不同保存温度对脐血造血细胞的影响
作者：辜少玲 廖灿 刘斌 许遵鹏
单位：辜少玲(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)；廖灿(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)；刘斌(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)；许遵鹏(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)
关键词：脐血库；造血干细胞；冷冻保存
临床血液学杂志000205 摘 要：目的：探讨液氮的液相和气相保存条件对脐血造血细胞的影响。方法：对15例分离后的脐血有核细胞进行程控降温，分别保存于液相(-196℃)和气相(-125～-150℃)中，在0.5～1.0年后复温，对脐血造血细胞的活率、有核细胞回收率和祖细胞数进行了比较。结果：在液相中保存半年和1年的细胞活率、有核细胞数及总祖细胞数的回收率无明显变化；在气相中保存0.5～1.0年的细胞活率、有核细胞数及祖细胞数的回收率差异较明显。结论：为避免脐血造血细胞在长期冻存过程中的损失，建立脐血库时宜将样本保存在液氮的液相中。
, 百拇医药
The effects of using different temperature to preserve cord blood hematopoietic cells
GU Shao-ling LIAO Can LIU Bing XU Zun-peng
(Guangzhou Maternal & Neonatal Hospital,Guangzhou,510180)
Abstract：Objective:To study the different effects of preserving cord blood stem cells in liquid phase and in vapor phase of LN2.Methods:15 fractionated cord blood nucleated cells units were preserved in liquid phase (-196℃) and vapor phase (-125～-150℃) of LN2 respectively.The cells were thawed after half or an year,and tested the cell viability,the recovery of nucleated cells and progenieor cells count.Results:There were no significant difference between fresh unites and unites preserved in liquid phase,howver,Liguid phase the viability and the nucleated cells preserved in vapor phase were significantly different lowpared those in.Conclusion:Cord blood stem cells snould be presered in liquid phase of LNZ while establishing a cord blood bank.
, 百拇医药
Key words：Lowpareduith Cord blood banking Hematopoietic Cryopresevation▲
目前已通过临床证明，脐血造血干细胞移植是治疗白血病、恶性肿瘤、重型地中海贫血等多种疾病的有效方法。为了及时获取HLA配型相合的脐血进行移植，必须建立大规模的脐血库，安全可靠地保存温度是建立脐血库的关键。
1 材料和方法
1.1 标本来源
健康、足月孕妇顺产的新生儿脐血，CPD-A抗凝。
1.2 脐血的分离
用6%羟乙基淀粉(美国，Dupont phama公司)与脐血1∶4混合分离15例脐血，去红细胞和血浆后的体积为27～36 ml〔1〕。
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1.3 脐血的冷冻
每例脐血平均分为4份，分装于冷冻管中，分别加入终浓度为10%二甲基亚砜(DMSO，美国，Sigma公司)与2.5%右旋糖酐(LMD，美国，Baxter公司)混合冷冻保护液〔1〕。
1.4 降温过程
用Cryo-10 SERIES Ⅲ程序降温仪(英国，Planer公司)以-1℃/min的速度降至-40℃，再以-5℃/min降至-100℃后，取2份脐血置于保存罐(MVE 1370，美国)的液相中，另2份置于保存罐(MVE 500，美国)的气相中保存。
1.5 脐血的复温
分别在0.5～1.0年后取出复温，水浴温度控制在41℃，每份脐血均可在2 min内冻融。对倍加入等体积的5%白蛋白和10% LMD混合液〔1〕，混匀平衡5 min后离心去DMSO，再用LMD调细胞悬液。
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1.6 检测指标
①台盼蓝拒染法测冷冻前后的细胞活率。②采用Coulter JT型血细胞计数仪测冷冻前后的有核细胞数。③祖细胞培养〔2〕：采用甲基纤维素半固体培养基，在2 ml体系中包括粒细胞刺激因子(200 ng/ml)、促红细胞生成素(IU/ml)、IL-3(10 ng/ml)及干细胞因子(50 ng/ml)，加入2×105个活细胞，于37℃、5% CO2条件下培养14 d，分别计数CFU-GM、BFU-E和CFU-Mix，计算其回收率。
1.7 统计
采用配对资料的t检验。
2 结果
脐血保存在液氮液相和气相中0.5～1.0年的效果见表1。
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表1 保存在液相和气相中0.5～1.0年的检测结果 % 保存期
(年)
细胞
活率
有核细胞
回收率
CFU-GM
BFU-E
CFU-Mix
1 液相
0.5
96.5±8.11
, http://www.100md.com
98.7±4.32
93.6±13.29
88.3±22.87
89.9±20.77
1.0
95.7±9.60
97.5±6.78
90.7±18.11
87.5±25.10
86.4±26.24
2 气相
0.5
, 百拇医药
92.9±9.901)
90.6±13.211)
85.9±20.161)
80.3±25.711)
76.7±26.212)
1.0
87.8±15.342)
86.6±15.262)
81.9±18.452)
, 百拇医药
75.6±23.412)
73.4±20.563)
注：检验方法指复温前后结果的比较，1)表示P<0.05，2)表示P<0.01，3)表示P<0.0013 讨论
自1988年Cluckman等首次对1例5岁范可尼贫血男孩进行脐血干细胞移植(UCBT)获得成功以来，已有600多人进行了UCBT，成为异体骨髓移植的一种有效替代手段〔3〕。脐血造血干细胞数对于获得长期植入是一个关键因素，因此其冻存的效果尤为重要。国内外不少有关这方面的研究，有研究者报告，-196℃直接冻存脐血>6个月，HPP-CFC、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-GM回收率为80%～87%，经分离后的单个核细胞冻存后长期培养起始细胞(LTC-IC)、CFU-GEMM-BFU-E、CFU-GM回收率为82%～91%〔4〕。Broxemeyer等〔5〕研究表明，保存在液氮10年的脐血造血干细胞仍具有良好的回收率。国内也有报告，脐血置-80%冰箱保存1年后有核细胞回收率为92.4±6.6%，CFU-GM回收率86.1±4.1%，活率83.1±4.4%〔6〕。本实验室的实验结果发现，冻存在液相中的样本各项指标无明显改变，而置于气相中的样本则有较明显的改变。为什么气相温度在-125%以下，其冻存效果仍不理想，可能是由于在气相中温度不稳定造成的，尤其在建库过程中频繁开启储存罐盖，更易造成气相温度波动，或其他原因尚待研究。但综合各家报道，我们认为建立大规模的脐血库，为确保样本的质量，尤其是长期保存的质量，将样本保存于液氮的液相中为宜。■
, http://www.100md.com
基金羡慕：本课题为广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程课题
参考文献：
[1]Rubinstein E,Broxmeyer H E,Auerbach A D,et al.Hematopoietic reconstitution unrelated bone marrow in processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood.Proc Natl Acad Sci,1995,92:10119～10122
[2]裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血因子对脐血CD+34细胞的体外护增作用.中华血液学杂志，1996，17：304～307
[3]韩忠朝，冯四洲，韩明哲.造血干细胞移植及其应用.中华血液学杂志，1998，18：663～667
, 百拇医药
[4]Almici C,Carlo-Stella C,Wagner J E,et al.Clonogenic capacity and exvivo expoansion potyential of umbilical curd blood progenitor cells are not impaered by cryopreservation.BMT,1997,19:1079～1084
[5]Broxmeyer H E,Cooper X.High-efficiency recovery of immature haematopoietic progenitor cells with extensive proliferative capacity from human cord blood cryopreserved for 10 years.Clin Cxp Immunol,1997.107(Suppl 1):45～53
[6]范华骅，马庆，柏乃庆.骨髓、脐血、外周血干细胞-80℃保存研究.中国输血杂志，1998，11：8～9
(收稿日期：1999-08-24), http://www.100md.com
单位：辜少玲(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)；廖灿(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)；刘斌(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)；许遵鹏(广州市妇婴医院、广州脐血库 广州，510180)
关键词：脐血库；造血干细胞；冷冻保存
临床血液学杂志000205 摘 要：目的：探讨液氮的液相和气相保存条件对脐血造血细胞的影响。方法：对15例分离后的脐血有核细胞进行程控降温，分别保存于液相(-196℃)和气相(-125～-150℃)中，在0.5～1.0年后复温，对脐血造血细胞的活率、有核细胞回收率和祖细胞数进行了比较。结果：在液相中保存半年和1年的细胞活率、有核细胞数及总祖细胞数的回收率无明显变化；在气相中保存0.5～1.0年的细胞活率、有核细胞数及祖细胞数的回收率差异较明显。结论：为避免脐血造血细胞在长期冻存过程中的损失，建立脐血库时宜将样本保存在液氮的液相中。
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The effects of using different temperature to preserve cord blood hematopoietic cells
GU Shao-ling LIAO Can LIU Bing XU Zun-peng
(Guangzhou Maternal & Neonatal Hospital,Guangzhou,510180)
Abstract：Objective:To study the different effects of preserving cord blood stem cells in liquid phase and in vapor phase of LN2.Methods:15 fractionated cord blood nucleated cells units were preserved in liquid phase (-196℃) and vapor phase (-125～-150℃) of LN2 respectively.The cells were thawed after half or an year,and tested the cell viability,the recovery of nucleated cells and progenieor cells count.Results:There were no significant difference between fresh unites and unites preserved in liquid phase,howver,Liguid phase the viability and the nucleated cells preserved in vapor phase were significantly different lowpared those in.Conclusion:Cord blood stem cells snould be presered in liquid phase of LNZ while establishing a cord blood bank.
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Key words：Lowpareduith Cord blood banking Hematopoietic Cryopresevation▲
目前已通过临床证明，脐血造血干细胞移植是治疗白血病、恶性肿瘤、重型地中海贫血等多种疾病的有效方法。为了及时获取HLA配型相合的脐血进行移植，必须建立大规模的脐血库，安全可靠地保存温度是建立脐血库的关键。
1 材料和方法
1.1 标本来源
健康、足月孕妇顺产的新生儿脐血，CPD-A抗凝。
1.2 脐血的分离
用6%羟乙基淀粉(美国，Dupont phama公司)与脐血1∶4混合分离15例脐血，去红细胞和血浆后的体积为27～36 ml〔1〕。
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1.3 脐血的冷冻
每例脐血平均分为4份，分装于冷冻管中，分别加入终浓度为10%二甲基亚砜(DMSO，美国，Sigma公司)与2.5%右旋糖酐(LMD，美国，Baxter公司)混合冷冻保护液〔1〕。
1.4 降温过程
用Cryo-10 SERIES Ⅲ程序降温仪(英国，Planer公司)以-1℃/min的速度降至-40℃，再以-5℃/min降至-100℃后，取2份脐血置于保存罐(MVE 1370，美国)的液相中，另2份置于保存罐(MVE 500，美国)的气相中保存。
1.5 脐血的复温
分别在0.5～1.0年后取出复温，水浴温度控制在41℃，每份脐血均可在2 min内冻融。对倍加入等体积的5%白蛋白和10% LMD混合液〔1〕，混匀平衡5 min后离心去DMSO，再用LMD调细胞悬液。
, 百拇医药
1.6 检测指标
①台盼蓝拒染法测冷冻前后的细胞活率。②采用Coulter JT型血细胞计数仪测冷冻前后的有核细胞数。③祖细胞培养〔2〕：采用甲基纤维素半固体培养基，在2 ml体系中包括粒细胞刺激因子(200 ng/ml)、促红细胞生成素(IU/ml)、IL-3(10 ng/ml)及干细胞因子(50 ng/ml)，加入2×105个活细胞，于37℃、5% CO2条件下培养14 d，分别计数CFU-GM、BFU-E和CFU-Mix，计算其回收率。
1.7 统计
采用配对资料的t检验。
2 结果
脐血保存在液氮液相和气相中0.5～1.0年的效果见表1。
, 百拇医药
表1 保存在液相和气相中0.5～1.0年的检测结果 % 保存期
(年)
细胞
活率
有核细胞
回收率
CFU-GM
BFU-E
CFU-Mix
1 液相
0.5
96.5±8.11
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98.7±4.32
93.6±13.29
88.3±22.87
89.9±20.77
1.0
95.7±9.60
97.5±6.78
90.7±18.11
87.5±25.10
86.4±26.24
2 气相
0.5
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92.9±9.901)
90.6±13.211)
85.9±20.161)
80.3±25.711)
76.7±26.212)
1.0
87.8±15.342)
86.6±15.262)
81.9±18.452)
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75.6±23.412)
73.4±20.563)
注：检验方法指复温前后结果的比较，1)表示P<0.05，2)表示P<0.01，3)表示P<0.0013 讨论
自1988年Cluckman等首次对1例5岁范可尼贫血男孩进行脐血干细胞移植(UCBT)获得成功以来，已有600多人进行了UCBT，成为异体骨髓移植的一种有效替代手段〔3〕。脐血造血干细胞数对于获得长期植入是一个关键因素，因此其冻存的效果尤为重要。国内外不少有关这方面的研究，有研究者报告，-196℃直接冻存脐血>6个月，HPP-CFC、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-GM回收率为80%～87%，经分离后的单个核细胞冻存后长期培养起始细胞(LTC-IC)、CFU-GEMM-BFU-E、CFU-GM回收率为82%～91%〔4〕。Broxemeyer等〔5〕研究表明，保存在液氮10年的脐血造血干细胞仍具有良好的回收率。国内也有报告，脐血置-80%冰箱保存1年后有核细胞回收率为92.4±6.6%，CFU-GM回收率86.1±4.1%，活率83.1±4.4%〔6〕。本实验室的实验结果发现，冻存在液相中的样本各项指标无明显改变，而置于气相中的样本则有较明显的改变。为什么气相温度在-125%以下，其冻存效果仍不理想，可能是由于在气相中温度不稳定造成的，尤其在建库过程中频繁开启储存罐盖，更易造成气相温度波动，或其他原因尚待研究。但综合各家报道，我们认为建立大规模的脐血库，为确保样本的质量，尤其是长期保存的质量，将样本保存于液氮的液相中为宜。■
, http://www.100md.com
基金羡慕：本课题为广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程课题
参考文献：
[1]Rubinstein E,Broxmeyer H E,Auerbach A D,et al.Hematopoietic reconstitution unrelated bone marrow in processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood.Proc Natl Acad Sci,1995,92:10119～10122
[2]裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血因子对脐血CD+34细胞的体外护增作用.中华血液学杂志，1996，17：304～307
[3]韩忠朝，冯四洲，韩明哲.造血干细胞移植及其应用.中华血液学杂志，1998，18：663～667
, 百拇医药
[4]Almici C,Carlo-Stella C,Wagner J E,et al.Clonogenic capacity and exvivo expoansion potyential of umbilical curd blood progenitor cells are not impaered by cryopreservation.BMT,1997,19:1079～1084
[5]Broxmeyer H E,Cooper X.High-efficiency recovery of immature haematopoietic progenitor cells with extensive proliferative capacity from human cord blood cryopreserved for 10 years.Clin Cxp Immunol,1997.107(Suppl 1):45～53
[6]范华骅，马庆，柏乃庆.骨髓、脐血、外周血干细胞-80℃保存研究.中国输血杂志，1998，11：8～9
(收稿日期：1999-08-24), http://www.100md.com