RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中的表达研究*
作者：王晓燕** 谭德勇 昝瑞光
单位：云南大学生物学系，昆明 650091；**云南教育学院生物学系，昆明
关键词：RB基因；基因表达；精子发生；卵子发生；小鼠
解剖学报980311 摘 要 为研究RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中的表达，用地高辛(DIG)标记的RB基因的DNA探针和碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，在组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交分析方法，检测了昆明种正常雄性小鼠及雌性小鼠不同发育期生殖细胞发生过程中RB基因的转录表达(mRNA)，结果发现：(1)在睾丸组织中，RB基因只在性未成熟组睾丸曲细精管的初级精母细胞，精子细胞层以及性成熟组睾丸曲细精管的精子细胞层中有强转录表达；在精原细胞和生精干细胞层以及成熟精子细胞中都不表达；(2)成熟卵巢中，RB基因在次级卵泡的卵母细胞中，以及孕期卵巢的次级卵泡的卵母细胞核中均有强度不同的转录表达；初级卵泡的卵母细胞中没有表达，成熟卵泡中的卵母细胞中也不再有表达。这些结果表明，RB基因在小鼠精子和卵子的发生过程中有着重要作用。
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RB基因于70年代最先在成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)中被发现，并于1980年由Friend等[1]克隆出其所在的DNA片段。RB基因是目前人们较普遍接受并作了较深入、广泛研究的抑癌基因之一。现有研究表明，RB基因是细胞周期控制及细胞分化中重要的调控因子[2]。动物的个体发育的实质，是一个从单个细胞受精卵开始，其基因组中的整套基因如何按一定的表达程序而表达，最后形成一个完整的有机体，在生殖细胞的发生中，基因如何按一定的时空表达程序表达，从而最后形成成熟的精子或卵子，为下一世代的个体发育作准备的问题。因而，生殖细胞是动物个体发育的基础，也是动物两个世代之间的桥梁。作为与细胞生长、增殖分化密切相关的抑癌基因——RB基因，在上述生殖细胞发育过程中基因的表达情况如何呢?探讨这样的问题，将有助于揭示个体发育中基因表达在时空上的特异性，从而揭示发育奥秘，而且也有助于加深和推进对RB基因在动物个体正常发育中的作用的认识。本研究采用组织原位杂交技术，探讨了RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中转录表达的空间分布。
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材料和方法
1.材料
1.1 睾丸和卵巢：均取自昆明种小白鼠。睾丸分两组取材，每组取5只，未成熟组为5周龄鼠，体重12～15g；成熟组为10周龄以上鼠，体重40～45g，卵巢也分两组取材，同样每组各取5只，成熟组为10周龄以上鼠，体重35～40g；怀孕组为怀孕1周的孕鼠，体重45～50g。
1.2 重组质粒：RB基因重组质粒p4.7R由美国Dryja教授赠送，载体为质粒PBR322中3.1kb的一片段，含有抗氨苄氰霉素基因和复制起点ori C序列；插入子为RB基因全长4.7kb的cDNA，经EcoRI酶切后可得3.8kb和0.9kb两个插入子片段。阴性对照质粒PBR322，全长4.3kb，购自北京东方试剂公司。
1.3 主要试剂：地高辛(DIG)标记、检测试剂盒为德国BM公司产品。
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其他试剂和药品均为国产AR级或进口分装。
2.方法
2.1 组织切片：将小鼠以颈椎脱臼法处死，迅速开腹，分别取下睾丸和卵巢，投入10%中性福尔马林中固定过夜，常规石蜡切片，厚10μm，常规贴片，室温干燥备用。
2.2 质粒转化、扩增、抽提按文献[3]：RB基因重组质粒经“氯化钙法”转化，氨苄(Amp)筛选，常规扩增，“碱裂解法”抽提，“氯化钾、聚乙二醇法”纯化，电泳鉴定后，-20℃贮存备用。
2.3 探针制备：
2.3.1 酶切：取质粒p4.7R和PBR322DNA各6μg，分别按0.2IU/μg DNA加入限制性内切酶EcoRI及缓冲液，再用消毒三蒸水调总体积达到80μl，37℃恒温过夜，得到的直链DNA，各取1μg与定量的标准DNA一起电泳，用EB(溴化乙锭)染色，根据其荧光强度来估计各自的DNA含量。
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2.3.2 标记：取上述酶切DNA(带基因插入子)1μg，按地高辛标记检测试剂盒使用说明书进行标记：煮沸变性10min，取出速置冰浴中3min，然后顺序加入：混合6聚寡核苷酸引物2μg(Hexamicleo tide maxture)，含4种脱氧核苷三磷酸和DIG标记的dUTP混合物，2μl klenow聚合酶1 unit，消毒三蒸水调总体积为20μl，37℃保温16h，然后加0.2mol/L的EDTA 2μl、4mol/L的LiCl 2μl终止反应。0.5倍体积预冷的无水乙醇，置20℃过夜沉淀DNA，12 000r/min，离心20min，沉淀用50μl l×TE溶解。这样制备后的地高辛标记探针其浓度为5mg/L。
2.4 组织原位杂交：无论睾丸或卵巢，每实验组均分别随机取5张切片用于原位杂交。具体杂交方法按文献[4]并稍加修改进行。
2.4.1 预处理：石蜡切片经二甲苯脱蜡20min，用无水乙醇洗2次，置换二甲苯(10min×2)，置空气中干燥，2×SSC饱和20min。
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2.4.2 预杂交：用消毒滤纸擦干玻片上组织周围的水分，但保持组织湿润。玻片置于4×SSC饱和的湿盒中，组织材料上加20～30μl预杂交液，42℃过夜。
2.4.3 杂交：在预杂交液中加入适量的变性标记探针，浓度为50μg/L，每张玻片组织切片上滴加20～40μl，42℃温盒过夜。同时检测4个组(睾丸2个组、卵巢2个组)。
2.4.4 免疫显色：将杂交后的玻片置2×SSC中洗1h，1×SSC中洗1h，0.5×SSC 37℃洗30min，封闭剂〔(30%牛血清白蛋白，0.3%TritonX-100)，buffer1稀释(buffer1∶100mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,pH7.5〕中室温孵育2h，以消除非特异性抗原。复合抗体(Dig)-AP, 1∶500 buffer1稀释，室温孵育过夜。buffer1洗2次，每次15min，NBT显色液暗盒显色6h。EDTA终止反应。乙醇系列脱水，二甲苯透明，树胶封片。
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2.4.5 对照组织实验： 用标记直链PBR322作阴性对照，实验操作与RB基因探针相同并同时进行。
结 果
1.RB基因探针与睾丸组织的杂交结果
1.1 未成熟组(5周龄)(图1)：用RB探针检测该组切片，多数曲细精管中杂交信号强烈，并且显示这种杂交信号的细胞是离开基底膜第2层或第3层以内直至从内层倒数第2层细胞的胞质，其核未被标记(没有杂交信号)。在个别曲细精管中甚至无任何细胞被标记。在有杂交信号的曲细精管中，因杂交信号无法反映细胞的分化状态而无法比较不同时期细胞的信号变化规律，但从信号在细胞层的分布判断，杂交信号主要在初级精母细胞、次级精母细胞中，而外周精原细胞和最内层的精子细胞以及整个曲细精管的固有膜，整个睾丸间质区，均无明显杂交信号。
1.2 成熟组(10周龄以上)(图2)：RB探针在该组切片上也检测到了强杂交信号，这些信号主要集中在半数曲细精管截面的精子细胞中，并且在胞质和胞核内均有标记，信号从第3层细胞开始出现，并且信号强，在开始变态、较充分变态和充分变态的精子细胞和精子中迅速减弱，直到无明显标记。有些曲细精管切面上也有被标记与未被标记并存的情况，有的曲细精管上甚至无任何明显标记，整个曲细精管固有膜，睾丸间质区均无任何明显的杂交信号，根据细胞层的排列判断，精原细胞和初级精母细胞中没有杂交信号。
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2.RB基因探针与小鼠卵巢组织的杂交结果
2.1 成熟组(10周龄以上)(图3)：杂交检测结果表明，RB探针杂交信号出现于初级卵泡和从小到大的次级卵泡中。在初级卵泡中杂交信号只出现在部分立方形单层卵泡细胞核中，胞质中无信号，初级卵母细胞内也无杂交信号，在次级卵泡中，随着卵泡的长大，杂交信号情况有明显变化：较小的，仅有几层卵泡细胞的次级卵泡，杂交信号只出现在多数卵泡细胞中，并且主要是其核被标记。初级卵母细胞无杂交信号；随着次级卵泡逐渐长大，出现杂交信号的卵泡细胞也增多，当卵泡中卵泡细胞增加到10～20层，并可见较小的卵泡腔时，杂交信号出现在所有的卵泡细胞中，并且不仅胞核被标记、胞质也标记。此时初级卵母细胞内也出现强杂交信号，高倍镜下这些信号呈颗粒状，散在分布于初级卵母细胞的胞核和胞质中。因而这一阶段的卵泡中杂交信号最强；当次级卵泡再稍长大，卵泡腔增多并开始合并时，整个卵泡上杂交信号明显减弱，只在大部分卵泡细胞内还有，初级卵母细胞中的信号则几乎完全消失。当卵泡成熟后，绝大部分卵泡细胞中的杂交信号均已消失，只局部区域的个别细胞还有标记。初级卵母细胞内的信号则全部消失。除发育中的卵泡外，原始卵泡，黄体和卵巢中其他细胞均未出现杂交信号。
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2.2 孕鼠组(图4、5)： 常规染色切片上，该组的卵泡多数是还未出现卵泡腔的中等大的次级卵泡，也有原始卵泡和初级卵泡。黄体(妊娠黄体)特别发达。
检测表明，在上述中等大的卵泡中，部分卵泡内的部分卵泡细胞中，有RB探针的强杂交信号，这些细胞多呈聚群状分布。多数卵泡的初级卵母细胞核中有强杂交信号，呈浓密集状，胞质中无杂交信号，而在有的卵泡中，初级卵母细胞核和胞质中均有强杂交信号，胞质中为颗粒状散在分布。原始卵泡、黄体和卵巢其他细胞均无明显杂交信号。
讨 论
前人有关RB抗癌基因的许多研究结果表明，该基因的生物学功能是抑制细胞从G\-1期到S期的转变，从而抑制细胞的分裂[5]。
本研究中，在未成熟组睾丸切片上，RB基因探针的强杂交信号出现在所有初级精母细胞胞质以及所有次级精母细胞，其余细胞，包括精原细胞、生精干细胞均未检出任何杂交信号。在成熟组睾丸切片上，强烈的杂交信号也只存在如上述的初级、次级精母细胞和未变态的精子细胞中，其余所有细胞，包括精原细胞，生精干细胞和开始变态以后的精子细胞，都无杂交信号。原位杂交检测的是mRNA信号，没有杂交信号意味着该基因没有转录表达，当然也不可能有蛋白质的翻译。有杂交信号意味着有mRNA转录，这种信号存在于细胞质中即意味着有相应蛋白的合成。RB基因mRNA在上述小鼠睾丸曲细精管各细胞层次的分布特点表明，精原细胞和干细胞没有该基因的表达，由于这些细胞要进行有丝分裂，RB基因的表达会抑制细胞的有丝分裂，在这些细胞中不表达，这与RB基因在细胞分裂中的抑制作用是一致的；而初级精母细胞到次级精母细胞的发生过程中细胞要进行减数分裂，在这些细胞中有较强的RB基因表达，这表明RB基因对减数分裂没有抑制作用。
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RB基因在成熟卵巢和孕期卵巢中的杂交结果表明，强杂交信号存在于初级卵母细胞的核与质中，而初级卵泡的初级卵母细胞中没有杂交信号，接近成熟的卵泡的初级卵母细胞中杂交信号也近于消失。由于18d的小鼠胚胎，其生殖腺中的卵母细胞即已发育S期之后[6]，所以出现杂交信号的初级卵母细胞不是处于减数分裂S期以前的细胞，这些细胞实际是处于已完成G1向S期转变后进一步发育成熟的阶段。所以与精子细胞的发育一样，RB基因可能对卵细胞的减数分裂也没有抑制作用。
由于RB基因对细胞的生长抑制作用的机制是其编码产物与E2F结合，从而抑制如c-myc,N-myc,DHFR一类正转录因子的活性[7,8]，使细胞不能进入DNA复制阶段，进而抑制细胞的G1期向S期的转变。本研究中RB基因的表达发生在已完成DNA复制的精母细胞和卵母细胞中，这可能是因为RB基因在减数分裂的第2次分裂时起抑制DNA的复制，保证减数分裂中染色体减半的作用。另一方面，RB基因在这一过程中可能还有其他的作用，由于减数分裂的第2次分裂不需要DNA的复制，所以RB基因的表达并不抑制细胞的分裂。
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本研究中，不同发育阶段的卵泡中的卵泡细胞中都有强杂交信号，这些事实是否表明RB基因的表达与卵泡细胞中某些对卵母细胞的发育有调控作用的分泌物质的合成有关，还有待进一步的研究。如果是这样，RB基因的功能就不仅是抑制某些基因的转录表达，还可能有促进其他一些基因转录的作用。当然，这种促进作用可能是直接的，也可能是间接的。
收稿 1997-04 修回 1997-12
图1～3 对照组7d、30d、90d肠系膜上动脉NPY免疫反应性神经纤维；(▲)示纤维，(△)示膨体；标尺示1cm=50μm
图4～6 高脂组7d、30d、90d肠系膜上动脉NPY免疫反应性神经纤维；(↑)示增生纤维，(△)示膨体；标尺示1cm=50μm
Fig.1-3 Control group. NPY-containing innervation on the wall of the superior mesenteric arteries. nerve fibers labeled (▲), varicosity labeled(△); Bar lcm=50μm
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Fig.4-6 Hyperlipidemic group. NPY-containing innervation on the wall of the superior mesenteric arteries. nerve fibers labeled (↑), varicosity labeled(△); Bar 1cm=50μm
图版说明
图1 5周龄小鼠睾丸曲细精管横切。RB探针的强杂交信号出现在初级精母细胞层和部分精子细胞中 ×400
图2 10周龄以上小鼠睾丸曲细精管横切。RB探针的强杂交信号出现在精子细胞中 ×400
图3 10周龄以上小鼠卵巢切片。RB探针的强杂交信号出现于初级卵泡和次级卵泡中 ×100
图4 怀孕1周龄小鼠卵巢切片。RB探针的强杂交信号出现在中等大小的次级卵泡中 ×100
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图5 为图4中1个次级卵泡的放大。RB探针的强杂交信号出现在次级卵泡的初级卵母细胞核中 ×400
Explanation of figures
Fig.1 The section of seminiferous tubule in testis of 5 weeks mice. The strong hybrid signal of RB gene probe was shown in primary spermatocytes and a port of spermatids.×400
Fig.2 The section of seminiferous tubule in testis of more than 10 weeks mice. The strong hybrid signal of RB gene probe was shown in spermatids.×400
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Fig.3 The section of ovary from more than 10 weeks mice. The strong hybrid signal of RB gene probe was shown in primany follicle and secondary follicle. ×100
Fig.4 The section of ovary of pregnant mice. The strong signal hybrid of RB gene probe was shown in middle secondary follicle.×100
Fig.5 Enlargement of a secondary follicle in Fig 4. The strong hydrid signal of RB gene probe was shown in nucleus of primary occyte. ×400
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* 国家自然科学基金资助课题(No.83生准字221)
参考文献
[1]Friend S H,Bernards R, Rogelj S, et al. A Human DAN segment with properites of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature, 1986, 323:643
[2]徐 斌，王新娟.RB在细胞周期调控中的作用.国外医学分子生物学分册，1995， 17(5)：211
[3]萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T(金冬雁，黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：16～34
[4]凯勒G H， 马纳克M M(孙士勇等译).DNA探针技术.北京：科学出版社，1992：133～153
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[5]Hagemeier C, Bannister A J, Cook A, et al. The activation domain of transcription factor PU.1 binds the retinoblastoma(RB) protein and the transcription factor TFIID in vitro:RB shows sequence similarity to TFIID and TFIIB. Proc Natl Acad Sa VSA,1993,90(4):1580
[6]俞慧珠，叶百宽.小白鼠胚胎发生.北京：科学出版社，1985：83～85
[7]Muller H, Lukas J, Scheinder A, et al. Cyclin D1 expression is regulated by the retinoblastoma portein. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(8):2945
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[8]Steven J W, Cheryl A P, Doglas C D. Retinoblastoma protein switches the E2F site from positive to negative element. Nature, 1992, 358(6383):259
STUDY ON THE EXPRESSION OF RB GENE DURING
GAMETOGENESIS OF KUNMING MICE
Wang Xiaoyan, Tan Deyong, Zan RuiguangΔ
(Biology Department of Yunnan University, Kunming)
Using in site hybridization on tissue section with Dig DNA labeling and detection system, We studied the expression of the antioncogene RB in testis and ovary of Kunming mice. The results are as follows:(1)in testis tissue, the expression of RB gene only was found in spermatocytes and prespermatids of seminiferous tubule of immature mice and spermatids of mature mice, and it was not found in the spermatogonia, spermatognial stem cell and primary metamorphous sperm from both immature and mature mice. (2)In ovary tissue, the expression of RB gene was found in oocytes of second follicle, the strength of expression was of variations with different phases of development, and it was not found in both primary oocytes and mature oocyte. The expression of RB gene was also found in oocyte nucleus of second follicle in pregnant mice. These results showed that the RB gene might involve in the spermatogenesis and oogenesis of mice.
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KEY WORDS RB gene;Expression;Spermatogenesis;Oogenesis;Kunming Mice
Δ Biology Department of Yunnan University, Kunming 650091, China
*书评*
《临床癌症遗传学——风险咨询与处理》评介
虎年伊始，中国医学科学院图书馆收到了JOHN WILEY and SONS(ASIA)PTE LTD1998年最新版本《临床癌症遗传学——风险咨询与处理》(Clinical Cancer Genetics,Risk Counseling and Management)的赠书。无疑，这表明人民间的友谊与战胜癌症的共同心声。
癌症发生固然与化学药品、病毒和射线等诸多致癌因子有关，但临床医生与癌症研究者们愈来愈注意到某些家族具有好发癌症的素质，或称之为倾向性。因此，无论是普通群众，尤其是医生们必须具备一定的临床癌症遗传学的知识。《临床癌症遗传学——风险咨询与处理》正是在这种背景下全面介绍有关癌症遗传学的理论、普查与诊断、处理等问题的一部实践指南。然而，本书毫无说教之弊，它在强调原则的同时，引证了许多生动实例，并加以详细分析。因此，读者在研读之时，无形中便已心领神会地掌握了其中的原理。
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本书概述如下内容：临床癌症遗传学和风险咨询；癌症的遣传性与获得性风险，作为遗传性疾病的癌症，常见的遗传性癌症：乳腺癌综合征、卵巢癌综合征、结肠癌综合征、前列腺癌综合征；其他癌症综合征；癌症风险评估的定量方法，癌症遗传测试的实验室方法；癌症病人治疗中的遗传学测试；癌症病人及家属的生育咨询；癌症风险咨询中的心理学、伦理学以及法律等问题。
本书作者Kenneth Offit博士(MD，MPH)是纽约 Memorial Sloan-Kettering癌症研究中心人类遗传学临床遗传服务部主任，原毕业于Princeton大学，后获哈佛大学医学院医学博士。主要研究领域为乳腺癌，结肠癌以及非何杰金病，已在乳腺癌和卵巢癌突变研究方面获得显著成就。
本书由Wiley-Liss,Inc.出版
章静波, http://www.100md.com(王晓燕** 谭德勇 昝瑞光)
单位：云南大学生物学系，昆明 650091；**云南教育学院生物学系，昆明
关键词：RB基因；基因表达；精子发生；卵子发生；小鼠
解剖学报980311 摘 要 为研究RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中的表达，用地高辛(DIG)标记的RB基因的DNA探针和碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，在组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交分析方法，检测了昆明种正常雄性小鼠及雌性小鼠不同发育期生殖细胞发生过程中RB基因的转录表达(mRNA)，结果发现：(1)在睾丸组织中，RB基因只在性未成熟组睾丸曲细精管的初级精母细胞，精子细胞层以及性成熟组睾丸曲细精管的精子细胞层中有强转录表达；在精原细胞和生精干细胞层以及成熟精子细胞中都不表达；(2)成熟卵巢中，RB基因在次级卵泡的卵母细胞中，以及孕期卵巢的次级卵泡的卵母细胞核中均有强度不同的转录表达；初级卵泡的卵母细胞中没有表达，成熟卵泡中的卵母细胞中也不再有表达。这些结果表明，RB基因在小鼠精子和卵子的发生过程中有着重要作用。
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RB基因于70年代最先在成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)中被发现，并于1980年由Friend等[1]克隆出其所在的DNA片段。RB基因是目前人们较普遍接受并作了较深入、广泛研究的抑癌基因之一。现有研究表明，RB基因是细胞周期控制及细胞分化中重要的调控因子[2]。动物的个体发育的实质，是一个从单个细胞受精卵开始，其基因组中的整套基因如何按一定的表达程序而表达，最后形成一个完整的有机体，在生殖细胞的发生中，基因如何按一定的时空表达程序表达，从而最后形成成熟的精子或卵子，为下一世代的个体发育作准备的问题。因而，生殖细胞是动物个体发育的基础，也是动物两个世代之间的桥梁。作为与细胞生长、增殖分化密切相关的抑癌基因——RB基因，在上述生殖细胞发育过程中基因的表达情况如何呢?探讨这样的问题，将有助于揭示个体发育中基因表达在时空上的特异性，从而揭示发育奥秘，而且也有助于加深和推进对RB基因在动物个体正常发育中的作用的认识。本研究采用组织原位杂交技术，探讨了RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中转录表达的空间分布。
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材料和方法
1.材料
1.1 睾丸和卵巢：均取自昆明种小白鼠。睾丸分两组取材，每组取5只，未成熟组为5周龄鼠，体重12～15g；成熟组为10周龄以上鼠，体重40～45g，卵巢也分两组取材，同样每组各取5只，成熟组为10周龄以上鼠，体重35～40g；怀孕组为怀孕1周的孕鼠，体重45～50g。
1.2 重组质粒：RB基因重组质粒p4.7R由美国Dryja教授赠送，载体为质粒PBR322中3.1kb的一片段，含有抗氨苄氰霉素基因和复制起点ori C序列；插入子为RB基因全长4.7kb的cDNA，经EcoRI酶切后可得3.8kb和0.9kb两个插入子片段。阴性对照质粒PBR322，全长4.3kb，购自北京东方试剂公司。
1.3 主要试剂：地高辛(DIG)标记、检测试剂盒为德国BM公司产品。
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其他试剂和药品均为国产AR级或进口分装。
2.方法
2.1 组织切片：将小鼠以颈椎脱臼法处死，迅速开腹，分别取下睾丸和卵巢，投入10%中性福尔马林中固定过夜，常规石蜡切片，厚10μm，常规贴片，室温干燥备用。
2.2 质粒转化、扩增、抽提按文献[3]：RB基因重组质粒经“氯化钙法”转化，氨苄(Amp)筛选，常规扩增，“碱裂解法”抽提，“氯化钾、聚乙二醇法”纯化，电泳鉴定后，-20℃贮存备用。
2.3 探针制备：
2.3.1 酶切：取质粒p4.7R和PBR322DNA各6μg，分别按0.2IU/μg DNA加入限制性内切酶EcoRI及缓冲液，再用消毒三蒸水调总体积达到80μl，37℃恒温过夜，得到的直链DNA，各取1μg与定量的标准DNA一起电泳，用EB(溴化乙锭)染色，根据其荧光强度来估计各自的DNA含量。
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2.3.2 标记：取上述酶切DNA(带基因插入子)1μg，按地高辛标记检测试剂盒使用说明书进行标记：煮沸变性10min，取出速置冰浴中3min，然后顺序加入：混合6聚寡核苷酸引物2μg(Hexamicleo tide maxture)，含4种脱氧核苷三磷酸和DIG标记的dUTP混合物，2μl klenow聚合酶1 unit，消毒三蒸水调总体积为20μl，37℃保温16h，然后加0.2mol/L的EDTA 2μl、4mol/L的LiCl 2μl终止反应。0.5倍体积预冷的无水乙醇，置20℃过夜沉淀DNA，12 000r/min，离心20min，沉淀用50μl l×TE溶解。这样制备后的地高辛标记探针其浓度为5mg/L。
2.4 组织原位杂交：无论睾丸或卵巢，每实验组均分别随机取5张切片用于原位杂交。具体杂交方法按文献[4]并稍加修改进行。
2.4.1 预处理：石蜡切片经二甲苯脱蜡20min，用无水乙醇洗2次，置换二甲苯(10min×2)，置空气中干燥，2×SSC饱和20min。
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2.4.2 预杂交：用消毒滤纸擦干玻片上组织周围的水分，但保持组织湿润。玻片置于4×SSC饱和的湿盒中，组织材料上加20～30μl预杂交液，42℃过夜。
2.4.3 杂交：在预杂交液中加入适量的变性标记探针，浓度为50μg/L，每张玻片组织切片上滴加20～40μl，42℃温盒过夜。同时检测4个组(睾丸2个组、卵巢2个组)。
2.4.4 免疫显色：将杂交后的玻片置2×SSC中洗1h，1×SSC中洗1h，0.5×SSC 37℃洗30min，封闭剂〔(30%牛血清白蛋白，0.3%TritonX-100)，buffer1稀释(buffer1∶100mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,pH7.5〕中室温孵育2h，以消除非特异性抗原。复合抗体(Dig)-AP, 1∶500 buffer1稀释，室温孵育过夜。buffer1洗2次，每次15min，NBT显色液暗盒显色6h。EDTA终止反应。乙醇系列脱水，二甲苯透明，树胶封片。
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2.4.5 对照组织实验： 用标记直链PBR322作阴性对照，实验操作与RB基因探针相同并同时进行。
结 果
1.RB基因探针与睾丸组织的杂交结果
1.1 未成熟组(5周龄)(图1)：用RB探针检测该组切片，多数曲细精管中杂交信号强烈，并且显示这种杂交信号的细胞是离开基底膜第2层或第3层以内直至从内层倒数第2层细胞的胞质，其核未被标记(没有杂交信号)。在个别曲细精管中甚至无任何细胞被标记。在有杂交信号的曲细精管中，因杂交信号无法反映细胞的分化状态而无法比较不同时期细胞的信号变化规律，但从信号在细胞层的分布判断，杂交信号主要在初级精母细胞、次级精母细胞中，而外周精原细胞和最内层的精子细胞以及整个曲细精管的固有膜，整个睾丸间质区，均无明显杂交信号。
1.2 成熟组(10周龄以上)(图2)：RB探针在该组切片上也检测到了强杂交信号，这些信号主要集中在半数曲细精管截面的精子细胞中，并且在胞质和胞核内均有标记，信号从第3层细胞开始出现，并且信号强，在开始变态、较充分变态和充分变态的精子细胞和精子中迅速减弱，直到无明显标记。有些曲细精管切面上也有被标记与未被标记并存的情况，有的曲细精管上甚至无任何明显标记，整个曲细精管固有膜，睾丸间质区均无任何明显的杂交信号，根据细胞层的排列判断，精原细胞和初级精母细胞中没有杂交信号。
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2.RB基因探针与小鼠卵巢组织的杂交结果
2.1 成熟组(10周龄以上)(图3)：杂交检测结果表明，RB探针杂交信号出现于初级卵泡和从小到大的次级卵泡中。在初级卵泡中杂交信号只出现在部分立方形单层卵泡细胞核中，胞质中无信号，初级卵母细胞内也无杂交信号，在次级卵泡中，随着卵泡的长大，杂交信号情况有明显变化：较小的，仅有几层卵泡细胞的次级卵泡，杂交信号只出现在多数卵泡细胞中，并且主要是其核被标记。初级卵母细胞无杂交信号；随着次级卵泡逐渐长大，出现杂交信号的卵泡细胞也增多，当卵泡中卵泡细胞增加到10～20层，并可见较小的卵泡腔时，杂交信号出现在所有的卵泡细胞中，并且不仅胞核被标记、胞质也标记。此时初级卵母细胞内也出现强杂交信号，高倍镜下这些信号呈颗粒状，散在分布于初级卵母细胞的胞核和胞质中。因而这一阶段的卵泡中杂交信号最强；当次级卵泡再稍长大，卵泡腔增多并开始合并时，整个卵泡上杂交信号明显减弱，只在大部分卵泡细胞内还有，初级卵母细胞中的信号则几乎完全消失。当卵泡成熟后，绝大部分卵泡细胞中的杂交信号均已消失，只局部区域的个别细胞还有标记。初级卵母细胞内的信号则全部消失。除发育中的卵泡外，原始卵泡，黄体和卵巢中其他细胞均未出现杂交信号。
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2.2 孕鼠组(图4、5)： 常规染色切片上，该组的卵泡多数是还未出现卵泡腔的中等大的次级卵泡，也有原始卵泡和初级卵泡。黄体(妊娠黄体)特别发达。
检测表明，在上述中等大的卵泡中，部分卵泡内的部分卵泡细胞中，有RB探针的强杂交信号，这些细胞多呈聚群状分布。多数卵泡的初级卵母细胞核中有强杂交信号，呈浓密集状，胞质中无杂交信号，而在有的卵泡中，初级卵母细胞核和胞质中均有强杂交信号，胞质中为颗粒状散在分布。原始卵泡、黄体和卵巢其他细胞均无明显杂交信号。
讨 论
前人有关RB抗癌基因的许多研究结果表明，该基因的生物学功能是抑制细胞从G\-1期到S期的转变，从而抑制细胞的分裂[5]。
本研究中，在未成熟组睾丸切片上，RB基因探针的强杂交信号出现在所有初级精母细胞胞质以及所有次级精母细胞，其余细胞，包括精原细胞、生精干细胞均未检出任何杂交信号。在成熟组睾丸切片上，强烈的杂交信号也只存在如上述的初级、次级精母细胞和未变态的精子细胞中，其余所有细胞，包括精原细胞，生精干细胞和开始变态以后的精子细胞，都无杂交信号。原位杂交检测的是mRNA信号，没有杂交信号意味着该基因没有转录表达，当然也不可能有蛋白质的翻译。有杂交信号意味着有mRNA转录，这种信号存在于细胞质中即意味着有相应蛋白的合成。RB基因mRNA在上述小鼠睾丸曲细精管各细胞层次的分布特点表明，精原细胞和干细胞没有该基因的表达，由于这些细胞要进行有丝分裂，RB基因的表达会抑制细胞的有丝分裂，在这些细胞中不表达，这与RB基因在细胞分裂中的抑制作用是一致的；而初级精母细胞到次级精母细胞的发生过程中细胞要进行减数分裂，在这些细胞中有较强的RB基因表达，这表明RB基因对减数分裂没有抑制作用。
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RB基因在成熟卵巢和孕期卵巢中的杂交结果表明，强杂交信号存在于初级卵母细胞的核与质中，而初级卵泡的初级卵母细胞中没有杂交信号，接近成熟的卵泡的初级卵母细胞中杂交信号也近于消失。由于18d的小鼠胚胎，其生殖腺中的卵母细胞即已发育S期之后[6]，所以出现杂交信号的初级卵母细胞不是处于减数分裂S期以前的细胞，这些细胞实际是处于已完成G1向S期转变后进一步发育成熟的阶段。所以与精子细胞的发育一样，RB基因可能对卵细胞的减数分裂也没有抑制作用。
由于RB基因对细胞的生长抑制作用的机制是其编码产物与E2F结合，从而抑制如c-myc,N-myc,DHFR一类正转录因子的活性[7,8]，使细胞不能进入DNA复制阶段，进而抑制细胞的G1期向S期的转变。本研究中RB基因的表达发生在已完成DNA复制的精母细胞和卵母细胞中，这可能是因为RB基因在减数分裂的第2次分裂时起抑制DNA的复制，保证减数分裂中染色体减半的作用。另一方面，RB基因在这一过程中可能还有其他的作用，由于减数分裂的第2次分裂不需要DNA的复制，所以RB基因的表达并不抑制细胞的分裂。
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本研究中，不同发育阶段的卵泡中的卵泡细胞中都有强杂交信号，这些事实是否表明RB基因的表达与卵泡细胞中某些对卵母细胞的发育有调控作用的分泌物质的合成有关，还有待进一步的研究。如果是这样，RB基因的功能就不仅是抑制某些基因的转录表达，还可能有促进其他一些基因转录的作用。当然，这种促进作用可能是直接的，也可能是间接的。
收稿 1997-04 修回 1997-12
图1～3 对照组7d、30d、90d肠系膜上动脉NPY免疫反应性神经纤维；(▲)示纤维，(△)示膨体；标尺示1cm=50μm
图4～6 高脂组7d、30d、90d肠系膜上动脉NPY免疫反应性神经纤维；(↑)示增生纤维，(△)示膨体；标尺示1cm=50μm
Fig.1-3 Control group. NPY-containing innervation on the wall of the superior mesenteric arteries. nerve fibers labeled (▲), varicosity labeled(△); Bar lcm=50μm
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Fig.4-6 Hyperlipidemic group. NPY-containing innervation on the wall of the superior mesenteric arteries. nerve fibers labeled (↑), varicosity labeled(△); Bar 1cm=50μm
图版说明
图1 5周龄小鼠睾丸曲细精管横切。RB探针的强杂交信号出现在初级精母细胞层和部分精子细胞中 ×400
图2 10周龄以上小鼠睾丸曲细精管横切。RB探针的强杂交信号出现在精子细胞中 ×400
图3 10周龄以上小鼠卵巢切片。RB探针的强杂交信号出现于初级卵泡和次级卵泡中 ×100
图4 怀孕1周龄小鼠卵巢切片。RB探针的强杂交信号出现在中等大小的次级卵泡中 ×100
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图5 为图4中1个次级卵泡的放大。RB探针的强杂交信号出现在次级卵泡的初级卵母细胞核中 ×400
Explanation of figures
Fig.1 The section of seminiferous tubule in testis of 5 weeks mice. The strong hybrid signal of RB gene probe was shown in primary spermatocytes and a port of spermatids.×400
Fig.2 The section of seminiferous tubule in testis of more than 10 weeks mice. The strong hybrid signal of RB gene probe was shown in spermatids.×400
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Fig.3 The section of ovary from more than 10 weeks mice. The strong hybrid signal of RB gene probe was shown in primany follicle and secondary follicle. ×100
Fig.4 The section of ovary of pregnant mice. The strong signal hybrid of RB gene probe was shown in middle secondary follicle.×100
Fig.5 Enlargement of a secondary follicle in Fig 4. The strong hydrid signal of RB gene probe was shown in nucleus of primary occyte. ×400
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* 国家自然科学基金资助课题(No.83生准字221)
参考文献
[1]Friend S H,Bernards R, Rogelj S, et al. A Human DAN segment with properites of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature, 1986, 323:643
[2]徐 斌，王新娟.RB在细胞周期调控中的作用.国外医学分子生物学分册，1995， 17(5)：211
[3]萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T(金冬雁，黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：16～34
[4]凯勒G H， 马纳克M M(孙士勇等译).DNA探针技术.北京：科学出版社，1992：133～153
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[5]Hagemeier C, Bannister A J, Cook A, et al. The activation domain of transcription factor PU.1 binds the retinoblastoma(RB) protein and the transcription factor TFIID in vitro:RB shows sequence similarity to TFIID and TFIIB. Proc Natl Acad Sa VSA,1993,90(4):1580
[6]俞慧珠，叶百宽.小白鼠胚胎发生.北京：科学出版社，1985：83～85
[7]Muller H, Lukas J, Scheinder A, et al. Cyclin D1 expression is regulated by the retinoblastoma portein. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(8):2945
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[8]Steven J W, Cheryl A P, Doglas C D. Retinoblastoma protein switches the E2F site from positive to negative element. Nature, 1992, 358(6383):259
STUDY ON THE EXPRESSION OF RB GENE DURING
GAMETOGENESIS OF KUNMING MICE
Wang Xiaoyan, Tan Deyong, Zan RuiguangΔ
(Biology Department of Yunnan University, Kunming)
Using in site hybridization on tissue section with Dig DNA labeling and detection system, We studied the expression of the antioncogene RB in testis and ovary of Kunming mice. The results are as follows:(1)in testis tissue, the expression of RB gene only was found in spermatocytes and prespermatids of seminiferous tubule of immature mice and spermatids of mature mice, and it was not found in the spermatogonia, spermatognial stem cell and primary metamorphous sperm from both immature and mature mice. (2)In ovary tissue, the expression of RB gene was found in oocytes of second follicle, the strength of expression was of variations with different phases of development, and it was not found in both primary oocytes and mature oocyte. The expression of RB gene was also found in oocyte nucleus of second follicle in pregnant mice. These results showed that the RB gene might involve in the spermatogenesis and oogenesis of mice.
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KEY WORDS RB gene;Expression;Spermatogenesis;Oogenesis;Kunming Mice
Δ Biology Department of Yunnan University, Kunming 650091, China
*书评*
《临床癌症遗传学——风险咨询与处理》评介
虎年伊始，中国医学科学院图书馆收到了JOHN WILEY and SONS(ASIA)PTE LTD1998年最新版本《临床癌症遗传学——风险咨询与处理》(Clinical Cancer Genetics,Risk Counseling and Management)的赠书。无疑，这表明人民间的友谊与战胜癌症的共同心声。
癌症发生固然与化学药品、病毒和射线等诸多致癌因子有关，但临床医生与癌症研究者们愈来愈注意到某些家族具有好发癌症的素质，或称之为倾向性。因此，无论是普通群众，尤其是医生们必须具备一定的临床癌症遗传学的知识。《临床癌症遗传学——风险咨询与处理》正是在这种背景下全面介绍有关癌症遗传学的理论、普查与诊断、处理等问题的一部实践指南。然而，本书毫无说教之弊，它在强调原则的同时，引证了许多生动实例，并加以详细分析。因此，读者在研读之时，无形中便已心领神会地掌握了其中的原理。
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本书概述如下内容：临床癌症遗传学和风险咨询；癌症的遣传性与获得性风险，作为遗传性疾病的癌症，常见的遗传性癌症：乳腺癌综合征、卵巢癌综合征、结肠癌综合征、前列腺癌综合征；其他癌症综合征；癌症风险评估的定量方法，癌症遗传测试的实验室方法；癌症病人治疗中的遗传学测试；癌症病人及家属的生育咨询；癌症风险咨询中的心理学、伦理学以及法律等问题。
本书作者Kenneth Offit博士(MD，MPH)是纽约 Memorial Sloan-Kettering癌症研究中心人类遗传学临床遗传服务部主任，原毕业于Princeton大学，后获哈佛大学医学院医学博士。主要研究领域为乳腺癌，结肠癌以及非何杰金病，已在乳腺癌和卵巢癌突变研究方面获得显著成就。
本书由Wiley-Liss,Inc.出版
章静波, http://www.100md.com(王晓燕** 谭德勇 昝瑞光)