4种金属化合物对小鼠生殖细胞DNA损伤的研究
作者：张遵真 衡正昌 廖艳 赵蓉
单位：张遵真 衡正昌(华西医科大学环境卫生教研室，成都 610041)；廖艳 赵蓉(2.95级预防医学学生)
关键词：
卫生毒理学杂志000414 随着工业化的发展和矿资源的开发利用，重金属对环境的污染越来越严重。其中镉、铬、铅、汞是常见的环境和工业毒物，有关其遗传毒性的报道较多。研究已证明[1，2]：镉和铬是确定的人类致癌物，汞对真核细胞具有致裂作用，铅可诱发实验动物肾脏肿瘤，属人类可疑致癌物，但有关其是否能够直接诱导生殖细胞的DNA损伤未见报道。彗星试验(Comet assay)是近年来发展起来的检测单个哺乳动物细胞DNA链断裂的新技术，具有敏感、简便、所需样品少等优点，已广泛应用于毒理学[3]。我们采用彗星试验检测了4种金属化合物对雄性小鼠生殖细胞的DNA损伤，为全面评价重金属的遗传毒性和雄性生殖毒性提供科学依据。
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1 材料与方法
1.1 受试物 硫酸镉(CdSO4)、重铬酸钾(K2Cr2O7)、硝酸铅(Pb(NO3)2)、氯化汞(HgCl2)均为成都化学试剂厂生产的分析纯试剂(纯度>98%)，临用前以灭菌双蒸水配置。
1.2 实验动物 昆明种雄性小鼠，体重25 g左右，由华西医科大学实验动物中心提供。常规喂养，观察1周后，健康者供实验用。
1.3 小鼠精原细胞的制备：颈椎锐臼处死小鼠，取出两侧睾丸，放于35 mm玻璃平皿内，用预温的37 ℃Hanks液冲洗2次，小心除去被膜和血管，然后转移至小烧杯内，加少许Hanks液，用眼科剪尽量剪碎曲细精管，以一定量Hanks液稀释后，通过110目不锈钢筛网过滤，收集细胞悬液，离心后用Hanks液将细胞浓度调整为106～107个/ml，4 ℃贮存备用，并以苔盼蓝染色观察细胞存活率。
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1.4 细胞处理 将上述制得的小鼠精原细胞按每管105～106个细胞分装于5 ml刻度离心管，再用无血清的Dubico改良的基础培养基配制的培养液将体积加至3 ml，然后于每管中分别加入不同浓度的受试物30 μl，同时以30 μl双蒸水作阴性对照，30 μl过氧化氢(H2O2)作阳性对照，混匀后置37 ℃恒温水浴震荡(震荡频率为100次/min)箱孵育1.5 h(H2O2只孵育30 min)。染毒完毕，离心去上清液，以100 μl Hanks液重悬细胞，用于彗星试验，并以苔盼蓝排斥法观察染毒后的细胞存活率，以反映受试物对细胞的细胞毒性。
1.5 彗星试验[4]
1.5.1 制片 将110 μl质量浓度为0.8%的正常熔点琼脂糖浇注在毛玻片上作为第1层；凝固后，加入75 μl含有103～104个细胞的低熔点琼脂糖(质量浓度为0.8%)作为第2层，并加盖玻片置4 ℃固化10 min。
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1.5.2 裂解 待第2层胶凝固后取下盖玻片，将载玻片放入新配制的细胞裂解液(pH=10)中，置4 ℃冰箱避光裂解至少1 h。
1.5.3 解旋(碱变性) 裂解完毕，用磷酸缓冲液(PBS，pH=7)浸泡片子，以洗去裂解液中高浓度的盐。然后将玻片水平放于电泳盒，倒入新配制的电泳缓冲液(pH=12)，使液面高于凝胶约2 mm，避光解旋30 min。
1.5.4 电泳 调节电压为20 V，电流200 mA，电泳30 min。电泳时带负电荷的DNA断片将离开主核向阳极迁移，形成一个象彗星样的拖尾，尾的长短与DNA损伤的程度相关。
1.5.5 染色和结果观察 电泳完毕取出玻片，用PBS浸泡2次，以中和碱性。每片用40 μl溴乙锭染色，荧光显微镜下观察结果。每张片子随机计数200个细胞，求出拖尾细胞百分率，并用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的尾长，计算出每组的DNA迁移长度。
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1.5.6 统计分析 与双蒸水组比较，分别用χ2检验和t检验对各组的拖尾细胞百分率及DNA迁移长度(尾长)进行显著性检验。上述实验独立重复3次以上。
2 结果
2.1 精原细胞的分离及细胞存活率 按照方法中描述的程序分离小鼠精原细胞，可以得到足够数量的单个细胞进行彗星试验。镜下可见：细胞呈圆形，形态较均一，且分散良好。经苔盼蓝排斥法染色，其细胞存活率均在95%以上。显示出该法分离小鼠精原细胞，快速简便，而且细胞存活率高。
2.2 受试物对精原细胞的细胞毒性 细胞与受试物作用1.5 h后，发现HgCl2的细胞毒性最强，0.016 mmol/L组仅有40%细胞存活，而其他受试物在这一浓度下完全没有细胞毒性。其次是CdSO4，0.2 mmol/L组细胞存活率为50%，而Pb(NO3)2浓度达1 mmol/L时也未表现出明显细胞毒性。因此，4种受试物细胞毒性的顺序从大到小依次为HgCl2、CdSO4、K2Cr2O\-7、Pb(NO4)2。
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2.3 4种金属化合物对精原细胞DNA的损伤作用(表1) H2O2染毒30 min，其余受试物染毒1.5 h。
表1 4种金属化合物对精原细胞的DNA损伤(
+s) 受试物
浓度(mmol/L)
拖尾率(%)
尾长(μm)
双蒸水
-
0
0
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H2Oa2
0.025
100#
138.6±12.8*
K2Cr2O7
0.005
26#
20.4±2.3*
0.025
84#
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47.2±5.6*
0.125
100
80.5±7.8*
0.725
100#
112.0±10*
CbSO4
0.025
32#
13.2±2.5*
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0.05
51#
30.6±4.8*
0.1
86#
67.4±6.6*
0.2
100#
Pb(NO3)2
0.125
22#
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25.3±2.8*
0.25
40#
52.4±5.0*
0.5
78#
64.5±6.0*
1.0
100#
88.7±9.0*
HgCl2
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0.002
28#
15.6±2.7*
0.004
40#
32.1±3.2*
0.008
75#
54.2±5.8*
0.016
88#
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—
χ2检验，与双蒸水组比较，#P<0.01；t检验，与双蒸水组比较，*P<0.01
从表1可见：在本实验条件下，阴性对照组细胞没有发生DNA迁移，拖尾率为零。阳性对照H2O2仅染毒30 min，所有细胞均出现拖尾，其尾长达(138.6±12.8) μm。在相同条件下，4种受试物均可在一定浓度范围内引起小鼠精原细胞的DNA单链断裂，形成彗形细胞，而且，拖尾细胞百分率和各组尾长均随受试物浓度的增加而增加。此外，结果还显示出各受试物诱导DNA损伤的浓度范围相差很大。如HgCl2仅在一个较小的浓度范围内(0.002～0.008 mmol/L)具有DNA损伤作用，小于0.002 mmol/L这一浓度时，不能引起DNA断裂，大于0.008 mmol/L时，则表现出明显细胞毒性。而Pb(NO3)2则要在较高浓度时(0.125～1.0 mmol/L)才具有DNA损伤作用。
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3 讨论
3.1 彗星试验及其细胞毒性测量的意义 彗星试验常以拖尾细胞百分率和DNA迁移长度作为评价指标，在电压、电流和电泳时间一定时，DNA迁移长度与DNA损伤的多少及断片的大小有关，然而，任何原因造成的细胞死亡也会发生DNA崩解，在电场作用下形成特殊的彗星。因此，在实验染毒期间，如果受试物具有很大的细胞毒性，引起细胞死亡，这种情况所致的彗星细胞及尾长并非受试物遗传毒性所致，而是细胞毒性引起的细胞死亡造成，是假阳性。所以，彗星试验中测量受试物的细胞毒性非常必要。一般认为，细胞存活率要高于80%才能进行遗传毒性的检测[5]。本实验中，0.016 mmol/L HgCl2和0.2 mmol/L CdSO4染毒后细胞存活率分别为40%和50%，故该组DNA迁移长度没有测量。
3.2 4种金属化合物对小鼠生殖细胞的DNA损伤 经多次重复实验，结果均显示，4种金属化合物可在无明显细胞毒性的浓度下诱导小鼠精原细胞的DNA损伤，说明受试物具有雄性生殖毒性，可能是潜在的雄性生殖毒物。
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铬及其化合物是已证实的人类致癌物，近10年来对铬的致癌机制研究十分活跃，主要集中在铬化合物导致DNA损伤及其有关机制方面[6]。而关于铬的生殖毒性报道甚少，有研究显示[7]，小鼠受孕后7～9 d，腹腔注射三氯化铬19.52 mg/kg，于妊娠第18天宰杀，即可见到胎儿有明显的畸形。本研究显示重铬酸钾具有很强的致生殖细胞DNA损伤的作用，在0.125 mmol/L时可诱导实验组细胞全部拖尾，尾长达(80.5±7.8)μm，提示铬可能具有潜在生殖毒性。至于铬致DNA损伤的机制，认为与铬的单电子氧化还原循环有关，且羟自由基(*OH)是导致DNA断裂的主要因素。
镉也是确证的人类致癌物，可引起多器官系统毒性。大量实验研究已证明，睾丸和附睾对镉的毒作用最敏感，但对其雄性生殖毒作用机制尚不完全清楚。目前认为镉首先损害睾丸和附睾的血管系统，进而导致曲细精管和附睾管的改变，从而引起一系列形态和组织学的变化。有研究报道，用氯化镉处理睾丸细胞，发现睾丸细胞呈簇脱落，次级精母细胞呈空泡状变形坏死，并伴随着多种酶活性的改变，支持镉对睾丸具有直接性腺毒性的结论。也有报道，镉还可引起人外周血淋巴细胞产生DNA单链断裂，是一种DNA损伤剂。本研究结果表明，镉对睾丸细胞既具有较强的细胞毒性也具有遗传毒性。
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目前，汞化合物的一般毒性主要表现在神经系统，无机汞是否具有生殖毒性未见报道。已知汞对染色体具有致裂作用(clastogenesis)，并可抑制DNA合成和修复。汞的许多毒性与Hg2+和体内或细胞内的巯基(-SH)、二巯基(-S-S)具有很强的亲和力有关。本研究表明在4种受试物中，氯化汞的细胞毒性最强，而且很低剂量(0.002 mmol/L)即可诱导精原细胞DNA单链断裂，说明氯化汞是一种DNA损伤剂。
铅属人类可疑致癌物，同时具有明显的性腺、胚胎毒性和致畸作用。小剂量(0.002～0.2 mg/kg)和短时间(10 d中作用6次)的作用不能引起大鼠的一般状态、血液及神经系统改变，但可见大鼠的睾丸和前列腺增重，精子生成受到破坏，有丝分裂异常，性细胞中RNA的合成和分解降低。也有报道交尾前或怀胎期体内注入铅的大鼠，经常流产或多为死产，胎鼠发育不全[7]。本实验铅在0.125～1.0 mmol/L范围内可引起小鼠精原细胞DNA迁移，并且具有明显剂量反应关系，说明铅能直接造成DNA损伤，这与前人用碱洗脱法研究所得的结果一致。
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综上所述，彗星试验能检测出较低剂量的CdSO4、K2Cr2O7、Pb(NO4)2、HgCl2诱导的小鼠精原细胞DNA单链断裂，说明这4种金属化合物都是DNA损伤剂，具有潜在的雄性生殖毒性，同时也反映出彗星试验在检测金属遗传毒性方面的敏感性。
本课题受国家自然科学基金资助(39670625)
参考文献
[1] Friberg L,Elinder CG,Kjellstrom T.Environmental health criteria 134 cadimum.Geneva:UNEPILO WHO,1992.97-129.
[2] 夏世均.铬极其化合物.见：吴执中，主编.职业病.北京：人民卫生出版社，1981.62-74.
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[3] Fairbaim DW,Olive PL，O'Neill KL.Comet assay,a comprehensive review.Mutat Res,1995，339:37-59.
[4] 张遵真，衡正昌.用单细胞凝胶电泳试验检测铬和砷化合物的DNA损伤作用.中华预防医学杂志，1997，31：356-357.
[5] Kirkland DJ,Gallloway SM,Sofuni T.Summay of major conclusions.Mutat Res,1994，312:205-209.
[6] 刘翔，刘世杰.铬化合物的DNA损伤作用及其机制.癌变.畸变.突变，1998.60-62.
[7] 张尤恩.铅污染与健康.见：蔡宏道，主编.现代环境卫生学.北京：人民卫生出版社，1995.731-743.
(收稿日期：1999-06-17), http://www.100md.com
单位：张遵真 衡正昌(华西医科大学环境卫生教研室，成都 610041)；廖艳 赵蓉(2.95级预防医学学生)
关键词：
卫生毒理学杂志000414 随着工业化的发展和矿资源的开发利用，重金属对环境的污染越来越严重。其中镉、铬、铅、汞是常见的环境和工业毒物，有关其遗传毒性的报道较多。研究已证明[1，2]：镉和铬是确定的人类致癌物，汞对真核细胞具有致裂作用，铅可诱发实验动物肾脏肿瘤，属人类可疑致癌物，但有关其是否能够直接诱导生殖细胞的DNA损伤未见报道。彗星试验(Comet assay)是近年来发展起来的检测单个哺乳动物细胞DNA链断裂的新技术，具有敏感、简便、所需样品少等优点，已广泛应用于毒理学[3]。我们采用彗星试验检测了4种金属化合物对雄性小鼠生殖细胞的DNA损伤，为全面评价重金属的遗传毒性和雄性生殖毒性提供科学依据。
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1 材料与方法
1.1 受试物 硫酸镉(CdSO4)、重铬酸钾(K2Cr2O7)、硝酸铅(Pb(NO3)2)、氯化汞(HgCl2)均为成都化学试剂厂生产的分析纯试剂(纯度>98%)，临用前以灭菌双蒸水配置。
1.2 实验动物 昆明种雄性小鼠，体重25 g左右，由华西医科大学实验动物中心提供。常规喂养，观察1周后，健康者供实验用。
1.3 小鼠精原细胞的制备：颈椎锐臼处死小鼠，取出两侧睾丸，放于35 mm玻璃平皿内，用预温的37 ℃Hanks液冲洗2次，小心除去被膜和血管，然后转移至小烧杯内，加少许Hanks液，用眼科剪尽量剪碎曲细精管，以一定量Hanks液稀释后，通过110目不锈钢筛网过滤，收集细胞悬液，离心后用Hanks液将细胞浓度调整为106～107个/ml，4 ℃贮存备用，并以苔盼蓝染色观察细胞存活率。
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1.4 细胞处理 将上述制得的小鼠精原细胞按每管105～106个细胞分装于5 ml刻度离心管，再用无血清的Dubico改良的基础培养基配制的培养液将体积加至3 ml，然后于每管中分别加入不同浓度的受试物30 μl，同时以30 μl双蒸水作阴性对照，30 μl过氧化氢(H2O2)作阳性对照，混匀后置37 ℃恒温水浴震荡(震荡频率为100次/min)箱孵育1.5 h(H2O2只孵育30 min)。染毒完毕，离心去上清液，以100 μl Hanks液重悬细胞，用于彗星试验，并以苔盼蓝排斥法观察染毒后的细胞存活率，以反映受试物对细胞的细胞毒性。
1.5 彗星试验[4]
1.5.1 制片 将110 μl质量浓度为0.8%的正常熔点琼脂糖浇注在毛玻片上作为第1层；凝固后，加入75 μl含有103～104个细胞的低熔点琼脂糖(质量浓度为0.8%)作为第2层，并加盖玻片置4 ℃固化10 min。
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1.5.2 裂解 待第2层胶凝固后取下盖玻片，将载玻片放入新配制的细胞裂解液(pH=10)中，置4 ℃冰箱避光裂解至少1 h。
1.5.3 解旋(碱变性) 裂解完毕，用磷酸缓冲液(PBS，pH=7)浸泡片子，以洗去裂解液中高浓度的盐。然后将玻片水平放于电泳盒，倒入新配制的电泳缓冲液(pH=12)，使液面高于凝胶约2 mm，避光解旋30 min。
1.5.4 电泳 调节电压为20 V，电流200 mA，电泳30 min。电泳时带负电荷的DNA断片将离开主核向阳极迁移，形成一个象彗星样的拖尾，尾的长短与DNA损伤的程度相关。
1.5.5 染色和结果观察 电泳完毕取出玻片，用PBS浸泡2次，以中和碱性。每片用40 μl溴乙锭染色，荧光显微镜下观察结果。每张片子随机计数200个细胞，求出拖尾细胞百分率，并用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的尾长，计算出每组的DNA迁移长度。
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1.5.6 统计分析 与双蒸水组比较，分别用χ2检验和t检验对各组的拖尾细胞百分率及DNA迁移长度(尾长)进行显著性检验。上述实验独立重复3次以上。
2 结果
2.1 精原细胞的分离及细胞存活率 按照方法中描述的程序分离小鼠精原细胞，可以得到足够数量的单个细胞进行彗星试验。镜下可见：细胞呈圆形，形态较均一，且分散良好。经苔盼蓝排斥法染色，其细胞存活率均在95%以上。显示出该法分离小鼠精原细胞，快速简便，而且细胞存活率高。
2.2 受试物对精原细胞的细胞毒性 细胞与受试物作用1.5 h后，发现HgCl2的细胞毒性最强，0.016 mmol/L组仅有40%细胞存活，而其他受试物在这一浓度下完全没有细胞毒性。其次是CdSO4，0.2 mmol/L组细胞存活率为50%，而Pb(NO3)2浓度达1 mmol/L时也未表现出明显细胞毒性。因此，4种受试物细胞毒性的顺序从大到小依次为HgCl2、CdSO4、K2Cr2O\-7、Pb(NO4)2。
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2.3 4种金属化合物对精原细胞DNA的损伤作用(表1) H2O2染毒30 min，其余受试物染毒1.5 h。
表1 4种金属化合物对精原细胞的DNA损伤(
+s) 受试物浓度(mmol/L)
拖尾率(%)
尾长(μm)
双蒸水
-
0
0
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H2Oa2
0.025
100#
138.6±12.8*
K2Cr2O7
0.005
26#
20.4±2.3*
0.025
84#
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47.2±5.6*
0.125
100
80.5±7.8*
0.725
100#
112.0±10*
CbSO4
0.025
32#
13.2±2.5*
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0.05
51#
30.6±4.8*
0.1
86#
67.4±6.6*
0.2
100#
Pb(NO3)2
0.125
22#
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25.3±2.8*
0.25
40#
52.4±5.0*
0.5
78#
64.5±6.0*
1.0
100#
88.7±9.0*
HgCl2
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0.002
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15.6±2.7*
0.004
40#
32.1±3.2*
0.008
75#
54.2±5.8*
0.016
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χ2检验，与双蒸水组比较，#P<0.01；t检验，与双蒸水组比较，*P<0.01
从表1可见：在本实验条件下，阴性对照组细胞没有发生DNA迁移，拖尾率为零。阳性对照H2O2仅染毒30 min，所有细胞均出现拖尾，其尾长达(138.6±12.8) μm。在相同条件下，4种受试物均可在一定浓度范围内引起小鼠精原细胞的DNA单链断裂，形成彗形细胞，而且，拖尾细胞百分率和各组尾长均随受试物浓度的增加而增加。此外，结果还显示出各受试物诱导DNA损伤的浓度范围相差很大。如HgCl2仅在一个较小的浓度范围内(0.002～0.008 mmol/L)具有DNA损伤作用，小于0.002 mmol/L这一浓度时，不能引起DNA断裂，大于0.008 mmol/L时，则表现出明显细胞毒性。而Pb(NO3)2则要在较高浓度时(0.125～1.0 mmol/L)才具有DNA损伤作用。
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3 讨论
3.1 彗星试验及其细胞毒性测量的意义 彗星试验常以拖尾细胞百分率和DNA迁移长度作为评价指标，在电压、电流和电泳时间一定时，DNA迁移长度与DNA损伤的多少及断片的大小有关，然而，任何原因造成的细胞死亡也会发生DNA崩解，在电场作用下形成特殊的彗星。因此，在实验染毒期间，如果受试物具有很大的细胞毒性，引起细胞死亡，这种情况所致的彗星细胞及尾长并非受试物遗传毒性所致，而是细胞毒性引起的细胞死亡造成，是假阳性。所以，彗星试验中测量受试物的细胞毒性非常必要。一般认为，细胞存活率要高于80%才能进行遗传毒性的检测[5]。本实验中，0.016 mmol/L HgCl2和0.2 mmol/L CdSO4染毒后细胞存活率分别为40%和50%，故该组DNA迁移长度没有测量。
3.2 4种金属化合物对小鼠生殖细胞的DNA损伤 经多次重复实验，结果均显示，4种金属化合物可在无明显细胞毒性的浓度下诱导小鼠精原细胞的DNA损伤，说明受试物具有雄性生殖毒性，可能是潜在的雄性生殖毒物。
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铬及其化合物是已证实的人类致癌物，近10年来对铬的致癌机制研究十分活跃，主要集中在铬化合物导致DNA损伤及其有关机制方面[6]。而关于铬的生殖毒性报道甚少，有研究显示[7]，小鼠受孕后7～9 d，腹腔注射三氯化铬19.52 mg/kg，于妊娠第18天宰杀，即可见到胎儿有明显的畸形。本研究显示重铬酸钾具有很强的致生殖细胞DNA损伤的作用，在0.125 mmol/L时可诱导实验组细胞全部拖尾，尾长达(80.5±7.8)μm，提示铬可能具有潜在生殖毒性。至于铬致DNA损伤的机制，认为与铬的单电子氧化还原循环有关，且羟自由基(*OH)是导致DNA断裂的主要因素。
镉也是确证的人类致癌物，可引起多器官系统毒性。大量实验研究已证明，睾丸和附睾对镉的毒作用最敏感，但对其雄性生殖毒作用机制尚不完全清楚。目前认为镉首先损害睾丸和附睾的血管系统，进而导致曲细精管和附睾管的改变，从而引起一系列形态和组织学的变化。有研究报道，用氯化镉处理睾丸细胞，发现睾丸细胞呈簇脱落，次级精母细胞呈空泡状变形坏死，并伴随着多种酶活性的改变，支持镉对睾丸具有直接性腺毒性的结论。也有报道，镉还可引起人外周血淋巴细胞产生DNA单链断裂，是一种DNA损伤剂。本研究结果表明，镉对睾丸细胞既具有较强的细胞毒性也具有遗传毒性。
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目前，汞化合物的一般毒性主要表现在神经系统，无机汞是否具有生殖毒性未见报道。已知汞对染色体具有致裂作用(clastogenesis)，并可抑制DNA合成和修复。汞的许多毒性与Hg2+和体内或细胞内的巯基(-SH)、二巯基(-S-S)具有很强的亲和力有关。本研究表明在4种受试物中，氯化汞的细胞毒性最强，而且很低剂量(0.002 mmol/L)即可诱导精原细胞DNA单链断裂，说明氯化汞是一种DNA损伤剂。
铅属人类可疑致癌物，同时具有明显的性腺、胚胎毒性和致畸作用。小剂量(0.002～0.2 mg/kg)和短时间(10 d中作用6次)的作用不能引起大鼠的一般状态、血液及神经系统改变，但可见大鼠的睾丸和前列腺增重，精子生成受到破坏，有丝分裂异常，性细胞中RNA的合成和分解降低。也有报道交尾前或怀胎期体内注入铅的大鼠，经常流产或多为死产，胎鼠发育不全[7]。本实验铅在0.125～1.0 mmol/L范围内可引起小鼠精原细胞DNA迁移，并且具有明显剂量反应关系，说明铅能直接造成DNA损伤，这与前人用碱洗脱法研究所得的结果一致。
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综上所述，彗星试验能检测出较低剂量的CdSO4、K2Cr2O7、Pb(NO4)2、HgCl2诱导的小鼠精原细胞DNA单链断裂，说明这4种金属化合物都是DNA损伤剂，具有潜在的雄性生殖毒性，同时也反映出彗星试验在检测金属遗传毒性方面的敏感性。
本课题受国家自然科学基金资助(39670625)
参考文献
[1] Friberg L,Elinder CG,Kjellstrom T.Environmental health criteria 134 cadimum.Geneva:UNEPILO WHO,1992.97-129.
[2] 夏世均.铬极其化合物.见：吴执中，主编.职业病.北京：人民卫生出版社，1981.62-74.
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[3] Fairbaim DW,Olive PL，O'Neill KL.Comet assay,a comprehensive review.Mutat Res,1995，339:37-59.
[4] 张遵真，衡正昌.用单细胞凝胶电泳试验检测铬和砷化合物的DNA损伤作用.中华预防医学杂志，1997，31：356-357.
[5] Kirkland DJ,Gallloway SM,Sofuni T.Summay of major conclusions.Mutat Res,1994，312:205-209.
[6] 刘翔，刘世杰.铬化合物的DNA损伤作用及其机制.癌变.畸变.突变，1998.60-62.
[7] 张尤恩.铅污染与健康.见：蔡宏道，主编.现代环境卫生学.北京：人民卫生出版社，1995.731-743.
(收稿日期：1999-06-17), http://www.100md.com