茶碱缓释片体内外试验的相关性
作者：蒋新国 江志强 张奇志 张 鹏 奚念朱
单位：蒋新国 江志强 张奇志 奚念朱 上海 上海医科大学药学院生物药剂学研究室；张 鹏 上海医科大学药学专业1997届毕业生
关键词：茶碱；缓释片；高效液相色谱法；体内外试验相关性
中国现代应用药学990210摘要 目的：评价茶碱缓释片的体外释放与体内吸收的相关性，为其质量控制提供实验依据。方法：用反相高效液相色谱法测定血浆中的茶碱浓度，按Wagner-Nelson公式计算一定时间内2种茶碱缓释片的体内吸收百分率。在3种不同pH的介质中进行体外释放度试验，计算相应时间内的累积释放百分率。结果：介质的pH变化对茶碱缓释片的体外释放度无明显影响。结论：茶碱缓释片的体内吸收百分率与体外释放百分率间存在良好的相关关系。
Evaluation of the correlation between in vitro release and in vivo absorption characteristics of theophylline sustained release tablets
, 百拇医药
Jiang Xinguo(Jiang XG),Jiang Zhiqiang(Jiang ZQ),Zhang Qizhi(Zhang QZ),et al(Division of Biopharmaceutics,School of Pharmacy,Shanghai Medical University,Shanghai 200032)
ABSTRACT OBJECTIVE：To evaluate the correlativity between in vitro release and in vivo absorption of theophylline sustained release tablets.METHOD:The theophylline concentration in human plasma was determined by a high performance liquid chromatography method.According to the Wagner-Nelson formula,the percentages of in vivo absorption of two theophylline sustained release tablets were calculated.In vitro release of theophylline in 3 mediums of different pH was tested and the accumulated release percentage was calculated.RESULTS:The variation of pH of mediums were no significant affect on in vitro release rate of theophylline.CONCLUSION:A good correlativity was showed between in vivo absorption and in vitro release of theophylline sustained release tablets.
, 百拇医药
KEY WORDS theophylline,sustained release tablet,high performance liquid chromatography,in vitro/in vivo correlativity
人体内的生物利用度试验是评估药物制剂质量的一种有效方法，但对生产而言，不可能对每批产品都进行体内评价，因此，选择一种适宜的体外释放度试验方法，建立良好的体内外相关关系，对于制剂，尤其是控、缓释制剂的生产及质量控制有重要意义。
本文用HPLC法测定了2种茶碱缓释片口服给药后的人体内血药浓度，并且在3种不同pH的介质中进行了体外释放度试验，评价了体内外试验的相关性，旨为茶碱缓释片的质量控制提供参考。
1 实验材料
1.1 仪器
, http://www.100md.com
Waters 481系列高效液相色谱仪(美国Waters公司);ZRS-4型溶出试验仪(天津大学无线电厂);752C型紫外可见分光光度计(上海分析仪器厂)。
1.2 药品和试剂
茶碱缓释片A(上海先灵葆雅制药有限公司，批号:CI6ER×MB03);茶碱缓释片B(美国先灵葆雅公司，批号:95J30-02)，每片均含茶碱400mg。茶碱标准品(美国先灵荷雅公司，含量99.8%)。甲醇为色谱纯，乙醚、盐酸等为分析纯。
2 方法和结果
2.1 体内药物吸收百分率测试
2.1.1 给药方案及血样采集：健康志愿者18名，男性。年龄21.7±0.6岁，身高172±5cm，体重63±6kg。肝肾功能及心电图正常。受试者随机分成2组，分别口服茶碱缓释片A或B 400mg。按拉丁方设计[1]，2周后交叉给药。给药前一天晚餐后开始禁食，第2天早上服药。服药后2h进统一早餐，中午给予低脂肪统一餐。试验期间禁烟、酒、茶及含上述成分的食品和饮料。受试前1周开始至实验结束禁服任何其它药物。给药前及给药后，1，2，4，6，8，10，13，16，24，28，32，37和48h取肘静脉血2ml,分离血浆，处理后进行HPLC测定。
, 百拇医药
2.1.2 血样预处理及HPLC测定：精密吸取血浆样品0.2ml,加内标溶液(0.2μg/ml对乙酰氨基酚)10μl,用2mol/L NH4Ac 0.1ml调节血样pH至中性，加无水乙醚8ml,旋涡混合器振摇2min,3000r/min离心5min,取醚层,45℃水浴中通氮气吹干，残留物用200μl流动相溶解，取25μl进行HPLC测定。测定条件:YWG-C18固定相，流动相为0.05mol/L NH4Ac-甲醇(75∶25,Vol/Vol),流速1.2ml/min。UV检测波长273nm,环境温度20±2℃。本方法测定的线性浓度范围为0.2～2μg/ml,线性方程:Y=0.0414+0.2184x,r=0.9995。线性范围内高中低3种浓度的回收率为100.58±1.66(n=15);日内测定数据的相对标准差RSD小于4.05%(n=5),日间的RSD小于5.00%(n=17)。空白血浆对测定没有干扰。
2.1.3 茶碱缓释片人体内的吸收百分率：2种茶碱缓释片口服给药后的药-时数据见表1，根据Wagner-Nelson公式[2]计算给药后不同时间点内的吸收百分率(F%)。
, 百拇医药
F%=[(CT+ke∫T0Cdt)/ke∫∞0Cdt]×100%
式中，CT为T时间的血药浓度，ke为消除速度常数，∫T0Cdt和∫∞0Cdt分别为0～T和0～∞时间内的药-时曲线下面积。2种缓释片1～13h内的吸收百分率见表1。
表1 茶碱缓释片的药-时数据及人体内吸收百分率(n=18) t(h)
缓释片A
缓释片B
CT
, http://www.100md.com
(μg/ml)
∫T0Cdt
CT+ke
∫T0Cdt
F(%)
CT
(μg/ml)
∫T0Cdt
CT+ke
∫T0Cdt
, http://www.100md.com
F(%)
1
1.11
0.56
1.15
9.69
0.83
0.42
0.86
8.55
2
1.84
2.04
, 百拇医药
2.00
16.81
1.59
1.63
1.70
16.90
4
2.63
6.51
3.13
26.30
2.53
5.75
, 百拇医药
2.90
28.83
6
2.91
12.05
3.84
32.28
3.04
11.32
3.77
37.48
8
3.32
, 百拇医药
18.28
4.73
39.75
3.44
17.80
4.59
45.63
10
3.62
25.22
5.57
46.81
3.79
, http://www.100md.com
25.03
5.41
53.78
13
4.57
37.51
7.47
62.77
4.49
37.45
6.91
68.69
16
, http://www.100md.com
4.81
51.58
4.68
51.21
24
4.47
88.70
4.18
86.65
28
3.65
104.94
3.50
, 百拇医药
102.01
32
2.79
117.82
2.61
114.23
37
1.82
129.35
1.86
125.41
48
0.79
, 百拇医药
143.71
0.95
140.87
ke=0.0773
ke∫∞0Cdt=11.90
ke=0.0647
ke∫∞0Cdt=10.06
2.2 体外药物释放度试验
按中国药典1995年版释放度测定法的浆法[3]进行试验。为了考察pH对茶碱缓释片释放度的影响，试验分别在3种系列的介质中进行。介质1：按药典中茶碱缓释片体外释放条件，以蒸馏水为介质；介质2：在开始的2h内以0.1mol/L HCl为介质,2h以后改用pH6.8的磷酸缓冲溶液为介质；介质3：模拟胃肠道pH的变化情况，以pH2.0的磷酸缓冲液为起始释放介质，随后每隔0.5h向介质中添加5mol/L的NaOH溶液1ml,使介质pH逐渐升高到7.2。介质3的pH经时变化曲线见图1。
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图1 释放介质3的pH经时变化曲线
释放介质总量1000ml,温度37±0.5℃，浆转速100r/min。同体内试验取血时间点取释放样品3ml,同时补充等量的新鲜介质。样品用0.8μm微孔滤膜过滤，取续滤液1ml,用蒸馏水稀释至适宜的浓度(稀释10～20倍)，于273nm处测定吸收值，根据标准曲线计算药物浓度，经校正后计算各时间点的累积释放百分率。紫外测定的线性浓度范围为1～20μg/ml,线性方程:c=18.69A-0.083,r=0.9999(n=3)。试验表明，由于样品均稀释10～20倍后测定，因此，介质的初始pH差异对紫外吸收值没有影响，3种介质中的样品可用同一条标准曲线进行计算。2种茶碱缓释片的累积释放百分率见表2。表2 茶碱缓释片体外累积释放百分率(n=12) t(h)
缓释片A
缓释片B
介质1
, 百拇医药
介质2
介质3
介质1
介质2
介质3
1
17.20
16.14
17.06
13.44
12.10
10.73
2
, 百拇医药
23.46
22.68
23.15
19.00
17.72
15.60
4
31.22
31.14
30.11
24.79
25.33
20.50
, 百拇医药
6
38.64
37.22
37.98
30.18
33.31
28.75
8
46.89
42.95
43.41
35.66
38.75
, http://www.100md.com
34.36
10
53.41
49.66
50.96
43.75
44.99
41.67
13
63.34
56.88
58.26
53.11
, http://www.100md.com
54.48
49.27
2.3 体内外试验的相关性
以t时间内体外累积释放百分率为自变量X，相应时间内的体内吸收百分率为应变量Y，用最小二乘法线性回归，得体内外相关性方程见表3。表3 体内外试验的相关关系 制 剂
介 质
回归方程
相关系数
A
1
Y=1.09X-9.24
0.9947
, 百拇医药
2
Y=1.24X-11.89
0.9911
3
Y=1.21X-11.59
0.9913
B
1
Y=1.50X-10.01
0.9959
2
Y=1.39X-7.88
, 百拇医药
0.9991
3
Y=1.48X-5.49
0.9948
根据相关系数临界值表，当置信系数α=0.01,自由度υ=7-2=5时，相关系数的临界值r1-0.01=0.874。表3中的相关系数均远大于0.874，表明2种茶碱缓释片的体内吸收百分率与3种不同pH介质中的释放百分率间均有良好的相关性(P<0.01)。因此，用简单的体外释放试验即可预测其体内药物吸收的大致情况及临床疗效。
3 讨 论
美国药典1995年第23版规定了控、缓释制剂体内外相关性的3种评价方法，本文采用了其中的一种。由于该法融入了体内外试验较多的实验数据，能够反映比较完整的体外释放情况和体内吸收情况，因此，可以比较客观地评价体内外的相关关系。这种关系的建立为茶碱缓释片的质量控制提供了实验依据。
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通常，介质pH对药物的体外释放有较大的影响，因此，评价体内外相关性时，需对不同pH的释放介质进行比较[4，5]，以评定缓释制剂处方的合理性及建立最佳的体外试验条件。本文试验的2种茶碱缓释片，其体外释放度受pH的影响较小，3种不同pH介质中的释放度无明显差异。其中以蒸馏水为介质时，实验操作最简便，相关系数相对来说也最好。因此，茶碱缓释片质量控制时可以选用蒸馏水作为释放介质。
参考文献
[1] 奚念朱主编.药物制剂的体内处置与合理用药.北京：中国医药科技出版社，1991∶177.
[2] Wagner JE,Nelson E.Percent absorbed time plots derived from blood level and/or urinary excretion date.J Pharm Sci,1963,52∶610.
, http://www.100md.com
[3] 中国药典.1995，附录66.
[4] 张霖泽，王兰勤,Navnit HS.口服控释制剂的质量评价.中国药学杂志，1995，30(6)∶366.
[5] Tandt LAGL,Stubbs C,Kanfer I.Level a in vitro/in vivo correlations:a quality control tool or bioequivalence predictro for extended release solid oral dosage forms.Drug Dev Ind Pharm,1995,21(8)∶889.
收稿日期：1998-03-05, 百拇医药
单位：蒋新国 江志强 张奇志 奚念朱 上海 上海医科大学药学院生物药剂学研究室；张 鹏 上海医科大学药学专业1997届毕业生
关键词：茶碱；缓释片；高效液相色谱法；体内外试验相关性
中国现代应用药学990210摘要 目的：评价茶碱缓释片的体外释放与体内吸收的相关性，为其质量控制提供实验依据。方法：用反相高效液相色谱法测定血浆中的茶碱浓度，按Wagner-Nelson公式计算一定时间内2种茶碱缓释片的体内吸收百分率。在3种不同pH的介质中进行体外释放度试验，计算相应时间内的累积释放百分率。结果：介质的pH变化对茶碱缓释片的体外释放度无明显影响。结论：茶碱缓释片的体内吸收百分率与体外释放百分率间存在良好的相关关系。
Evaluation of the correlation between in vitro release and in vivo absorption characteristics of theophylline sustained release tablets
, 百拇医药
Jiang Xinguo(Jiang XG),Jiang Zhiqiang(Jiang ZQ),Zhang Qizhi(Zhang QZ),et al(Division of Biopharmaceutics,School of Pharmacy,Shanghai Medical University,Shanghai 200032)
ABSTRACT OBJECTIVE：To evaluate the correlativity between in vitro release and in vivo absorption of theophylline sustained release tablets.METHOD:The theophylline concentration in human plasma was determined by a high performance liquid chromatography method.According to the Wagner-Nelson formula,the percentages of in vivo absorption of two theophylline sustained release tablets were calculated.In vitro release of theophylline in 3 mediums of different pH was tested and the accumulated release percentage was calculated.RESULTS:The variation of pH of mediums were no significant affect on in vitro release rate of theophylline.CONCLUSION:A good correlativity was showed between in vivo absorption and in vitro release of theophylline sustained release tablets.
, 百拇医药
KEY WORDS theophylline,sustained release tablet,high performance liquid chromatography,in vitro/in vivo correlativity
人体内的生物利用度试验是评估药物制剂质量的一种有效方法，但对生产而言，不可能对每批产品都进行体内评价，因此，选择一种适宜的体外释放度试验方法，建立良好的体内外相关关系，对于制剂，尤其是控、缓释制剂的生产及质量控制有重要意义。
本文用HPLC法测定了2种茶碱缓释片口服给药后的人体内血药浓度，并且在3种不同pH的介质中进行了体外释放度试验，评价了体内外试验的相关性，旨为茶碱缓释片的质量控制提供参考。
1 实验材料
1.1 仪器
, http://www.100md.com
Waters 481系列高效液相色谱仪(美国Waters公司);ZRS-4型溶出试验仪(天津大学无线电厂);752C型紫外可见分光光度计(上海分析仪器厂)。
1.2 药品和试剂
茶碱缓释片A(上海先灵葆雅制药有限公司，批号:CI6ER×MB03);茶碱缓释片B(美国先灵葆雅公司，批号:95J30-02)，每片均含茶碱400mg。茶碱标准品(美国先灵荷雅公司，含量99.8%)。甲醇为色谱纯，乙醚、盐酸等为分析纯。
2 方法和结果
2.1 体内药物吸收百分率测试
2.1.1 给药方案及血样采集：健康志愿者18名，男性。年龄21.7±0.6岁，身高172±5cm，体重63±6kg。肝肾功能及心电图正常。受试者随机分成2组，分别口服茶碱缓释片A或B 400mg。按拉丁方设计[1]，2周后交叉给药。给药前一天晚餐后开始禁食，第2天早上服药。服药后2h进统一早餐，中午给予低脂肪统一餐。试验期间禁烟、酒、茶及含上述成分的食品和饮料。受试前1周开始至实验结束禁服任何其它药物。给药前及给药后，1，2，4，6，8，10，13，16，24，28，32，37和48h取肘静脉血2ml,分离血浆，处理后进行HPLC测定。
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2.1.2 血样预处理及HPLC测定：精密吸取血浆样品0.2ml,加内标溶液(0.2μg/ml对乙酰氨基酚)10μl,用2mol/L NH4Ac 0.1ml调节血样pH至中性，加无水乙醚8ml,旋涡混合器振摇2min,3000r/min离心5min,取醚层,45℃水浴中通氮气吹干，残留物用200μl流动相溶解，取25μl进行HPLC测定。测定条件:YWG-C18固定相，流动相为0.05mol/L NH4Ac-甲醇(75∶25,Vol/Vol),流速1.2ml/min。UV检测波长273nm,环境温度20±2℃。本方法测定的线性浓度范围为0.2～2μg/ml,线性方程:Y=0.0414+0.2184x,r=0.9995。线性范围内高中低3种浓度的回收率为100.58±1.66(n=15);日内测定数据的相对标准差RSD小于4.05%(n=5),日间的RSD小于5.00%(n=17)。空白血浆对测定没有干扰。
2.1.3 茶碱缓释片人体内的吸收百分率：2种茶碱缓释片口服给药后的药-时数据见表1，根据Wagner-Nelson公式[2]计算给药后不同时间点内的吸收百分率(F%)。
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F%=[(CT+ke∫T0Cdt)/ke∫∞0Cdt]×100%
式中，CT为T时间的血药浓度，ke为消除速度常数，∫T0Cdt和∫∞0Cdt分别为0～T和0～∞时间内的药-时曲线下面积。2种缓释片1～13h内的吸收百分率见表1。
表1 茶碱缓释片的药-时数据及人体内吸收百分率(n=18) t(h)
缓释片A
缓释片B
CT
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(μg/ml)
∫T0Cdt
CT+ke
∫T0Cdt
F(%)
CT
(μg/ml)
∫T0Cdt
CT+ke
∫T0Cdt
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F(%)
1
1.11
0.56
1.15
9.69
0.83
0.42
0.86
8.55
2
1.84
2.04
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2.00
16.81
1.59
1.63
1.70
16.90
4
2.63
6.51
3.13
26.30
2.53
5.75
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2.90
28.83
6
2.91
12.05
3.84
32.28
3.04
11.32
3.77
37.48
8
3.32
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18.28
4.73
39.75
3.44
17.80
4.59
45.63
10
3.62
25.22
5.57
46.81
3.79
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25.03
5.41
53.78
13
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37.51
7.47
62.77
4.49
37.45
6.91
68.69
16
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4.81
51.58
4.68
51.21
24
4.47
88.70
4.18
86.65
28
3.65
104.94
3.50
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102.01
32
2.79
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2.61
114.23
37
1.82
129.35
1.86
125.41
48
0.79
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143.71
0.95
140.87
ke=0.0773
ke∫∞0Cdt=11.90
ke=0.0647
ke∫∞0Cdt=10.06
2.2 体外药物释放度试验
按中国药典1995年版释放度测定法的浆法[3]进行试验。为了考察pH对茶碱缓释片释放度的影响，试验分别在3种系列的介质中进行。介质1：按药典中茶碱缓释片体外释放条件，以蒸馏水为介质；介质2：在开始的2h内以0.1mol/L HCl为介质,2h以后改用pH6.8的磷酸缓冲溶液为介质；介质3：模拟胃肠道pH的变化情况，以pH2.0的磷酸缓冲液为起始释放介质，随后每隔0.5h向介质中添加5mol/L的NaOH溶液1ml,使介质pH逐渐升高到7.2。介质3的pH经时变化曲线见图1。
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图1 释放介质3的pH经时变化曲线
释放介质总量1000ml,温度37±0.5℃，浆转速100r/min。同体内试验取血时间点取释放样品3ml,同时补充等量的新鲜介质。样品用0.8μm微孔滤膜过滤，取续滤液1ml,用蒸馏水稀释至适宜的浓度(稀释10～20倍)，于273nm处测定吸收值，根据标准曲线计算药物浓度，经校正后计算各时间点的累积释放百分率。紫外测定的线性浓度范围为1～20μg/ml,线性方程:c=18.69A-0.083,r=0.9999(n=3)。试验表明，由于样品均稀释10～20倍后测定，因此，介质的初始pH差异对紫外吸收值没有影响，3种介质中的样品可用同一条标准曲线进行计算。2种茶碱缓释片的累积释放百分率见表2。表2 茶碱缓释片体外累积释放百分率(n=12) t(h)
缓释片A
缓释片B
介质1
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介质2
介质3
介质1
介质2
介质3
1
17.20
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17.06
13.44
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2
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15.60
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25.33
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6
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30.18
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42.95
43.41
35.66
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50.96
43.75
44.99
41.67
13
63.34
56.88
58.26
53.11
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49.27
2.3 体内外试验的相关性
以t时间内体外累积释放百分率为自变量X，相应时间内的体内吸收百分率为应变量Y，用最小二乘法线性回归，得体内外相关性方程见表3。表3 体内外试验的相关关系 制 剂
介 质
回归方程
相关系数
A
1
Y=1.09X-9.24
0.9947
, 百拇医药
2
Y=1.24X-11.89
0.9911
3
Y=1.21X-11.59
0.9913
B
1
Y=1.50X-10.01
0.9959
2
Y=1.39X-7.88
, 百拇医药
0.9991
3
Y=1.48X-5.49
0.9948
根据相关系数临界值表，当置信系数α=0.01,自由度υ=7-2=5时，相关系数的临界值r1-0.01=0.874。表3中的相关系数均远大于0.874，表明2种茶碱缓释片的体内吸收百分率与3种不同pH介质中的释放百分率间均有良好的相关性(P<0.01)。因此，用简单的体外释放试验即可预测其体内药物吸收的大致情况及临床疗效。
3 讨 论
美国药典1995年第23版规定了控、缓释制剂体内外相关性的3种评价方法，本文采用了其中的一种。由于该法融入了体内外试验较多的实验数据，能够反映比较完整的体外释放情况和体内吸收情况，因此，可以比较客观地评价体内外的相关关系。这种关系的建立为茶碱缓释片的质量控制提供了实验依据。
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通常，介质pH对药物的体外释放有较大的影响，因此，评价体内外相关性时，需对不同pH的释放介质进行比较[4，5]，以评定缓释制剂处方的合理性及建立最佳的体外试验条件。本文试验的2种茶碱缓释片，其体外释放度受pH的影响较小，3种不同pH介质中的释放度无明显差异。其中以蒸馏水为介质时，实验操作最简便，相关系数相对来说也最好。因此，茶碱缓释片质量控制时可以选用蒸馏水作为释放介质。
参考文献
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收稿日期：1998-03-05, 百拇医药