓组织变性坏死。Richard D.Happel[5]等人研究表明：伤后45min，髓内Ca2+开始升高，24h达高峰，并持续到伤后72h。由于微循环障碍，血管通透性改变，大量Ca2+内流进入细胞内，可激活多种蛋白酶和磷脂酶A2，磷脂酶降解，游离脂肪酸(FFA)释出花生四烯酸增加，产生大量自由基。故Ca2+内流可能是损伤反应的始动因子。一方面Ca2+内流产生大量氧自由基，另一方面后者又可使血管内皮损害加重，渗透性增加，形成恶性循环[6]。本实验在脊髓损伤早期开始尼莫地平治疗，持续48h，从而能拮抗Ca2+积聚，减轻其继发病理改变，阻断了各种连锁反应。实验结果表明，疗效显著。Tarlov评分及斜板试验均较对照组为高(P<0.01)。结构是功能的基础，SCEP检测进一步肯定了尼莫地平的神经保护作用。
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脑干中缝核群中有大量5-HT能神经元，其下行投射系统主要投射于脊髓的前角、侧角运动神经元，以使其保持兴奋性[7]。如T10损伤段变性坏死程度轻可保留部分5-HT纤维，于脊髓L1节段前角免疫组化染色中见到5-HT的存在。本研究应用免疫组化方法，证实治疗组L1前角5-HT表达明显，而对照组则表达较弱，故应用尼莫地平可保存大量5-HT能纤维不致变性坏死。
以往实验均采用1911年Allen设计的WD法制作脊髓损伤模型。本实验采用动脉瘤夹压迫法，一定压力，一定时间，使损伤量化，结果表明本方法可重复性强，方法简便、控制性好。
本课题系国家卫生部科研基金资助项目(编号：982370)
作者简介：赵凤东(1968-)，男，辽宁朝阳人，医学硕士。研究方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0571)5932510
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 Rivlin AS,Tator CH.Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute spinal cord injury model in the rat[J].Surg Neurol,1978，10:39～43.
〔2〕 胡侦明.三七总皂甙治疗早期脊髓损伤的实验研究[J].中国脊柱脊髓杂志，1996，6：384～387.
〔3〕 Braughlar JM,Hall ED,et al.Uptake and elimination of MP from contused cat spinal cord following intravenous injection of the sodium succinate ester[J].J.Neurosurgery,1983，538～542.
, 百拇医药
〔4〕 CHARLES H.Tator,M.D.Review of the scecondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms[J].J Neuro Surg,1991，75:15～26.
〔5〕 Richard D,Happel et al.C-accumulation in experimental spinal cord trauma[J].Brain Research,1981，211:476～479.
〔6〕 郭世绂，等.应用尼莫地平观察脊髓损伤后自由基改变[J].中华骨科杂志，1992，12(3):209～212.
〔7〕 刘湘梅.神经生长的生物学与病理学[M].科学出版社，1985，78～82.
(收稿：2000-03-27 修回：2000-07-11), 百拇医药