背根神经节组织中GAP-43基因克隆
作者：刘梅 刘炎 姚登兵 顾晓松
单位：刘梅(南通医学院生物学教研室)；刘炎 姚登兵 顾晓松(交通部分子神经生物学重点实验室，南通226001)
关键词：生长相关蛋白43；基因克隆；背根神经节
南通医学院学院000401 [摘 要] 目的：克隆新生大鼠背根神经节组织中生长相关蛋白-43(GAP-43)基因。方法：采用RT-PCR法，从新生大鼠背根神经节组织mRNA中扩增GAP-43基因CDS区片段，克隆入T载体，并经序列测定。结果：RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度778bp相符，T载体克隆测序与GAP-43基因100%同源。结论：采用RT-PCR和T载体技术获得了新生大鼠背根神经节组织中的GAP-43基因克隆。
[中图分类号] R329.33 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号]1000-2057(2000)04-0323-03
GENE CLONING OF GAP-43 FROM RAT DORSAL ROOT GANGLIA
LIU Mei
(Department of Biology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
LIU Yan,YAO Dengbing,et al
(Key Laboratory of Molecular Neurobiology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: To obtain the gene cloning of GAP-43 from rat dorsal root ganglia(DRG).Methods: The CDS of GAP-43 was amplified by RT-PCR from rat DRG, and then was ligated into pGEM-T vector. The DNA sequence was detected.Results: The product of RT-PCR was the 778bp which matched the size of purpose. The sequence of GAP-43 was completely homogeneous with the GAP-43 sequence reported.Conclusions: GAP-43 gene had been cloned from rat DRG using RT-PCR and T vector techniques.
, 百拇医药
[Key words] GAP-43;Gene cloning;dorsal root ganglia(DRG)
生长相关蛋白43(Growth associated protein 43,GAP-43)是神经元特异性磷蛋白，被认为是神经元生长发育和可塑性的分子标记物[1]。近年来的研究表明GAP-43与神经系统的发育、突触形成和可塑性以及神经再生有密切关系，在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用，因此受到普遍重视，对它的研究也日益活跃[2，3]。本实验采用RT-PCR法，从新生大鼠背根神经节组织mRNA中扩增出GAP-43基因CDS区片段，克隆入T载体，并经测序证实，以期为进一步研究GAP-43 及其mRNA 的表达提供基础。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂 健康新生SD鼠。由南通医学院实验动物中心提供。Trizol试剂、第一链cDNA合成试剂盒(OmniscriptTM RT Kit)购自Qiagen公司，测序试剂盒(T7SequenceTMKit)购自Pharmacia Biotech 公司， pGEMR ○-T Easy Vector Systems、X-gal、IPTG购自Promega公司， Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ等常用试剂购自上海试剂公司。
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1.2 引物合成 根据GAP-43基因序列设计包括全部CDS区上游引物P1在26～45位点:5' AGGAAAGGAGAGAAGG CAGG 3'，下游引物P2在803～784位点:5' GCAGGAGAGACAGGGTTCA
G， 同时在CDS区内部设计一对巢式引物，上游N-P1:5' AAGATGGTGTCAAACCGGAGG 3'，下游N-P2:5' GCATCGGTAGTAGCAGAGCC3'，均由中科院上海植物生理研究所(植生所)Beckman示范实验室合成，预计扩增片段长度分别为778bp和207bp。
1.3 总RNA制备 新生大鼠背根神经节组织50mg，Trizol试剂提取总RNA，甲醛变性胶电泳检测其完整性。采用紫外分光光度计，测定OD260及OD280值,计算RNA含量。
1.4 逆转录反应 反应在PTC-100型热循环仪(MJ公司)上按Kit操作步骤进行：在 0.5ml Eppendorf管，加入总RNA 2μg，10μmol/L Oligo(dT)12～182μl，10×逆转录buffer 2μl，5mmol/L dNTPmix 2μl， 逆转录酶1μl(4U)，加入DEPC-treated H2O至20μl，轻混匀，稍离心，置37℃1h。93℃5min灭活酶，产物-20℃保存。
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1.5 PCR扩增 在冰上依次加入ddH2O 18μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPmix(each 2mmol/L)1μl，GAP-43上下游引物P1、P2(10μmol/L)各1μl，cDNA1μl，Taq polymerase0.5μl(1U)。轻混匀，稍离心，预热热循环仪至80℃，将PCR扩增管迅速移至热循环仪上，执行以下程序：94℃预变性3min，94℃60s，58℃60s，72℃60s，循环32次后在72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 巢式PCR扩增 取PCR扩增产物2μl，以TE作500倍稀释，行巢式PCR扩增。在冰上依次加入ddH2O 18μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPmix(2mmol/L)1μl，GAP-43巢式上下游引物N-P1、N-P2(10μmol/L)各1μl，稀释PCR产物1μl，Taq polymerase 0.5μl(1U)。轻混匀，稍离心，预热热循环仪至80℃，将PCR扩增管迅速移至热循环仪上，执行以下程序：94℃预变性3min，94℃40s，58℃30s，72℃30s，循环30次后在72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。
, 百拇医药
1.7 PCR产物的克隆 采用胶回收Kit(Qiagen公司)，胶上回收P1、P2扩增产物条带。将回收扩增片段3μl(约100ng)与T载体连接，即TA克隆 。按kit protocol操作，14℃连接12～16h。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，涂于含X-gal 和IPTG 并具Amp抗性的1.5%琼脂平皿上。37℃倒置培养12～16h，见蓝白斑。
1.8 克隆鉴定和序列测定 挑取白斑置LB(Amp+)培养基中扩增。小量碱法抽提质粒DNA，EcoRI酶切鉴定。将酶切片段长度符合插入片段长度的质粒进行纯化(小量质粒纯化Kit，Promega公司)、Sequence Kit序列测定，放射自显影，读片，送GenBank检索。该克隆(EasyT-GAP-43)以20%甘油菌保种于-20℃。
2 结 果
2.1 总RNA的检测 经甲醛变性胶电泳、EB染色，28S和18S条带清晰可见，5S条带隐约可见，提示RNA未降解。OD260/OD280为1.88，说明RNA纯度满意。
, 百拇医药
2.2 RT-PCR结果 样品见一特异扩增带，位于DNA Marker 750bp与1000bp之间，大小与预期结果相符，阴性对照未见扩增带(图1)。
2.3 巢式PCR验证结果 扩增出一特异条带，位于DNA Marker 100bp与250bp之间，与预期长度相符(图2)。
2.4 PCR产物克隆与序列测定 PCR产物经T载体直接克隆，转化，蓝白斑筛选。质粒酶切鉴定，与插入片段长度相符后(图3)，T7 Sequence Kit序列测定，放射自显影，读片得193bp,GenBank检索，与GAP-43基因100%同源。其全长序列测定由中科院上海植生所Beckman示范实验室完成(图4)。
图1 RT-PCR结果
M:标准分子量DNA (DL-2000)；1:PCR阴性对照；2:GAP-43(箭头所示为778bp)
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图2 巢式PCR结果
M:标准分子量DNA (DL-2000)；1:GAP-43 扩增片段 (箭头所示为207bp)；2:PCR阴性对照
图3 重组GAP-43 质粒EcoRⅠ酶切结果
M:标准分子量DNA (DL-2000)；1:空载体(Easy T 长度3.018kb)；2-3:重组质粒Easy T-GAP-43
(箭头所示778bp为插入片段)
图4 重组GAP-43质粒自动测序结果
, 百拇医药 3 讨 论
Karns,L.R.等[4]在GenBank登录的GAP-43 mRNA全长1153bp，其中5'非翻译区1～69，CDS区70～750，后接3'非翻译区751～1153，为226个氨基酸组成分子量24kDa的肽链。从其氨基酸组成来看，GAP-43含酸性氨基酸较多(占25%)，疏水氨基酸极少，它是一种具有高度亲水性的蛋白质，缺乏膜结合位点,然而却以可溶性和膜结合的形式存在。GAP-43在其氨基末端有一个由10个氨基酸组成的疏水区，由本身的外显子编码，这部分有两个功能，即膜结合和G蛋白反应。GAP-43是一种特异性地与神经细胞生长、发育、再生过程相关的蛋白质，在中枢神经系统发育过程中有较高水平的表达，尤其在生长锥处浓度很高[5]，因而被认为参与了轴突的生长和突触的形成。一般认为，成年的外周神经系统中GAP-43表达水平很低，但是当外周神经损伤后其表达明显增高[6]。GAP-43高表达是神经再生的典型特征，在轴突重建过程中，新生发芽末梢中GAP-43含量非常高，只要突触重建进行，即使无轴突延伸，GAP-43的表达也会在高水平进行。而一旦重建完成，GAP-43及其mRNA含量便骤然下降，甚至消失[7]。因此，在神经再生过程中，对GAP-43及其mRNA的研究显得尤为重要。
, 百拇医药
我们按照基因序列，在GAP-43基因CDS区两端用Primer3软件设计PCR引物，采用RT-PCR法，从新生大鼠背根神经节组织mRNA中扩增出GAP-43基因片段。为了保证PCR产物序列的正确性，同时在CDS区内部设计了一对巢式引物，用以对第一次扩增产物进行验证。在结果正确后运用T载体克隆技术克隆了它的CDS区，手工测序及自动测序结果与其报道一致。本实验为进一步研究GAP-43及其mRNA的表达和调控提供了基础。
交通部通达计划资助项目(编号 95-05-04-16)
[参考文献]
[1] 杨 辉.GAP-43表达与神经生长可塑性的关系[J].国外医学生理、病理科学与临床分册，1995，15(2)∶117.
[2] Benowitz, Routtenberg A. GAP-43 an intrintsic determinant of neuronal development and plasticity[J].Trends Neurosci, 1997,20∶84.
, 百拇医药
[3] Mason MR, Campbell G, Caroni P, et al. Overexpression of GAP-43 in thalamic projection neurons of transgenic does not enable them to regenerate axons through peripheral nerve graft[J].Exp Neurol,2000，165(1)∶143.
[4] Karns LR,Ng SC, Freeman JA and Fishman MC. Cloning of complementary DNA for GAP-43, a neuronal growth-related protein[J].Science, 1987， 236∶597.
[5] Skene JHP, Jacobson RD, Snipe GJ, et al. A protein induced during nerve growth (GAP-43) is a major component of growth cone membranes[J].Science,1986，233∶783.
[6] Verhaagen J, Qestreicher AB, Edwards PM, et al. Light and electronmicroscopical study of phosphoprotein B-50 following denervation and reinnervation of the rat soleus muscle[J].J Neurosci, 1988，8∶1759.
[7] 许 建，李起鸿.生长相关蛋白-43与周围神经损伤及再生[J].中华创伤杂志，1999，15(5)∶391.
(收稿日期：2000-09-01), 百拇医药
单位：刘梅(南通医学院生物学教研室)；刘炎 姚登兵 顾晓松(交通部分子神经生物学重点实验室，南通226001)
关键词：生长相关蛋白43；基因克隆；背根神经节
南通医学院学院000401 [摘 要] 目的：克隆新生大鼠背根神经节组织中生长相关蛋白-43(GAP-43)基因。方法：采用RT-PCR法，从新生大鼠背根神经节组织mRNA中扩增GAP-43基因CDS区片段，克隆入T载体，并经序列测定。结果：RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度778bp相符，T载体克隆测序与GAP-43基因100%同源。结论：采用RT-PCR和T载体技术获得了新生大鼠背根神经节组织中的GAP-43基因克隆。
[中图分类号] R329.33 [文献标识码] A
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[文章编号]1000-2057(2000)04-0323-03
GENE CLONING OF GAP-43 FROM RAT DORSAL ROOT GANGLIA
LIU Mei
(Department of Biology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
LIU Yan,YAO Dengbing,et al
(Key Laboratory of Molecular Neurobiology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: To obtain the gene cloning of GAP-43 from rat dorsal root ganglia(DRG).Methods: The CDS of GAP-43 was amplified by RT-PCR from rat DRG, and then was ligated into pGEM-T vector. The DNA sequence was detected.Results: The product of RT-PCR was the 778bp which matched the size of purpose. The sequence of GAP-43 was completely homogeneous with the GAP-43 sequence reported.Conclusions: GAP-43 gene had been cloned from rat DRG using RT-PCR and T vector techniques.
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[Key words] GAP-43;Gene cloning;dorsal root ganglia(DRG)
生长相关蛋白43(Growth associated protein 43,GAP-43)是神经元特异性磷蛋白，被认为是神经元生长发育和可塑性的分子标记物[1]。近年来的研究表明GAP-43与神经系统的发育、突触形成和可塑性以及神经再生有密切关系，在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用，因此受到普遍重视，对它的研究也日益活跃[2，3]。本实验采用RT-PCR法，从新生大鼠背根神经节组织mRNA中扩增出GAP-43基因CDS区片段，克隆入T载体，并经测序证实，以期为进一步研究GAP-43 及其mRNA 的表达提供基础。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂 健康新生SD鼠。由南通医学院实验动物中心提供。Trizol试剂、第一链cDNA合成试剂盒(OmniscriptTM RT Kit)购自Qiagen公司，测序试剂盒(T7SequenceTMKit)购自Pharmacia Biotech 公司， pGEMR ○-T Easy Vector Systems、X-gal、IPTG购自Promega公司， Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ等常用试剂购自上海试剂公司。
, http://www.100md.com
1.2 引物合成 根据GAP-43基因序列设计包括全部CDS区上游引物P1在26～45位点:5' AGGAAAGGAGAGAAGG CAGG 3'，下游引物P2在803～784位点:5' GCAGGAGAGACAGGGTTCA
G， 同时在CDS区内部设计一对巢式引物，上游N-P1:5' AAGATGGTGTCAAACCGGAGG 3'，下游N-P2:5' GCATCGGTAGTAGCAGAGCC3'，均由中科院上海植物生理研究所(植生所)Beckman示范实验室合成，预计扩增片段长度分别为778bp和207bp。
1.3 总RNA制备 新生大鼠背根神经节组织50mg，Trizol试剂提取总RNA，甲醛变性胶电泳检测其完整性。采用紫外分光光度计，测定OD260及OD280值,计算RNA含量。
1.4 逆转录反应 反应在PTC-100型热循环仪(MJ公司)上按Kit操作步骤进行：在 0.5ml Eppendorf管，加入总RNA 2μg，10μmol/L Oligo(dT)12～182μl，10×逆转录buffer 2μl，5mmol/L dNTPmix 2μl， 逆转录酶1μl(4U)，加入DEPC-treated H2O至20μl，轻混匀，稍离心，置37℃1h。93℃5min灭活酶，产物-20℃保存。
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1.5 PCR扩增 在冰上依次加入ddH2O 18μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPmix(each 2mmol/L)1μl，GAP-43上下游引物P1、P2(10μmol/L)各1μl，cDNA1μl，Taq polymerase0.5μl(1U)。轻混匀，稍离心，预热热循环仪至80℃，将PCR扩增管迅速移至热循环仪上，执行以下程序：94℃预变性3min，94℃60s，58℃60s，72℃60s，循环32次后在72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 巢式PCR扩增 取PCR扩增产物2μl，以TE作500倍稀释，行巢式PCR扩增。在冰上依次加入ddH2O 18μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPmix(2mmol/L)1μl，GAP-43巢式上下游引物N-P1、N-P2(10μmol/L)各1μl，稀释PCR产物1μl，Taq polymerase 0.5μl(1U)。轻混匀，稍离心，预热热循环仪至80℃，将PCR扩增管迅速移至热循环仪上，执行以下程序：94℃预变性3min，94℃40s，58℃30s，72℃30s，循环30次后在72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。
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1.7 PCR产物的克隆 采用胶回收Kit(Qiagen公司)，胶上回收P1、P2扩增产物条带。将回收扩增片段3μl(约100ng)与T载体连接，即TA克隆 。按kit protocol操作，14℃连接12～16h。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，涂于含X-gal 和IPTG 并具Amp抗性的1.5%琼脂平皿上。37℃倒置培养12～16h，见蓝白斑。
1.8 克隆鉴定和序列测定 挑取白斑置LB(Amp+)培养基中扩增。小量碱法抽提质粒DNA，EcoRI酶切鉴定。将酶切片段长度符合插入片段长度的质粒进行纯化(小量质粒纯化Kit，Promega公司)、Sequence Kit序列测定，放射自显影，读片，送GenBank检索。该克隆(EasyT-GAP-43)以20%甘油菌保种于-20℃。
2 结 果
2.1 总RNA的检测 经甲醛变性胶电泳、EB染色，28S和18S条带清晰可见，5S条带隐约可见，提示RNA未降解。OD260/OD280为1.88，说明RNA纯度满意。
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2.2 RT-PCR结果 样品见一特异扩增带，位于DNA Marker 750bp与1000bp之间，大小与预期结果相符，阴性对照未见扩增带(图1)。
2.3 巢式PCR验证结果 扩增出一特异条带，位于DNA Marker 100bp与250bp之间，与预期长度相符(图2)。
2.4 PCR产物克隆与序列测定 PCR产物经T载体直接克隆，转化，蓝白斑筛选。质粒酶切鉴定，与插入片段长度相符后(图3)，T7 Sequence Kit序列测定，放射自显影，读片得193bp,GenBank检索，与GAP-43基因100%同源。其全长序列测定由中科院上海植生所Beckman示范实验室完成(图4)。
图1 RT-PCR结果
M:标准分子量DNA (DL-2000)；1:PCR阴性对照；2:GAP-43(箭头所示为778bp)
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图2 巢式PCR结果
M:标准分子量DNA (DL-2000)；1:GAP-43 扩增片段 (箭头所示为207bp)；2:PCR阴性对照
图3 重组GAP-43 质粒EcoRⅠ酶切结果
M:标准分子量DNA (DL-2000)；1:空载体(Easy T 长度3.018kb)；2-3:重组质粒Easy T-GAP-43
(箭头所示778bp为插入片段)
图4 重组GAP-43质粒自动测序结果
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Karns,L.R.等[4]在GenBank登录的GAP-43 mRNA全长1153bp，其中5'非翻译区1～69，CDS区70～750，后接3'非翻译区751～1153，为226个氨基酸组成分子量24kDa的肽链。从其氨基酸组成来看，GAP-43含酸性氨基酸较多(占25%)，疏水氨基酸极少，它是一种具有高度亲水性的蛋白质，缺乏膜结合位点,然而却以可溶性和膜结合的形式存在。GAP-43在其氨基末端有一个由10个氨基酸组成的疏水区，由本身的外显子编码，这部分有两个功能，即膜结合和G蛋白反应。GAP-43是一种特异性地与神经细胞生长、发育、再生过程相关的蛋白质，在中枢神经系统发育过程中有较高水平的表达，尤其在生长锥处浓度很高[5]，因而被认为参与了轴突的生长和突触的形成。一般认为，成年的外周神经系统中GAP-43表达水平很低，但是当外周神经损伤后其表达明显增高[6]。GAP-43高表达是神经再生的典型特征，在轴突重建过程中，新生发芽末梢中GAP-43含量非常高，只要突触重建进行，即使无轴突延伸，GAP-43的表达也会在高水平进行。而一旦重建完成，GAP-43及其mRNA含量便骤然下降，甚至消失[7]。因此，在神经再生过程中，对GAP-43及其mRNA的研究显得尤为重要。
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我们按照基因序列，在GAP-43基因CDS区两端用Primer3软件设计PCR引物，采用RT-PCR法，从新生大鼠背根神经节组织mRNA中扩增出GAP-43基因片段。为了保证PCR产物序列的正确性，同时在CDS区内部设计了一对巢式引物，用以对第一次扩增产物进行验证。在结果正确后运用T载体克隆技术克隆了它的CDS区，手工测序及自动测序结果与其报道一致。本实验为进一步研究GAP-43及其mRNA的表达和调控提供了基础。
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[参考文献]
[1] 杨 辉.GAP-43表达与神经生长可塑性的关系[J].国外医学生理、病理科学与临床分册，1995，15(2)∶117.
[2] Benowitz, Routtenberg A. GAP-43 an intrintsic determinant of neuronal development and plasticity[J].Trends Neurosci, 1997,20∶84.
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[3] Mason MR, Campbell G, Caroni P, et al. Overexpression of GAP-43 in thalamic projection neurons of transgenic does not enable them to regenerate axons through peripheral nerve graft[J].Exp Neurol,2000，165(1)∶143.
[4] Karns LR,Ng SC, Freeman JA and Fishman MC. Cloning of complementary DNA for GAP-43, a neuronal growth-related protein[J].Science, 1987， 236∶597.
[5] Skene JHP, Jacobson RD, Snipe GJ, et al. A protein induced during nerve growth (GAP-43) is a major component of growth cone membranes[J].Science,1986，233∶783.
[6] Verhaagen J, Qestreicher AB, Edwards PM, et al. Light and electronmicroscopical study of phosphoprotein B-50 following denervation and reinnervation of the rat soleus muscle[J].J Neurosci, 1988，8∶1759.
[7] 许 建，李起鸿.生长相关蛋白-43与周围神经损伤及再生[J].中华创伤杂志，1999，15(5)∶391.
(收稿日期：2000-09-01), 百拇医药