成骨细胞培养用于防治骨质疏松症新药的筛选
作者：邓 力 郑 虎 翁玲玲
单位：(华西医科大学药学院,成都 610041)
关键词：成骨细胞；骨质疏松症；新药；筛选
中国新药杂志990608
摘要 目的：寻找最适合的用于防治骨质疏松症新药筛选的成骨细胞系。方法：采用不同来源组织培养成骨细胞，分别加入已知对成骨细胞有促骨形成作用的地塞米松和氢化可的松，通过Von Kossa染色，定量表示出骨形成，比较不同组织培养的成骨细胞用于药物筛选的优点和缺点。结果：MC3T3-E1细胞最易获得，其次是大鼠胎儿成骨细胞；小鼠成骨细胞培养周期长，成活率低；大鼠大腿骨成骨细胞稳定性不好，培养方法还不成熟；成熟大鼠成骨细胞培养方法成熟。结论：成熟大鼠成骨细胞是用于骨质疏松症相关的骨形成研究和其药物筛选最适宜的成骨细胞系。
, 百拇医药
CULTURE OF OSTEOBLAST FOR SIFTING NEW DRUG IN PREVENTION
AND CURE OF OSTEOPOROSIS
Deng Li,Zheng Hu,Weng Lingling
(West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
ABSTRACT OBJECTIVE：To explore the most suitable clone of osteoblast for sifting new drugin prevention and cure of osteoporosis.METHODS:Dexamethasone and hydrocortisone,agents of well-known osteogenic action,were added to osteoblast cultured from different sources,then stained with Von Kossa and their advantage and disadvantage were quantitatively shown through comparison with blank.RESULTS:MC3T3-E is the osteoblast of most easily to obtain,next is the one cultured from foetus of rat.Osteoblast of mouse has a long period of culture and low survival rate;osteoblast from thigh of rats has low stability with premature method of culture.Osteoblast from adult rats is stable with a mature method of culture.CONCLUSION:The most suitable osteoblast for research in osteogenesis and sifting drug for prevention of osteoporosis is the one cultured from adult rats.
, 百拇医药
KEY WORDS Osteoblast;Osteoporosis;New drug;Drug screening
在骨形成过程中首先要分泌胶原，然后在胶原上形成架桥，最后磷酸钙沉着(钙化)，显微镜下可以看到这些钙化的地方，由于不透光而发黑，通过Von Kossa染色[1]，骨形成情况可定量地表示出，与空白比较，就能区分促骨形成和未促骨形成化合物而达筛选目的。可见建立适宜的成骨细胞系是进行筛选的第一步。本研究将对不同来源的成骨细胞培养方法和其用于筛选的优点和缺点进行比较，找出最适合的用于防治骨质疏松症新药筛选的细胞系。
材料与方法
1 材料
wistar大鼠 雌性(淘汰种鼠)，wistar大鼠胎仔，DDY小鼠均由华西医科大学实验动物中心提供。MC3T3-E1，由第四军医大学杨连甲教授惠赠。
, http://www.100md.com
2 试剂
Ham F-12，α-MEM，HEPES，PBS(Phosphate Buffered Salts)，及胎牛血清均为Gibco产品；I型胶原酶、透明质酸酶、β-甘油磷酸钠、地塞米松(Dex)、氢化可的松(COR)为Sigma产品。
3 方法
分别选用成熟大鼠(Adult Rat)[1]头盖骨(AOB)、大鼠胎儿(Fetal)头盖骨(FOB)[1]、大鼠大腿骨[2](Bone Marrow，BMOB)、小鼠头盖骨[3](MOB)，按照文献[1～3]所报道的方法分离培养AOB，FOB，BMOB，MOB成骨细胞，培养获得的这些成骨细胞以及株化的成骨样细胞MC3T3-E1[3]经0.25%胰蛋白酶消化后，离心收集，分别按一定的密度接种到24孔板中，次日加入10-7mol/L浓度的Dex和COR[4,6]，同时设不加药物空白组，连续加药3d，d4停止加药，并在培养液中加入β-甘油磷酸钠和抗坏血酸，于36.5℃～37℃，饱和湿度及5%CO2条件中培养，隔天换一次培养液，直到染色为止。经过Von Kossa染色后，被染色成茶褐色的骨结节量利用生物图象解析仪可以定量地表示出，作为骨形成指标。通过此比较各来源成骨细胞AOB，FOB，BMOB，MOB及MC3T3-E1用于观察添加物促骨形成作用，并找出最适宜的细胞系。
, 百拇医药
结 果
1 不同来源成骨细胞培养情况
见表1。MC3T3-E1最易获得，其次是FOB，其培养周期短，方法成熟；MOB贴壁慢，培养周期长，最难培养；BMOB培养方法还不成熟、细胞状态不稳定，AOB细胞状态稳定，方法基本成熟。
表1 不同来源成骨细胞培养情况
细胞来源
AOB
FOB
MOB
MC3T3-E1
BMOB
, 百拇医药
酶及浓度
0.1%胶原酶
0.1%透明质酸酶
0.1%胶原酶
0.25%胰蛋白酶
0.25%胰蛋白酶
0.2%胶原酶
0.25%胰蛋白酶
细胞贴壁时间(h)
≥8
2
≥24
, http://www.100md.com
2
36
培养液
10%FBS F-12
10%FBS F-12
10%FBS α-MEM
5%～10%FBS
10%FBS α-MEM
F-12
DMEM
F-12 激素
更换培养液时间(h)
, http://www.100md.com
24
12
48
72
48
培养到传代所需时间(d)
8
2
11
9
9
接种密度(个/cm2)
4 000
, http://www.100md.com
2 000
2 000～3 000
2 000
3 000～5 000
接种后到染色所需时间(d)
14～20
8～14
20
10
14
细胞状态的稳定性
70
, http://www.100md.com 90
40
100
25
a：以MC3T3-E1为100计2 Dex，COR在AOB，FOB及MC3T3-E系中骨形成情况
见图1～3。Dex，COR在AOB，FOB及MC3T3-E1系中均表现有促骨形成作用，且该作用Dex强于COR。
图1 地塞米松、氢化可的松对AOB的骨形成影响
图2 地塞米松、氢化可的松对FOB的骨形成影响
, 百拇医药
图3 地塞米松、氢化可的松对MC3T3-E1的骨形成影响
3 Von kossa染色
培养获得的AOB，FOB，BMOB和MOB细胞经Von kossa染色，结果见图4，钙化部分呈紫褐色。碱性磷酸酶观察染色胞体呈红色，证实培养的成骨细胞具有碱性磷酸酶活性，符合成骨细胞重要生物学特征之一。
图4 AOB经Von Kossa染色的显微镜照片
讨 论
1 由于动物头盖骨分离细胞中含有骨生成细胞、未分化间充质细胞和鳞片形细胞三种成骨细胞样细胞，为活体外骨形成(钙化组织)提供了相应的三维结构[1]。因此成骨细胞分离培养多取材于头盖骨。
, http://www.100md.com
2 Dex，COR已被证实有明显的促骨形成作用[4]。实验中添加Dex和COR，目的是为了确认细胞状态是否有问题，同时比较何种来源培养的成骨细胞观察骨形成更适宜，以及检验这种观察骨形成的方法是否可行。实验证实在这些成骨细胞中添加Dex促骨形成作用强于添加COR。而这种可将化合物促骨形成作用强弱区分开的方法，正是进行药物筛选的依据。
3 原代细胞培养中，由于组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有的二倍体遗传性在一定程度上能反映体内状态，因此原代培养系用于筛选药物是最佳实验系列。从这一角度看采用MC3T3-E1成骨细胞系就不如其他几种来源培养的成骨细胞系。虽然也是原代培养，但实际中发现该细胞能不断继代，说明该细胞与增殖有关的基因处于活化状态，所以它与MC3T3-E1细胞类似。另一方面，这两种细胞由于可以不断增殖，而能随时解决所需，因此特定条件下使用这种细胞进行筛选实验也能达到设计目标。FOB的培养方法早在10多年前就建立，方法成熟，培养周期短，相对而言细胞容易获得，适用于大量药物的筛选。但由于所筛选的药物主要是用于老龄或由闭经引起的骨质疏松症的防治，其实验体系就不如用AOB系适合。BMOB培养系是从骨质疏松的发症部位角度去考虑其实际意义的，但该系培养方法难度大，实验体系还不稳定，利用受到一定限制。
, 百拇医药
综上所述，AOB系是目前进行与骨质疏松症相关的骨形成研究和药物筛选的最适合实验系。另一方面由于药物参与的骨代谢过程是由成骨细胞和破骨细胞相互作用维持的，所以建立成骨细胞和破骨细胞共存的细胞系才是最接近骨形成体系的实验系，这将是进一步研究的目标。
参考文献
1 Kato H. Decreased mitogenic and osteogenic responsiveness of calvarial osteoblasts isolated from aged rats to basic fibroblast growth factor.Gerontology,1995,41(Suppl 1)∶S20
2 Qu Q，Perl-hieape M,Kapanen A,et al.Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture.Bone,1998,22(3)∶201
, 百拇医药
3 Choi Je yong,Lee Byung-heon,Song Keun-bae，et al.Expression patterns of bone-related proteins during osteoblastic differentiation in MC3T3-E1 cells.J cell Biochem,1996,61(7)∶609
4 Bellows CG, Aubin JE, Heersche NM. Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria cell population .Calcif Tissue Int, 1986,38(2)∶143
5 加藤博明，桐生道明，松尾律子，等.Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria cell populations.日本骨代谢学会杂志，1994,12(3)∶244
6 鄂征.组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社，1995.202～206
(收稿：1999-03-18 修回：1999-04-23), 百拇医药
单位：(华西医科大学药学院,成都 610041)
关键词：成骨细胞；骨质疏松症；新药；筛选
中国新药杂志990608
摘要 目的：寻找最适合的用于防治骨质疏松症新药筛选的成骨细胞系。方法：采用不同来源组织培养成骨细胞，分别加入已知对成骨细胞有促骨形成作用的地塞米松和氢化可的松，通过Von Kossa染色，定量表示出骨形成，比较不同组织培养的成骨细胞用于药物筛选的优点和缺点。结果：MC3T3-E1细胞最易获得，其次是大鼠胎儿成骨细胞；小鼠成骨细胞培养周期长，成活率低；大鼠大腿骨成骨细胞稳定性不好，培养方法还不成熟；成熟大鼠成骨细胞培养方法成熟。结论：成熟大鼠成骨细胞是用于骨质疏松症相关的骨形成研究和其药物筛选最适宜的成骨细胞系。
, 百拇医药
CULTURE OF OSTEOBLAST FOR SIFTING NEW DRUG IN PREVENTION
AND CURE OF OSTEOPOROSIS
Deng Li,Zheng Hu,Weng Lingling
(West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
ABSTRACT OBJECTIVE：To explore the most suitable clone of osteoblast for sifting new drugin prevention and cure of osteoporosis.METHODS:Dexamethasone and hydrocortisone,agents of well-known osteogenic action,were added to osteoblast cultured from different sources,then stained with Von Kossa and their advantage and disadvantage were quantitatively shown through comparison with blank.RESULTS:MC3T3-E is the osteoblast of most easily to obtain,next is the one cultured from foetus of rat.Osteoblast of mouse has a long period of culture and low survival rate;osteoblast from thigh of rats has low stability with premature method of culture.Osteoblast from adult rats is stable with a mature method of culture.CONCLUSION:The most suitable osteoblast for research in osteogenesis and sifting drug for prevention of osteoporosis is the one cultured from adult rats.
, 百拇医药
KEY WORDS Osteoblast;Osteoporosis;New drug;Drug screening
在骨形成过程中首先要分泌胶原，然后在胶原上形成架桥，最后磷酸钙沉着(钙化)，显微镜下可以看到这些钙化的地方，由于不透光而发黑，通过Von Kossa染色[1]，骨形成情况可定量地表示出，与空白比较，就能区分促骨形成和未促骨形成化合物而达筛选目的。可见建立适宜的成骨细胞系是进行筛选的第一步。本研究将对不同来源的成骨细胞培养方法和其用于筛选的优点和缺点进行比较，找出最适合的用于防治骨质疏松症新药筛选的细胞系。
材料与方法
1 材料
wistar大鼠 雌性(淘汰种鼠)，wistar大鼠胎仔，DDY小鼠均由华西医科大学实验动物中心提供。MC3T3-E1，由第四军医大学杨连甲教授惠赠。
, http://www.100md.com
2 试剂
Ham F-12，α-MEM，HEPES，PBS(Phosphate Buffered Salts)，及胎牛血清均为Gibco产品；I型胶原酶、透明质酸酶、β-甘油磷酸钠、地塞米松(Dex)、氢化可的松(COR)为Sigma产品。
3 方法
分别选用成熟大鼠(Adult Rat)[1]头盖骨(AOB)、大鼠胎儿(Fetal)头盖骨(FOB)[1]、大鼠大腿骨[2](Bone Marrow，BMOB)、小鼠头盖骨[3](MOB)，按照文献[1～3]所报道的方法分离培养AOB，FOB，BMOB，MOB成骨细胞，培养获得的这些成骨细胞以及株化的成骨样细胞MC3T3-E1[3]经0.25%胰蛋白酶消化后，离心收集，分别按一定的密度接种到24孔板中，次日加入10-7mol/L浓度的Dex和COR[4,6]，同时设不加药物空白组，连续加药3d，d4停止加药，并在培养液中加入β-甘油磷酸钠和抗坏血酸，于36.5℃～37℃，饱和湿度及5%CO2条件中培养，隔天换一次培养液，直到染色为止。经过Von Kossa染色后，被染色成茶褐色的骨结节量利用生物图象解析仪可以定量地表示出，作为骨形成指标。通过此比较各来源成骨细胞AOB，FOB，BMOB，MOB及MC3T3-E1用于观察添加物促骨形成作用，并找出最适宜的细胞系。
, 百拇医药
结 果
1 不同来源成骨细胞培养情况
见表1。MC3T3-E1最易获得，其次是FOB，其培养周期短，方法成熟；MOB贴壁慢，培养周期长，最难培养；BMOB培养方法还不成熟、细胞状态不稳定，AOB细胞状态稳定，方法基本成熟。
表1 不同来源成骨细胞培养情况
细胞来源
AOB
FOB
MOB
MC3T3-E1
BMOB
, 百拇医药
酶及浓度
0.1%胶原酶
0.1%透明质酸酶
0.1%胶原酶
0.25%胰蛋白酶
0.25%胰蛋白酶
0.2%胶原酶
0.25%胰蛋白酶
细胞贴壁时间(h)
≥8
2
≥24
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2
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培养液
10%FBS F-12
10%FBS F-12
10%FBS α-MEM
5%～10%FBS
10%FBS α-MEM
F-12
DMEM
F-12 激素
更换培养液时间(h)
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24
12
48
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培养到传代所需时间(d)
8
2
11
9
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接种密度(个/cm2)
4 000
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2 000
2 000～3 000
2 000
3 000～5 000
接种后到染色所需时间(d)
14～20
8～14
20
10
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细胞状态的稳定性
70
, http://www.100md.com 90
40
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a：以MC3T3-E1为100计2 Dex，COR在AOB，FOB及MC3T3-E系中骨形成情况
见图1～3。Dex，COR在AOB，FOB及MC3T3-E1系中均表现有促骨形成作用，且该作用Dex强于COR。
图1 地塞米松、氢化可的松对AOB的骨形成影响
图2 地塞米松、氢化可的松对FOB的骨形成影响
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图3 地塞米松、氢化可的松对MC3T3-E1的骨形成影响
3 Von kossa染色
培养获得的AOB，FOB，BMOB和MOB细胞经Von kossa染色，结果见图4，钙化部分呈紫褐色。碱性磷酸酶观察染色胞体呈红色，证实培养的成骨细胞具有碱性磷酸酶活性，符合成骨细胞重要生物学特征之一。
图4 AOB经Von Kossa染色的显微镜照片
讨 论
1 由于动物头盖骨分离细胞中含有骨生成细胞、未分化间充质细胞和鳞片形细胞三种成骨细胞样细胞，为活体外骨形成(钙化组织)提供了相应的三维结构[1]。因此成骨细胞分离培养多取材于头盖骨。
, http://www.100md.com
2 Dex，COR已被证实有明显的促骨形成作用[4]。实验中添加Dex和COR，目的是为了确认细胞状态是否有问题，同时比较何种来源培养的成骨细胞观察骨形成更适宜，以及检验这种观察骨形成的方法是否可行。实验证实在这些成骨细胞中添加Dex促骨形成作用强于添加COR。而这种可将化合物促骨形成作用强弱区分开的方法，正是进行药物筛选的依据。
3 原代细胞培养中，由于组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有的二倍体遗传性在一定程度上能反映体内状态，因此原代培养系用于筛选药物是最佳实验系列。从这一角度看采用MC3T3-E1成骨细胞系就不如其他几种来源培养的成骨细胞系。虽然也是原代培养，但实际中发现该细胞能不断继代，说明该细胞与增殖有关的基因处于活化状态，所以它与MC3T3-E1细胞类似。另一方面，这两种细胞由于可以不断增殖，而能随时解决所需，因此特定条件下使用这种细胞进行筛选实验也能达到设计目标。FOB的培养方法早在10多年前就建立，方法成熟，培养周期短，相对而言细胞容易获得，适用于大量药物的筛选。但由于所筛选的药物主要是用于老龄或由闭经引起的骨质疏松症的防治，其实验体系就不如用AOB系适合。BMOB培养系是从骨质疏松的发症部位角度去考虑其实际意义的，但该系培养方法难度大，实验体系还不稳定，利用受到一定限制。
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综上所述，AOB系是目前进行与骨质疏松症相关的骨形成研究和药物筛选的最适合实验系。另一方面由于药物参与的骨代谢过程是由成骨细胞和破骨细胞相互作用维持的，所以建立成骨细胞和破骨细胞共存的细胞系才是最接近骨形成体系的实验系，这将是进一步研究的目标。
参考文献
1 Kato H. Decreased mitogenic and osteogenic responsiveness of calvarial osteoblasts isolated from aged rats to basic fibroblast growth factor.Gerontology,1995,41(Suppl 1)∶S20
2 Qu Q，Perl-hieape M,Kapanen A,et al.Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture.Bone,1998,22(3)∶201
, 百拇医药
3 Choi Je yong,Lee Byung-heon,Song Keun-bae，et al.Expression patterns of bone-related proteins during osteoblastic differentiation in MC3T3-E1 cells.J cell Biochem,1996,61(7)∶609
4 Bellows CG, Aubin JE, Heersche NM. Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria cell population .Calcif Tissue Int, 1986,38(2)∶143
5 加藤博明，桐生道明，松尾律子，等.Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria cell populations.日本骨代谢学会杂志，1994,12(3)∶244
6 鄂征.组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社，1995.202～206
(收稿：1999-03-18 修回：1999-04-23), 百拇医药