巢式逆转录多聚酶链反应检测荷人肝癌裸鼠周围静脉血液中肝癌细胞的实验研究
作者：刘扬 张柏和 钱光相 陈汉 吴孟超 傅继梁 黄长辉
单位：200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院(刘扬、张柏和、钱光相、陈汉、吴孟超)；第二军医大学生物教研室(傅继梁)；第二军医大学分子生物开放实验室(黄长辉)
关键词：
中华外科杂志980924 原发性肝癌(PLC)的预后取决于多种因素，包括肿瘤细胞的组织学分化程度、肿瘤细胞的生长方式、肿瘤大小和浸润范围以及淋巴或血行转移的程度。肿瘤细胞侵入静脉血管，引起血源性播散或转移，是影响预后的重要因素之一。本研究拟应用巢式逆转录多聚酶链反应(巢式RT-PCR)检测荷人肝癌裸鼠周围静脉血液中播散的肝癌细胞，探讨荷瘤裸鼠远处器官转移的发生机制以及其与肿瘤大小，血清AFP浓度及其远处转移的关系。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.动物选择：选择能分泌AFP的人肝癌细胞株SMMC-LINM(由本校病理解剖教研室提供)接种在4周龄大小的正常裸鼠(BALB/C/NU)颈背部皮下(每只裸鼠一次性接种肿瘤细胞约107个)。待6周后，裸鼠长至体重15～20 g，选择20只上述标准裸鼠进行实验。
2.标本收集：抽取20只裸鼠周围静脉血各1 ml，应用巢式RT-PCR定性检验周围血中AFP mRNA。切除裸鼠皮下肝癌组织，观察肿瘤包膜完整性及其与周围组织的关系(有无浸润转移)。同时切除裸鼠肝、肺、肾及肾上腺等血供丰富器官，石蜡包埋，HE染色，观察肝癌器官转移情况。
3.统计学分析：采用卡方检验及四格表概率计算法。
二、结果
1.AFP mRNA检测：20只荷人肝癌裸鼠皮下肿瘤包膜均完整，镜检未见明显局部器官浸润及肝、肺、肾等重要器官转移，其中有6只裸鼠血液中AFP mRNA阳性(30.0%)。在这6只裸鼠中有4只镜检发现肺、肝或肾脏有肿瘤转移灶，其中有1只裸鼠同时发生了肺及肾脏转移，14只鼠AFP mRNA阴性，均未见重要器官转移灶(P<0.01)。
, 百拇医药
2.肿瘤直径：9只裸鼠皮下肿瘤直径>3 cm，6例血液AFP mRNA阳性均在其中，而肿瘤直径小于3 cm的11例中，无1例发生远处器官转移。
3.AFP浓度：在12只血清AFP浓度大于4000 μg/L的荷瘤裸鼠中，有6只血液中检测到AFP mRNA(50.0%)，而在8只血清AFP浓度低于4000 μg/L的荷瘤裸鼠中无1例血液AFP mRNA阳性者(P<0.01)。
三、讨论
近年来，随着医学分子生物学的发展，人们已能够应用基因技术检测到血液或淋巴结组织中肿瘤细胞相关基因的存在，以间接的方式推测肿瘤细胞发生转移[1，2]。由于肝癌细胞溶解破坏所释放的AFP mRNA在血液中存在大量RNA酶的状况下，不可能存在或被立即破坏，因此从血液中检测到AFP mRNA，可以判断其来自于血液中播散的肝癌细胞[3]。
, http://www.100md.com
实验证明，检测肿瘤细胞特异性基因较检测肿瘤蛋白质抗原更具敏感性，因为肿瘤特异性基因可以通过体外放大(如PCR)至宏观量范围，其敏感性可达1/107个瘤细胞，而免疫细胞学法或流式细胞仪法仅为1/105，且缺乏特异性[2]。
本组实验结果，在所有20只荷瘤裸鼠周围静脉血液中有6只被检出AFP mRNA(30.0%)，其中有4只发生了远处器官转移，而在14只血液AFP mRNA阴性的荷瘤裸鼠中无1例发生远处器官转移(P<0.01)，证明荷人肝癌裸鼠发生远处器官转移是经血液播散种植转移而进行的。同时，血液AFP mRNA阳性荷瘤裸鼠其肿瘤直径均在3 cm以上，且血清AFP浓度均大于4000 μg/L，表明伴随着肿瘤的生长，体积的增大，血清AFP浓度的升高，肿瘤细胞可以间断性和(或)持续性播散入血循环，形成循环性肿瘤细胞或血液微小转移灶(micrometastasis)。循环性肿瘤细胞是形成远处器官转移灶的必要因素之一。
, 百拇医药
本课题受军队重点实验室基金资助
参考文献
1Kar S,Carr BI.Detection of liver cells in peripheral blood of patients with advanced-stage hepatocellular carcinoma.Hepatology,1995,21:403-406.
2Ghossein RA,Ssher HI,Gerald WL,et al.Detection of circulating tumor cells in patiens with localized and metastatic prostatic carinoma:clinical implications. J Clin Oncol,1995,13:1195-1198.
3Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular cacinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995,75:2214-2219.
(收稿：1997-10-10 修回：1998-04-26), 百拇医药
单位：200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院(刘扬、张柏和、钱光相、陈汉、吴孟超)；第二军医大学生物教研室(傅继梁)；第二军医大学分子生物开放实验室(黄长辉)
关键词：
中华外科杂志980924 原发性肝癌(PLC)的预后取决于多种因素，包括肿瘤细胞的组织学分化程度、肿瘤细胞的生长方式、肿瘤大小和浸润范围以及淋巴或血行转移的程度。肿瘤细胞侵入静脉血管，引起血源性播散或转移，是影响预后的重要因素之一。本研究拟应用巢式逆转录多聚酶链反应(巢式RT-PCR)检测荷人肝癌裸鼠周围静脉血液中播散的肝癌细胞，探讨荷瘤裸鼠远处器官转移的发生机制以及其与肿瘤大小，血清AFP浓度及其远处转移的关系。
一、材料和方法
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1.动物选择：选择能分泌AFP的人肝癌细胞株SMMC-LINM(由本校病理解剖教研室提供)接种在4周龄大小的正常裸鼠(BALB/C/NU)颈背部皮下(每只裸鼠一次性接种肿瘤细胞约107个)。待6周后，裸鼠长至体重15～20 g，选择20只上述标准裸鼠进行实验。
2.标本收集：抽取20只裸鼠周围静脉血各1 ml，应用巢式RT-PCR定性检验周围血中AFP mRNA。切除裸鼠皮下肝癌组织，观察肿瘤包膜完整性及其与周围组织的关系(有无浸润转移)。同时切除裸鼠肝、肺、肾及肾上腺等血供丰富器官，石蜡包埋，HE染色，观察肝癌器官转移情况。
3.统计学分析：采用卡方检验及四格表概率计算法。
二、结果
1.AFP mRNA检测：20只荷人肝癌裸鼠皮下肿瘤包膜均完整，镜检未见明显局部器官浸润及肝、肺、肾等重要器官转移，其中有6只裸鼠血液中AFP mRNA阳性(30.0%)。在这6只裸鼠中有4只镜检发现肺、肝或肾脏有肿瘤转移灶，其中有1只裸鼠同时发生了肺及肾脏转移，14只鼠AFP mRNA阴性，均未见重要器官转移灶(P<0.01)。
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2.肿瘤直径：9只裸鼠皮下肿瘤直径>3 cm，6例血液AFP mRNA阳性均在其中，而肿瘤直径小于3 cm的11例中，无1例发生远处器官转移。
3.AFP浓度：在12只血清AFP浓度大于4000 μg/L的荷瘤裸鼠中，有6只血液中检测到AFP mRNA(50.0%)，而在8只血清AFP浓度低于4000 μg/L的荷瘤裸鼠中无1例血液AFP mRNA阳性者(P<0.01)。
三、讨论
近年来，随着医学分子生物学的发展，人们已能够应用基因技术检测到血液或淋巴结组织中肿瘤细胞相关基因的存在，以间接的方式推测肿瘤细胞发生转移[1，2]。由于肝癌细胞溶解破坏所释放的AFP mRNA在血液中存在大量RNA酶的状况下，不可能存在或被立即破坏，因此从血液中检测到AFP mRNA，可以判断其来自于血液中播散的肝癌细胞[3]。
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实验证明，检测肿瘤细胞特异性基因较检测肿瘤蛋白质抗原更具敏感性，因为肿瘤特异性基因可以通过体外放大(如PCR)至宏观量范围，其敏感性可达1/107个瘤细胞，而免疫细胞学法或流式细胞仪法仅为1/105，且缺乏特异性[2]。
本组实验结果，在所有20只荷瘤裸鼠周围静脉血液中有6只被检出AFP mRNA(30.0%)，其中有4只发生了远处器官转移，而在14只血液AFP mRNA阴性的荷瘤裸鼠中无1例发生远处器官转移(P<0.01)，证明荷人肝癌裸鼠发生远处器官转移是经血液播散种植转移而进行的。同时，血液AFP mRNA阳性荷瘤裸鼠其肿瘤直径均在3 cm以上，且血清AFP浓度均大于4000 μg/L，表明伴随着肿瘤的生长，体积的增大，血清AFP浓度的升高，肿瘤细胞可以间断性和(或)持续性播散入血循环，形成循环性肿瘤细胞或血液微小转移灶(micrometastasis)。循环性肿瘤细胞是形成远处器官转移灶的必要因素之一。
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本课题受军队重点实验室基金资助
参考文献
1Kar S,Carr BI.Detection of liver cells in peripheral blood of patients with advanced-stage hepatocellular carcinoma.Hepatology,1995,21:403-406.
2Ghossein RA,Ssher HI,Gerald WL,et al.Detection of circulating tumor cells in patiens with localized and metastatic prostatic carinoma:clinical implications. J Clin Oncol,1995,13:1195-1198.
3Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular cacinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995,75:2214-2219.
(收稿：1997-10-10 修回：1998-04-26), 百拇医药