HDV/HBV感染树 肝组织Fas/PasL表达与肝细胞凋亡
作者：蒋业贵 李奇芬 王宇明 顾长海
单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆市 400038
关键词：丁型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；Fas配体；细胞凋亡
摘 要摘 要：目的 探讨HDV感染树 肝组织中Fas/FasL表达与HDV感染之间的关系，以及Fas/FasL在丁型肝炎肝细胞凋亡中的作用。方法 采用免疫组化和原位杂交技术对45份HDV感染树 肝组织中HDAg，Fas/FasL和Fas/FasL mRNA的表达进行了检测；应用原位末端标记技术对肝细胞凋亡进行了检测；并应 用免疫组化双重染色对HDAg，Fas/FasL的表达以及肝细胞凋 亡进行了检测。 结果 45份肝组织中有39份可检出Fas/FasL(阳性率87%)， 有41份可检出凋亡细胞(阳性率91%).HDAg表达与 Fas/FasL表达之间有显著相关性x =29.2，x =27.9， P<0.05)，HDAg表达越强，Fas和FasL表达也越强.凋亡在 HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，以HDAg阳性细胞发生为 主.Fas/FasL表达与肝细胞凋亡之间有显著相关性(x = 35.1x =40.2，P<0.05).Fas和FasL表达越强，凋亡阳性细 胞越多。 结论 丁型肝炎病毒感染和未感染的肝细胞均可发生凋亡，但 凋亡只在少数细胞发生；肝细胞内的病毒抗原表达可诱导 Fas/FasL的表达；Fas/FasL在细胞凋亡中起重要作用。
, http://www.100md.com
Fas/FasL expression and hepatocyte apoptosis on liver tissues in tupaiawith HDV/HBV infection
Ye Gui Jiang ,Qi Fen Li ,Yu Ming Wang ,Chang Hai Gu
(Centre of lnfectious Disaases,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
Abstract：AIM To investigate the relationship between expressionof Fas/Fas ligand (FasL) and HDV infection, and its role in hepatocyte apoptonis in tupaia.METHODS Fourty-five cases of tupala liver tissues with HDV infection were studied by immunohistochemistry and in situ hybridization to determine HDAg, Fas/FasL and Fas/Fasl. mRNA, by in situ end-labeling to determine hepatocyte apoptasis, and by immunohistochemical double labeling techniques to determine HDAg, Fas, FasL and apoptosis. RESULTS Fas and FasL were detected in 39 (87%) of 45 liver uissue specimens and hepatonyte apoptosis in 41(91%). There was a significant correlation betweenexpression of HDAg and Fas/FasL (x = 29.2,x =27.9,P<0.05). The more the expression of HDAg'was, the more the expression of Fas/FasL was. Apoptosis couldoccur in both HDAg Positive and negative cells, but mainly occur in HDAg positive cells. Fas/FasL expression was closely correlated to the hepatocyte apoptosis (x = 35.1,x = 40.2, P<0.05). The more expression of Fas/FasL was, the more hepatocyte apoptosls was.CONCLUSION Apoptosis can occur in both the viral infected and uninfectedd hepatocytes, but only in aminority of hepatocytes. Fas expression may be inducedby HDAg in hepatocyte. Fas/FasL may play an important role in hepatocyte apoptosis in HDV Infection.
, 百拇医药
Keywords：hepatitis D vires; hepatitis B virus; Fas ligand; apoptosis
0引言目前已有许多实验研究证据直接表明，Fas/Fas配体(FasL)介导了细胞凋亡；我们采用免疫组化和原位杂交技术检测树肝组织中HDAg,Fas，Fas/FasL和Fas/FasLmRNA表达；采用TUNEL法原位检测肝细胞凋亡，并应用连续切片和双重染色分析hdv抗原表达、Fas/FasL表达以及与肝细胞凋亡的关系。1材料和方法1.1材料所有标本取自我科采用HDV/HBV同时感染和重叠感染的8只经血清和肝组织检测HDV标志物阳性，伴ALT升高的树[1]，选取感染后4wk～10wk肝组织标本(每周取肝组织1次)共45份，每份标本作连续切片进行系列检测。1.2方法HDAg，Fas/FasL检测采用SP法，HDV多克隆抗体由本室用HDAg合成肽免疫家兔制备而成，工作浓度1：120[2]，兔抗Fas多克隆抗体、兔抗FasL多克隆抗体购白美国SantaCruzBiotechnology公司.免疫组化双重染色：试剂盒购自美国Zymed公司，分别作Fas/FasL，HDAg/Fas，Fas/细胞凋亡、HDAg/细胞凋亡双重染色.Fas/FasLmRNA原位杂交检测：Fas/FasL寡核苷酸探针由中国科学院上海生物工程研究中心合成，序列如下：Fas5'-CTGTOTCAGGATTTAAGGTTC,GAGATT-3’，FasL5'-CTTCACTCCAGAAAGCAGGAC-3'，按试剂盒提供的方法进行标记.标记后探针质量及特异性按BoehringerMannheim公司提供的方法进行检测，均符合要求.具体操作按常规进行，实验中同时设RNA酶消化对照、空白对照，以确定杂交结果可靠性.原位细胞凋亡检测：试剂盒购自德国BoehringerMannheim公司，以反应混合液不加TdT作为阴性对照.阴性对照用3例未经HDV感染的正常树肝组织，经免疫组化证实肝炎病毒标志物均阴性.阳性对照为预实验中HDAg，Fas和FasL感染树肝组织，此外分别用兔血清和PBS代替第1抗体，以确定其特异性和可靠性.判断标准①HDAg，Fas，FasL染色判断：阴性细胞的胞质和(或)胞膜均无棕褐色染色，阳性细胞的胞质和(或)膜棕褐色染色.阳性程度分为3级：低倍镜视野阳性细胞小于1/3为(+)，1/3～2/3为(++)，大于2/3为(+++).②肝细胞凋亡程度判断：阴性细胞无细胞核棕褐色染色，阳性细胞细胞核呈棕褐色染色.阳性程度分为3级，划分标准同上.③Fas/HDAg，Fas/FasL双重染色判断：阴性细胞为胞质和(或)胞膜无紫红色或紫黑色染色.Fas，HDAg(FasL)同时阳性的细胞为胞质和(或)胞膜为紫红色和(或)紫色.Fas阳性细胞为胞质和(或)胞膜紫红色(AEC显色)，HDAg(FasL)阳性细胞为胞质和(或)胞膜紫黑色(NBT显色).④Fas/细胞凋亡、HDAg/细胞凋亡双重染色判断：阴性细胞为胞质和(或)胞膜无紫红色染色，细胞核无紫黑色染色.Fas(FasL，HDAg)和凋亡均阳性的细胞为胞膜和(或)胞质紫红色，同时细胞核为紫黑色染色.Fas(FasL，HDAg)阳性细胞为胞膜和(或)胞质紫红色(AEC显色)；凋亡阳性细胞为细胞核紫黑表1肝细胞Fas/FasL表达与HDAg表达的关系aP<0.05，vsHDAg表达(—)。色染色(NBT显色).⑤FasmRNA，FasLmRNA原位杂交结果判断：阴性细胞无紫蓝色染色，阳性细胞胞质和(或)胞核呈紫蓝色染色。统计学处理采用计数资料的X2检验，两两比较采用行x列表X2检验的分割方法。2结果2.1肝组织中HDAg和Fas/FasL检测所检测的45份标本中，有39份可检出HDAg，阳性率87%，有39份可检出Fas和FasL，阳性率为87%.Fas和FasL呈弥漫型分布，呈胞质和(或)胞膜型表达，以胞质型表达为主(图1，2)，在同一切片中可见到淋巴细胞和肝细胞均可表达FasL.Fas/FasLmRNA原位杂交和连续切片观察证实上述表达为肝细胞和淋巴细胞的结构性表达(图3，4)，原位杂交和免疫组化结果基本一致，但前者阳性率低了后者.另外，Fas/FasLmRNA原位杂交显示有低拷贝量表达.双重染色发现Fas和FasL可在同一区域或同一细胞中表达，Fas表达较FasL广泛(图5)。2.2肝细胞凋亡检测在所检测的45份标本中，有41份可检出凋亡阳性细胞，凋亡检出率为91%，凋亡阳性细胞呈散在分布(图6).偶见小叶碎屑坏死部位凋亡现象较严重，一部分凋亡阳性细胞体积较小，细胞核固结或细胞核碎裂，一部分凋亡阳性细胞形态正常(图7)。2.3HDAg表达与Fas/FasL表达的关系Fas/FasL表达与HDAg表达有密切关系，HDAg表达越强，Fas/FasL表达也越强(表1).双重染色发现HDAg和Fas可在同一区域或同一细胞中表达，Fas表达较HDAg广泛(图8)。2.4Fas/FasL，HDAg表达与肝细胞凋亡的关系Fas/FasL表达与肝细胞凋亡有密切关系，Fas/FasL表达越强，肝细胞凋亡越显著(表2).双重染色发现凋亡在Fas阳性和阴性细胞中均可发生，但以在Fas阳性细胞中发生为主(图9).凋亡在HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，但以在HDAg阳性细胞中发生为主(图10)。图1HDV/HBV感染树肝组织中Fas表达(S-P400)图2HDV/HBV感染树肝组织中FasL表达(S-P200)图3HDV/HBV感染树肝组织中FasmRNA呈阳性表达(原位杂交1000)图4HDV/HBV感染树肝组织中FasLmRNA呈阳性表达(原位杂交1000)图5HDV/HBV感染树肝组织中Fas和FasL表达(双重染色1000)图6凋亡阳性细胞在HDV/HBV感染树肝组织中呈散在付布(TUNEL400)图7部分凋亡阳性细胞体积较小，呈核固缩或核碎裂(TUNELl000)图8HDV/HBV感染树肝组织中Fas和HDAg表达(双重染色1000)图9HDV/HBV感染树肝组织中凋亡和Fas表达(双重染色1000)图10HDV/HBV感染树肝组织中凋亡和HDAg表达(双重染色1000)表2肝细胞Fas/FasL表达与肝细胞凋亡的关系aP<0.05，vs凋亡检测(—)。3讨论
, 百拇医药
目前有关乙型肝炎患者肝组织中HBV与Fas/FasL之间关系的研究报道较多[3，4]，关于丁型肝炎患者肝组织中HDV与Fas/FasL之间关系的研究鲜见报道.我们利用感染HDV/HBV树的肝组织进行HDV与Fas/FasL相互关系的研究，研究发现HDV/HBV感染树肝组织中有Fas/FasL大量表达.Fas/mRNA检出率低于免疫组化阳性率，可能原因：①实验标本采用石蜡包埋切片；②实验发现较多肝细胞Fas/FasLmRNA低拷贝量表达，影响检出率.HDAg表达越强，Fas/FasL表达也越强，提示HDV感染及其活动复制可诱导Fas/FasL表达.Fas/FasL在HDAg阴性细胞中也可表达，推测有二种可能：①HDV感染的继发因素(如LPS，LFN等)促进Fas表达；②Fas抗原抑制病毒复制，使病毒抗原表达减少[5].我们在研究中还发现Fas和FasL可在同一肝细胞、同一区域中不同肝细胞表达，推测其意义可能为：①同一肝细胞自身的Fas和FasL交联，通过顺式触发(cis-trigger)机制使细胞发生自杀；②分别表达Fas和FasL的相邻肝细胞相互交联，导致“兄弟残杀(fratricide).以上两种方式可能是Fas/FasL介导细胞凋亡的一种基本形式[6,7].肝细胞凋亡是病毒性肝炎较常见的病理改变，我们研究发现，凋亡细胞在肝实质中呈散在分布，且在肝细胞点、灶状及碎屑坏死部位均可检测到，一部分凋亡阳性细胞体积较小，有的阳性细胞核固缩；有的则呈细胞核碎裂，还有一部分凋亡阳性细胞形态基本正常，并无凋亡的典型改变，可能原因：①这些肝细胞可能处于凋亡早期的不同阶段，已有DNA损伤，尚未发生典型的形态改变；②肝细胞DNA受损，正在接受检查和修复，有可能恢复正常，也可能进入凋亡程序，凋亡在HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，但以在HDAg阳性细胞中发生为主，说明凋亡可发生病毒感染和未感染的肝细胞中。许多学者报道病毒性肝炎肝组织中同时有大量Fas，FasL表达和凋亡阳性细胞，提示Fas/FasL可能介导了病毒性肝炎的肝细胞凋亡[3,4].我们发现HDAg表达越强，凋亡阳性细胞越多，经统计学处理显示两者具有显著的关联性(P<0，05)，Fas，FasL表达越强，凋亡阳性细胞越多，经统计学处理显示两者也具有显著的关联性(P<0.05).连续切片和双重染色发现凋亡的肝细胞大多为Fas，FasL表达阳性，但表达Fas，FasL表达阴性的细胞也可出现凋亡，推测其原因为：①Fas，FasL表达与凋亡发生的相不一致；②除Fas/FasL以外可能存在其他介导凋亡的因素。大量研究表明HBsAg可诱导Fas/FasL表达，促进肝细胞凋亡，HBV与HDV之间存在相互影响，故HDV感染肝组织中Fas/FasL表达以及肝细胞凋亡，可能受HBV影响，所得出的结论可能是HDV和HBV共同作用的结果。细胞凋亡发生机制异常复杂，Fas/FasL只是凋亡发生机制中的一个方面，它与凋亡发生机制中的其他方面的关系以及病毒感染时肝细胞凋亡发生机制与意义有待进一步深入研究。
, 百拇医药
作者简介：蒋业贵，男，1966年12月25日出生，安徽省巢湖市人，汉族。1996年第三军医大学硕士，1999年第三军医大学博士，医师，主要从事病毒性肝炎的研究，发表论文10篇。
参考文献：
[1] Li QY, Ding MQ, WangH, Mao Q, Wu OQ, Zheng H, Gu CH, Wang YM.The infection of hepatitis D virus in adult tupaia. Zhonghua Yixue Zazhi,1995;75:611-613
[2] Zheng H, Li QF,Lin XH,Cui HR,Wu CQ,CuiDF,Ding MQ,Huang WD.Synthetic oligopeptide of HDAg and its clinical application.Zhonghua Yixue Zazhi,1993;73:273-274
, http://www.100md.com
[3]Zhao XP,Yang DL,Tang ZY,Shen HX,Hao LJ.Double labelling detection of apoptosis and hepatitis B surface antigen in liver tissue of patients with hepatitis B.Zhonghua Chuanranbingxue Zazhi,1998;16:14-16
[4] Ma Y,Zhang DF,Qin B,Yu CY,Fan K.Study of the relationship between the expression of Fas/Fas ligand and the HBV infection.Zhonghua Ganzangbing Zazhi,1998;6:33-34
[5] Niwamoto H,Takahashi H.Fas-mediated intracellular inactivation of hepatitis B virus DNA.Hepatology,1995;22:264A
, http://www.100md.com
[6] Golstein P,Marguet D,Depraetere V.Fas bridging cell death and cytotoxicity:the reaper connection.Immunol Rev,1995;146:45-56
[7] Vignaux F,Golstein P.Fas-based lymphocyte-mediated cytotoxicity against syngeneic activated lymphocytes:a regulatory pathway?Eur J Immunol,1994;24:9232-927
收稿日期：1999-12-27, 百拇医药
单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆市 400038
关键词：丁型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；Fas配体；细胞凋亡
摘 要摘 要：目的 探讨HDV感染树 肝组织中Fas/FasL表达与HDV感染之间的关系，以及Fas/FasL在丁型肝炎肝细胞凋亡中的作用。方法 采用免疫组化和原位杂交技术对45份HDV感染树 肝组织中HDAg，Fas/FasL和Fas/FasL mRNA的表达进行了检测；应用原位末端标记技术对肝细胞凋亡进行了检测；并应 用免疫组化双重染色对HDAg，Fas/FasL的表达以及肝细胞凋 亡进行了检测。 结果 45份肝组织中有39份可检出Fas/FasL(阳性率87%)， 有41份可检出凋亡细胞(阳性率91%).HDAg表达与 Fas/FasL表达之间有显著相关性x =29.2，x =27.9， P<0.05)，HDAg表达越强，Fas和FasL表达也越强.凋亡在 HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，以HDAg阳性细胞发生为 主.Fas/FasL表达与肝细胞凋亡之间有显著相关性(x = 35.1x =40.2，P<0.05).Fas和FasL表达越强，凋亡阳性细 胞越多。 结论 丁型肝炎病毒感染和未感染的肝细胞均可发生凋亡，但 凋亡只在少数细胞发生；肝细胞内的病毒抗原表达可诱导 Fas/FasL的表达；Fas/FasL在细胞凋亡中起重要作用。
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Fas/FasL expression and hepatocyte apoptosis on liver tissues in tupaiawith HDV/HBV infection
Ye Gui Jiang ,Qi Fen Li ,Yu Ming Wang ,Chang Hai Gu
(Centre of lnfectious Disaases,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
Abstract：AIM To investigate the relationship between expressionof Fas/Fas ligand (FasL) and HDV infection, and its role in hepatocyte apoptonis in tupaia.METHODS Fourty-five cases of tupala liver tissues with HDV infection were studied by immunohistochemistry and in situ hybridization to determine HDAg, Fas/FasL and Fas/Fasl. mRNA, by in situ end-labeling to determine hepatocyte apoptasis, and by immunohistochemical double labeling techniques to determine HDAg, Fas, FasL and apoptosis. RESULTS Fas and FasL were detected in 39 (87%) of 45 liver uissue specimens and hepatonyte apoptosis in 41(91%). There was a significant correlation betweenexpression of HDAg and Fas/FasL (x = 29.2,x =27.9,P<0.05). The more the expression of HDAg'was, the more the expression of Fas/FasL was. Apoptosis couldoccur in both HDAg Positive and negative cells, but mainly occur in HDAg positive cells. Fas/FasL expression was closely correlated to the hepatocyte apoptosis (x = 35.1,x = 40.2, P<0.05). The more expression of Fas/FasL was, the more hepatocyte apoptosls was.CONCLUSION Apoptosis can occur in both the viral infected and uninfectedd hepatocytes, but only in aminority of hepatocytes. Fas expression may be inducedby HDAg in hepatocyte. Fas/FasL may play an important role in hepatocyte apoptosis in HDV Infection.
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Keywords：hepatitis D vires; hepatitis B virus; Fas ligand; apoptosis
0引言目前已有许多实验研究证据直接表明，Fas/Fas配体(FasL)介导了细胞凋亡；我们采用免疫组化和原位杂交技术检测树肝组织中HDAg,Fas，Fas/FasL和Fas/FasLmRNA表达；采用TUNEL法原位检测肝细胞凋亡，并应用连续切片和双重染色分析hdv抗原表达、Fas/FasL表达以及与肝细胞凋亡的关系。1材料和方法1.1材料所有标本取自我科采用HDV/HBV同时感染和重叠感染的8只经血清和肝组织检测HDV标志物阳性，伴ALT升高的树[1]，选取感染后4wk～10wk肝组织标本(每周取肝组织1次)共45份，每份标本作连续切片进行系列检测。1.2方法HDAg，Fas/FasL检测采用SP法，HDV多克隆抗体由本室用HDAg合成肽免疫家兔制备而成，工作浓度1：120[2]，兔抗Fas多克隆抗体、兔抗FasL多克隆抗体购白美国SantaCruzBiotechnology公司.免疫组化双重染色：试剂盒购自美国Zymed公司，分别作Fas/FasL，HDAg/Fas，Fas/细胞凋亡、HDAg/细胞凋亡双重染色.Fas/FasLmRNA原位杂交检测：Fas/FasL寡核苷酸探针由中国科学院上海生物工程研究中心合成，序列如下：Fas5'-CTGTOTCAGGATTTAAGGTTC,GAGATT-3’，FasL5'-CTTCACTCCAGAAAGCAGGAC-3'，按试剂盒提供的方法进行标记.标记后探针质量及特异性按BoehringerMannheim公司提供的方法进行检测，均符合要求.具体操作按常规进行，实验中同时设RNA酶消化对照、空白对照，以确定杂交结果可靠性.原位细胞凋亡检测：试剂盒购自德国BoehringerMannheim公司，以反应混合液不加TdT作为阴性对照.阴性对照用3例未经HDV感染的正常树肝组织，经免疫组化证实肝炎病毒标志物均阴性.阳性对照为预实验中HDAg，Fas和FasL感染树肝组织，此外分别用兔血清和PBS代替第1抗体，以确定其特异性和可靠性.判断标准①HDAg，Fas，FasL染色判断：阴性细胞的胞质和(或)胞膜均无棕褐色染色，阳性细胞的胞质和(或)膜棕褐色染色.阳性程度分为3级：低倍镜视野阳性细胞小于1/3为(+)，1/3～2/3为(++)，大于2/3为(+++).②肝细胞凋亡程度判断：阴性细胞无细胞核棕褐色染色，阳性细胞细胞核呈棕褐色染色.阳性程度分为3级，划分标准同上.③Fas/HDAg，Fas/FasL双重染色判断：阴性细胞为胞质和(或)胞膜无紫红色或紫黑色染色.Fas，HDAg(FasL)同时阳性的细胞为胞质和(或)胞膜为紫红色和(或)紫色.Fas阳性细胞为胞质和(或)胞膜紫红色(AEC显色)，HDAg(FasL)阳性细胞为胞质和(或)胞膜紫黑色(NBT显色).④Fas/细胞凋亡、HDAg/细胞凋亡双重染色判断：阴性细胞为胞质和(或)胞膜无紫红色染色，细胞核无紫黑色染色.Fas(FasL，HDAg)和凋亡均阳性的细胞为胞膜和(或)胞质紫红色，同时细胞核为紫黑色染色.Fas(FasL，HDAg)阳性细胞为胞膜和(或)胞质紫红色(AEC显色)；凋亡阳性细胞为细胞核紫黑表1肝细胞Fas/FasL表达与HDAg表达的关系aP<0.05，vsHDAg表达(—)。色染色(NBT显色).⑤FasmRNA，FasLmRNA原位杂交结果判断：阴性细胞无紫蓝色染色，阳性细胞胞质和(或)胞核呈紫蓝色染色。统计学处理采用计数资料的X2检验，两两比较采用行x列表X2检验的分割方法。2结果2.1肝组织中HDAg和Fas/FasL检测所检测的45份标本中，有39份可检出HDAg，阳性率87%，有39份可检出Fas和FasL，阳性率为87%.Fas和FasL呈弥漫型分布，呈胞质和(或)胞膜型表达，以胞质型表达为主(图1，2)，在同一切片中可见到淋巴细胞和肝细胞均可表达FasL.Fas/FasLmRNA原位杂交和连续切片观察证实上述表达为肝细胞和淋巴细胞的结构性表达(图3，4)，原位杂交和免疫组化结果基本一致，但前者阳性率低了后者.另外，Fas/FasLmRNA原位杂交显示有低拷贝量表达.双重染色发现Fas和FasL可在同一区域或同一细胞中表达，Fas表达较FasL广泛(图5)。2.2肝细胞凋亡检测在所检测的45份标本中，有41份可检出凋亡阳性细胞，凋亡检出率为91%，凋亡阳性细胞呈散在分布(图6).偶见小叶碎屑坏死部位凋亡现象较严重，一部分凋亡阳性细胞体积较小，细胞核固结或细胞核碎裂，一部分凋亡阳性细胞形态正常(图7)。2.3HDAg表达与Fas/FasL表达的关系Fas/FasL表达与HDAg表达有密切关系，HDAg表达越强，Fas/FasL表达也越强(表1).双重染色发现HDAg和Fas可在同一区域或同一细胞中表达，Fas表达较HDAg广泛(图8)。2.4Fas/FasL，HDAg表达与肝细胞凋亡的关系Fas/FasL表达与肝细胞凋亡有密切关系，Fas/FasL表达越强，肝细胞凋亡越显著(表2).双重染色发现凋亡在Fas阳性和阴性细胞中均可发生，但以在Fas阳性细胞中发生为主(图9).凋亡在HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，但以在HDAg阳性细胞中发生为主(图10)。图1HDV/HBV感染树肝组织中Fas表达(S-P400)图2HDV/HBV感染树肝组织中FasL表达(S-P200)图3HDV/HBV感染树肝组织中FasmRNA呈阳性表达(原位杂交1000)图4HDV/HBV感染树肝组织中FasLmRNA呈阳性表达(原位杂交1000)图5HDV/HBV感染树肝组织中Fas和FasL表达(双重染色1000)图6凋亡阳性细胞在HDV/HBV感染树肝组织中呈散在付布(TUNEL400)图7部分凋亡阳性细胞体积较小，呈核固缩或核碎裂(TUNELl000)图8HDV/HBV感染树肝组织中Fas和HDAg表达(双重染色1000)图9HDV/HBV感染树肝组织中凋亡和Fas表达(双重染色1000)图10HDV/HBV感染树肝组织中凋亡和HDAg表达(双重染色1000)表2肝细胞Fas/FasL表达与肝细胞凋亡的关系aP<0.05，vs凋亡检测(—)。3讨论
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目前有关乙型肝炎患者肝组织中HBV与Fas/FasL之间关系的研究报道较多[3，4]，关于丁型肝炎患者肝组织中HDV与Fas/FasL之间关系的研究鲜见报道.我们利用感染HDV/HBV树的肝组织进行HDV与Fas/FasL相互关系的研究，研究发现HDV/HBV感染树肝组织中有Fas/FasL大量表达.Fas/mRNA检出率低于免疫组化阳性率，可能原因：①实验标本采用石蜡包埋切片；②实验发现较多肝细胞Fas/FasLmRNA低拷贝量表达，影响检出率.HDAg表达越强，Fas/FasL表达也越强，提示HDV感染及其活动复制可诱导Fas/FasL表达.Fas/FasL在HDAg阴性细胞中也可表达，推测有二种可能：①HDV感染的继发因素(如LPS，LFN等)促进Fas表达；②Fas抗原抑制病毒复制，使病毒抗原表达减少[5].我们在研究中还发现Fas和FasL可在同一肝细胞、同一区域中不同肝细胞表达，推测其意义可能为：①同一肝细胞自身的Fas和FasL交联，通过顺式触发(cis-trigger)机制使细胞发生自杀；②分别表达Fas和FasL的相邻肝细胞相互交联，导致“兄弟残杀(fratricide).以上两种方式可能是Fas/FasL介导细胞凋亡的一种基本形式[6,7].肝细胞凋亡是病毒性肝炎较常见的病理改变，我们研究发现，凋亡细胞在肝实质中呈散在分布，且在肝细胞点、灶状及碎屑坏死部位均可检测到，一部分凋亡阳性细胞体积较小，有的阳性细胞核固缩；有的则呈细胞核碎裂，还有一部分凋亡阳性细胞形态基本正常，并无凋亡的典型改变，可能原因：①这些肝细胞可能处于凋亡早期的不同阶段，已有DNA损伤，尚未发生典型的形态改变；②肝细胞DNA受损，正在接受检查和修复，有可能恢复正常，也可能进入凋亡程序，凋亡在HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，但以在HDAg阳性细胞中发生为主，说明凋亡可发生病毒感染和未感染的肝细胞中。许多学者报道病毒性肝炎肝组织中同时有大量Fas，FasL表达和凋亡阳性细胞，提示Fas/FasL可能介导了病毒性肝炎的肝细胞凋亡[3,4].我们发现HDAg表达越强，凋亡阳性细胞越多，经统计学处理显示两者具有显著的关联性(P<0，05)，Fas，FasL表达越强，凋亡阳性细胞越多，经统计学处理显示两者也具有显著的关联性(P<0.05).连续切片和双重染色发现凋亡的肝细胞大多为Fas，FasL表达阳性，但表达Fas，FasL表达阴性的细胞也可出现凋亡，推测其原因为：①Fas，FasL表达与凋亡发生的相不一致；②除Fas/FasL以外可能存在其他介导凋亡的因素。大量研究表明HBsAg可诱导Fas/FasL表达，促进肝细胞凋亡，HBV与HDV之间存在相互影响，故HDV感染肝组织中Fas/FasL表达以及肝细胞凋亡，可能受HBV影响，所得出的结论可能是HDV和HBV共同作用的结果。细胞凋亡发生机制异常复杂，Fas/FasL只是凋亡发生机制中的一个方面，它与凋亡发生机制中的其他方面的关系以及病毒感染时肝细胞凋亡发生机制与意义有待进一步深入研究。
, 百拇医药
作者简介：蒋业贵，男，1966年12月25日出生，安徽省巢湖市人，汉族。1996年第三军医大学硕士，1999年第三军医大学博士，医师，主要从事病毒性肝炎的研究，发表论文10篇。
参考文献：
[1] Li QY, Ding MQ, WangH, Mao Q, Wu OQ, Zheng H, Gu CH, Wang YM.The infection of hepatitis D virus in adult tupaia. Zhonghua Yixue Zazhi,1995;75:611-613
[2] Zheng H, Li QF,Lin XH,Cui HR,Wu CQ,CuiDF,Ding MQ,Huang WD.Synthetic oligopeptide of HDAg and its clinical application.Zhonghua Yixue Zazhi,1993;73:273-274
, http://www.100md.com
[3]Zhao XP,Yang DL,Tang ZY,Shen HX,Hao LJ.Double labelling detection of apoptosis and hepatitis B surface antigen in liver tissue of patients with hepatitis B.Zhonghua Chuanranbingxue Zazhi,1998;16:14-16
[4] Ma Y,Zhang DF,Qin B,Yu CY,Fan K.Study of the relationship between the expression of Fas/Fas ligand and the HBV infection.Zhonghua Ganzangbing Zazhi,1998;6:33-34
[5] Niwamoto H,Takahashi H.Fas-mediated intracellular inactivation of hepatitis B virus DNA.Hepatology,1995;22:264A
, http://www.100md.com
[6] Golstein P,Marguet D,Depraetere V.Fas bridging cell death and cytotoxicity:the reaper connection.Immunol Rev,1995;146:45-56
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收稿日期：1999-12-27, 百拇医药