成年大鼠心脏两个肌球蛋白重链基因表达的分子生物学特性
作者：张 冰 杨锡让 黄佳鹏 王新娟
单位：张 冰 (清华大学体育教研部运动医学研究室(北京100084))；杨锡让 (北京体育大学)；黄佳鹏 王新娟 (北京医科大学分子生物学系)
关键词：
成年大鼠心脏两个肌球蛋白重链基因 表达的分子生物学特性前 言
研究表明，肌肉的几个特异收缩蛋白是由多基因家族编码。在无脊椎动物、鸟类和哺乳类动物中，不同的肌动蛋白(actin)[1-3]基因和不同的肌球蛋白轻链(MLCs)[4-6]在肌肉和非肌肉组织中都有表达。最近通过肽图谱[6—8]免疫交叉反应[8—9]和DNA分析证明[10—12]，在大鼠中至少有10个肌球蛋白重链的基因表达。在其他脊椎动物中，MHC基因也由多基因家族编码[12—13]。每种肌肉组织有特异MHCs，这些组织中所含特异MHCs与非肌肉组织MHC不同[12—17]。但是，不同横纹肌的MHCs却不仅在同种之间，而且在种与种之间都有巨大的序列同源性[12]。尽管如此，通过多肽和酶学的研究与分析表明，心肌的肌球蛋白与别的横纹肌的肌球蛋白不同[5—6]。动脉和静脉的细胞中存在心肌肌球蛋白，通过免疫组化和动力学方法，已经在大鼠和鸡身上得到证实。同骨骼肌的MHC一样[6—8]，心肌MHCs同样也是由发育调控的[6、15、19]。在几种哺乳动物体内，已被鉴定出来有3种不同Ca2+-ATP酶活性和MHCs及MHC组成的肌球蛋白心室同工酶(Myosin Ventricular isozymes)[6,15,19]。这3个同工酶被命名为V1、V2、V3，这是根据他们依次不同的电泳迁移率而命名的[15]。在大鼠中，这些同工酶之间的双向转换是与年龄相关的[15、19]。出生时V1Ca2+-ATP酶活性最高，而且终生存在。V3和异种二聚体V2同工酶不仅在胚胎时期存在，而且在出生后的两个月会再次出现。到成年后这些同工酶的比例可以在不同的生理和病理状态下得以调节[20—23]。在胚胎时期和成年时期，心脏的MLCs和MHCs多肽组成的差异表明在大鼠的发育高峰期有不同的肌球蛋白表达[6—21]。
, http://www.100md.com
为了提高对心肌MHC基因的发育特异性和组织特异性表达的分子生物学机制的理解，以及这些同工酶可能发生的生理、病理意义的理解，V.Mahdavi[49]等构建了重组cDNA克隆。此cDNA克隆含有心肌MHC的mRNA序列。研究表明至少有两个不同组密切相关的心肌MHC基因在成年大鼠的心脏得以表达。这两个基因明显受到发育过程的调节，这些心肌的MHC的cDNA克隆的结构和核苷酸序列将在下面进行讨论并同骨骼肌的MHCs进行比较。
1 从心肌中分离MHC cDNA克隆
MHC基因家族的广泛同源性，使得分布在不同细胞中并在发育高峰期才能表达的MHCs变得很困难[12]。因此，在分子水平上研究MHC基因调节使鉴定基因特异的序列变得很关键。V.Mahdavi[49]等构建了一个cDNA文库(通过G—C末端方法)，此文库构建于PBR322的PstI位点上[24]。poly(A)+RNA由3月大鼠的心室分离出来。以此作为cDNA合成的模板，通过Grunstein 和Hogness克隆杂交过程，鉴定了16个含MHC的重组质粒[25]。鉴定过程中，使用胚胎期骨骼肌MHC cDNA克隆pMHC25的320碱基对(bp)的内部PstI限制性片段作为探针。
, 百拇医药
业已证明，从L6E9肌小管中[26，27]得到的pCMHC25含有在肌浆MHC基因家族中高度保守序列，而且pCMHC25可与心肌mRNA交互杂交[10,12]。但是这个过程只限制了对那些可以与胚胎期骨骼肌MHC交叉杂交及含有对应于插入片段的MHC cDNA的探测。因此这16个克隆是cDNA克隆数目的最少估计。
4个含有最大插入片段的MHC cDNA克隆(690-1400核苷酸)选出来进行进一步分析。注意，由于MHC mRNA长为7，100个核苷酸[24]，因此最长的克隆pCMHC5含有MHC mRNA序列的23%[49]。
pCMHC5，pCMHC21，pCMHC26及pCMHC34有非常类似的限制性内切酶图谱。这些图谱的显著性质便是限制性内切酶PstI及PvuII位点的频繁出现。二者分别识别CTGCAG(Leu-Gln)和CAGCTG(Gln-Leu)。这个性质看来是脊椎动物MHC的特性[13，24，28，29]。Pst I和Ava I位点在不同克隆重叠的部分是保守的。以pCMHC5作为参照，pCMHC21在图的横坐标400处有一个附加的BgLI位点，pCMHC26在400处亦有一个BgLI位点，而且在80处有一个PvuII位点。pCMHC34占有900个核苷酸的长度，这个片段在所有4个cDNA克隆中含有相同的限制性内切酶位点。根据这些观察可见在心脏cDNA文库中表达的MHC cDNA与MHC mRNA覆盖同一区域，可以分为两类。一类由pCMHC21和pCMHC26表现；另一类由pCMHC5表现。pCMHC34可以属于任何一类。这两种的任一类来源于一个mRNA。这表明，最少在心脏的室壁肌肉里有两个心肌MHC基因表达。
, 百拇医药
2 MHC cDNA克隆对于心脏MHC序列是特异的
由于每一个肌肉和非肌肉组织有特异的MHCs[12—17]，V.Mahdavi[49]等研究了4个MHC cDNA克隆的组织特异性。这些cDNA克隆每个都与由不同横纹肌类型(心肌和骨骼肌)，平滑肌(子宫)及非肌肉组织(纤维母细胞)中提取，而且通过电泳分离的RNA相杂交[49]。所有的cDNA克隆都与一个从横纹肌组织中提取的31s的MHC杂交。但都不与平滑肌或非肌肉组织杂交。如果用poly(A)+RNA代替总RNA可以观察到同样的结果。因此，心肌MHC cDNA克隆不与非肌浆RNA杂交，可能是由于这些序列之间缺乏核苷酸同源性，而不是RNA样本中的MHC mRNA数量的多少差别[17]。cDNA克隆与从成年大鼠心脏中提取的MHC mRNA有最强的杂交。与L6E9肌小管和骨骼肌MHC mRNA杂交可以反应心脏MHC cDNA克隆与不同MHC mRNA中共同序列的交叉同源性。这些结果表明，所有MHC cDNA克隆是心脏所特异的，但不排除对应那些克隆的MHC mRNA在L6E9肌小管和骨骼肌中以低数量存在的可能性。
, 百拇医药
3 心脏MHC序列的基因组分布
以前对于MHC序列基因组组成的研究证明，最少有8个基因编码横纹肌的MHCs[10]。V.Mahdavi[49]等决定努力去鉴定那些横纹肌MHC基因，究竟有多少可以被认为是心脏所特异的。4个心脏cDNA克隆由32P标记[30]，单个与DNA的限制性消化杂交[31]。pCMHC5，pCMHC21，pCMHC26和pCMHC34当杂交到基因组DNA中时产生同样的类型。在高严格性上，这个类型主要含有两个大约8Kb和21Kb的强杂交片段。当用HindⅢ消化时产生4.5和18Kb两个片段。别的杂交带长时间暴露于自显影会变得更加明显。这反映了与对应骨骼肌基因片段的交叉杂交[10]。但是，由于凝胶系统的低分辨率，无法确定，是由一条带代表一个基因片段还是多个。
, http://www.100md.com
考虑到心脏MHC cDNA既无EcoRⅠ又无HindⅢ限制性位点。可能每一对强杂交片段代表了两个不同的MHC基因。当然，杂交类型也可以由一个单独的MHC基因产生。这个基因被插入了一个含合适限制性位点的序列。这种可能性几乎不存在。因为，pCMHC5和pCMHC21的内部PstⅠ限制性片段，产生了与用整个cDNA克隆杂交同样的杂交类型(hybridization pattern)。
这个结果表明，在基因组中存在多个MHC基因，但是，尚不能非常确切地知道有多少，以及哪一个是心脏的编码MHC mRNA，主要的阻碍是来自于这些基因明显的序列同源性。
4 心脏MHC cDNA克隆的序列分析
为了得到关于心脏MHC基因数目的明确信息，理解他们同源性的范围，以及鉴定基因特异性序列，V.Mahdavi[49]等用Maxam和Gilbert方法测定了4个cDNA克隆的全部核苷酸序列[32]。
, http://www.100md.com
序列分析表明，cDNA克隆含有编码430个C—末端氨基酸的的序列，完整的未翻译3’末端以及一部分poly(A)，这4个克隆代表了两个不同的MHC基因的转录产物。这两个基因有95%的同源性(编码区)。但是在未翻译3’末端却有明显的不同。pCMHC21，pCMHC26和pCMHC34大约有400个碱基对重叠，明显代表同一个MHC基因的转录产物。但是，在pCMHC34，未翻译3’末端比pCMHC21的长约11个核苷酸。这个额外的序列位于MHC mRNA的Poly(A)之前。这表明了Poly(A)位点的不均一性，pCMHC5对应于另一个MHC基因的一个片段。继续进行的核苷酸和衍生的氨基酸序列研究，将由pCMHC21，pCMHC26及pCMHC34代表的一个MHC及另外一个由pCMHC5代表的MHC，这两个心脏MHC mRNA这一部分的一个特性便是高的G+C含量(33.7%G及26.9%C)和低的U含量(11.2%)。这个特性和存在几个倒转重复序列，导致形成高度稳定的发卡结构(ΔG=-12到-17.5千卡)。计算机研究未发现存在显著性的直接重复序列[49]。
, 百拇医药
比较两个心脏MHC mRNA序列，可见此部分的分子结构相当类似。一段几乎完全相同的序列被单个的、间隔25-100个碱基对的核苷酸改变所打断。一个仅有两个碱基替换的长的保守片段，存在于从663位核苷酸到1,050位核苷酸。但是，这两个序列在两个区域都存在着显著的不同：360—433位核苷酸在此处序列完全不同。这个3’末端的不同有几个有趣的特性。在 pCMHC21/26这个编码，一个比pCMHC5多两个氨基酸的片段，包括编码序列中最后21个氨基酸，终止于UAA及一个60个核苷酸的未翻译3’末端，而且，这个mRNA，Poly(A)在AATAAA序列后10个核苷酸开始。AATAAA被认为是Poly(A)的形成信号[33]。在pCMHC5中，不同的3’编码部分仅有15个氨基酸长。而且，在这个mRNA，UAG(终止子)位于未翻译序列前100个核苷酸。Poly(A)在AATAAA后18个核苷酸才开始，核苷酸序列的巨大差异以及3’末端长度的差异，证实了至少在成年鼠有两个心脏MHC基因得以表达。
, http://www.100md.com
5 来源于心脏MHC cDNA克隆的氨基酸序列
pCMHC21/26和pCMHC5的编码区代表了两个MHCs的430个C-末端氨基酸，分子的这一部分形成了α-超螺旋-螺旋二聚体结构。命名为轻分生肌球蛋白Light meromyosin(LMM)[34]。这两个心脏MHCs的LMM氨基酸序列有97%同源性。而且，这些序列与鼠[29]、兔骨骼肌MHCs具有显著的同源性[34，66]。由这两个心脏来源的序列氨基酸组成，是LMM的代表性组成[33]。序列的一半由5个氨基酸(Glu,Gln,Leu,Lys,Ala)构成。没有打破α-螺旋的Pro残基。密码子的第三位经常是G或C。例如，Glu的89%是由GAG编码；Gln，98%CAG；Leu，65%CTG；Lys，90%AAG；ALA，62%GCC编码。值得注意的是，Caenorhabditis elegans细胞壁的MHC尽管与大鼠心脏的MHCs具有显著同源性，但二者依然不同。两个心脏MHC，50%的核苷酸替换发生在密码子的第三位。这样不会改变相应的核苷酸。几个改变了的氨基酸无论在疏水性还是电荷上都类似，即使在氨基酸替代堆积的区域(120-150位氨基酸pCMHC21/26以及两个心脏MHCs的C-末端)也是如此。尽管C-末端的序列长度不同，氨基酸序列不同，两个MHCs都终止于谷氨酸残基(pCMHC21,Gln-Lys-Ile-His-Asp-Glu;pCMHC5,Gly-Leu-Asn-Glu)。C-末端的Glu-Glu对于已经获得的MHC序列都具有共同特性[29，34]。
, 百拇医药
从结构上看，代表心肌的LMM序列，表示出一个非极性基团及带电残基的特异性间隔分布。非极性疏水残基一般是3，4，3，4间隔[35]，这与一个稳定的α-螺旋结构是相吻合的，偶尔偏差[34]。间隔3，3，4，4也可以观察到。正电和负电集团很好地分隔开来，大多数情况下是由同一氨基酸的重复构成。例如：Lys-Lys-Lys(正电)和Glu-Glu-X-Glu(负电)带电集团最佳的间隔是28个残基。这些结构上的性质，在大鼠[28，29，55]及兔的骨骼肌MHCs是保守的[34]。对于C-elegans的细胞壁MHC亦是如此。这可能与螺旋—螺旋二级结构的形成和保持有关。也与肌球蛋白的分子组成有关。这些带电基团在两个相邻肌球蛋白的相互作用下，可能在组成粗肌丝时发挥稳定作用。关于C.elegans的MHC的计算机模型实验表明，聚集于α-螺旋外表面的表面电荷，当两个并列的肌球蛋白肌丝错位98个残基时，将被中和。这就产生了一个146?的轴偏离。这个偏离与X-线衍射的结果极其吻合。X-线衍射表明在粗肌丝的肌球蛋白横桥以143?的间隔形成X-螺旋结构[36]。
, http://www.100md.com
6 心脏和骨骼肌LMMs有高度同源序列
横纹肌MHC基因的序列同源性， 不仅存在于同一种间，也存在于各种之间。如：线虫、海胆，大鼠及人类[12，52]。为了寻找两个来自不同横纹肌的序列保守性的范围及分布，V.Mahdavi[49，59，61，62]等比较了心肌MHC cDNA(pCMHC21/26)的序列和胚胎期的骨骼肌MHC cDNA(pCMHC25)[28]。这两个序列表现出密切相似性。高度保守区域以连续片段表示，被不同源区域所间断。
一半的pCMHC25的限制性片段(用于心脏探针cDNA克隆及其它MHC cDNA和基因组克隆)，与心肌克隆和别的来源于骨骼肌的MHC cDNA克隆有92%同源性[29，62]。
运用计算机分析由pCMHC25及pCMHC21/26编码的两个蛋白的氨基酸组成，通过比较可以清楚地看到，这两个cDNA克隆的氨基酸序列的同源性比核苷酸序列的同源性高(比较300-450位核苷酸和100-150位氨基酸的pCMHC25轴)，而且，在pCMHC25编码的蛋白片段上，带电及非极性残基的分布是保守的。肌浆MHC的结构及功能要求，可能会解释这样一个性质。
, 百拇医药
7 心脏的MHC基因是在发育过程中受调控的
在几种哺乳动物身上已经发现了依赖于年龄改变而改变的心脏肌球蛋白同工酶[15，16，18]。12周的大鼠心脏肌球蛋白V1占80%，胚胎型V3和异二聚体V2组成了肌球蛋白剩余的20%。当从3个月动物心脏mRNA中构建心脏MHC cDNA克隆时，一组cDNA克隆能与成年心脏肌球蛋白V1进行表达，为了验证这一可能性，cDNA克隆与不同发育时期分离出的以V1和V3为主导的心脏RNA进行了杂交[15，18，50，63]。实验结果表明，pCMHC5和pCMHC21(每个都含有不同mRNA序列的3’末端)主要从成年鼠心脏中提取的mRNA杂交，而与胚胎期和新生的mRNA结合很弱。实际上，两个完整的克隆和它们未翻译的3’末端分别与20天胚胎、出生1天的动物以及成年动物的MHC mRNA进行杂交时，表现出杂交强度的逐渐增加。这同已经报道的V1同工酶的ontogeny十分吻合[15，18]。但是，pCMHC5和pCMHC21都不主要与20天的胚胎心脏mRNA结合。在此，70%的肌球蛋白是胚胎型的V3。根据如下假设，即随着心脏的发育，稳定状态的MHC mRNA水平，作为总RNA的一部分，不会改变很大，这些观察充分表明，在大鼠心室肌肉中，不是一个，至少有两个不同的成年特异的MHC基因表达。对于胚胎MHC mRNA的弱杂交，可以反应这个心脏在发育早期的两个心脏MHC的表达。
, 百拇医药
这个结论与前面报道的仅存在一种或特异的心脏MHC同工酶并不矛盾[15，18，54]。根据氨基酸序列，这两个成年心脏的MHCs将是不可区分的，至少在LMM部分是不可区分的，即便是使用现在已知的技术，在蛋白质水平上去分辨MHC都是不可能的，要想在两个MHC的全长上检测是否都存在高度的同源性，依然不能确定。
研究结果已充分表明，心室中至少有两个成年特异的心脏MHC基因表达。由这两个MHC基因的存在，提出了几个问题：他们的生物学及生理学意义如何?这两个基因是以协同的方式进行表达的吗?什么时期是它们发育过程中最确切的高峰期，以及它们能以多高的水平进行转录?在别的肌肉组织中，他们表达吗?有些问题可以用3’末端的未翻译区域的基因特异序列解决吗?
心脏在发育过程中的MHC同工酶转换需要至少两组MHC基因的调控(胚胎型和成熟型)。心肌MHC的显著特性是，在大鼠和其他几种哺乳动物[18，50]的整个生命过程中，胚胎型和成熟型MHC的基因表达水平是变化的。而且，这些基因的表达可以逆转[61]。例如，在机械性过负荷及循环激素水平改变时[15，21—23，39—41]，都会使存在于心脏和其它横纹肌中的MHC基因表达产生适应性调节[8，10—13，64]。
, 百拇医药
在运动训练的过程中，当进行大运动量、超负荷的运动训练刺激后，特别是这些训练手段在高原低氧环境中运用时刺激深度就更显强烈，那么MHC基因家族为了满足和适应这些刺激强度的要求，将会发生什么样的变化和调节，以及这些变化是暂时的适应还是永久性的获得，对其进行科学系统的观察、分析和研究，对我们正确的理解和认识MHC的生化特性和肌肉运动的生理学将有重要的意义。
参考文献
1.Reviewed in firtel.R.A. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell 1981.24,6-7
2.Engle J N,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A. 1981,78:4674-4678
, 百拇医药
3.Shani M,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Decl Biol.1981,86:483-492.
4.Lowey S,Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expresed in the adult heart.Nature 1979;282:522-524
5.Hoh J F Y,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1980,280:321-323
6.Whalen R G,and Sell S M.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1980.286,731-733
, 百拇医药
7.Whalen R G,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A.1979,76:5197-5201
8.Whalen R G,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1981,292:805-809
9.Masaki T,and Yoshizaki C J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Biochem.Tokyo 1974,76:123-131
, 百拇医药
10.Wydro R M,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.1982,June.297,24,659-664
11.Nudel U,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nucleic Acids Res,1980,8:2133-2146
12.Nguyen H T,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Acad. Sci.U.S.A. Natur 1982,June.297,24,659-664
, 百拇医药
13.Umeda P K,et al. Acad. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A. 1981m78:2843-2847
14.Gauthier G F and Lowey S J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes exprewwed in the adult heart.Cell Biol. 1979,81:10-25
15.Hoh J F Y,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell Cardiol. 1978,10:1053-1076
, 百拇医药
16.Flink I L,Radar J H and Morkin E J. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Biol.Chem.1979,254:3105-3110
17.Pollard T D and Weihing R.CRC crit.Rev.Biochem.1974,2:1-65
18.Sartore S Pierobon-Bonmioli,and Schiaffino S.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1978,274:82-83
19.Lompre A M,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Devl Biol.1981,84:286-291
, 百拇医药
20.Schwartz K,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Bio Chem.1980,104:341-346
21.Hoh J F Y,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.FEBS Lett.1979,97:330-334
22.Lompre A M,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1981,282:105-107
, http://www.100md.com
23.Mercadier J J,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation Res.1981,49:525-532
24.Medford R M Wydro,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A. 1980,77:5749-5759
25.Grunstein M,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1975,72:3961-3965
, 百拇医药
26.Yaffe D,Proc.natn. Acad.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 61,1968,477-483
27.Nadal-Ginard B.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell 1978,15:855-864
28.Wydro R M,Periasamy M,and Nadal-Ginard B.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 192.June.297,24,659-664
, 百拇医药
29.Hornig D and Nadal-Ginard B J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Biol Chem,Nature 1982.June .297,24,659-664
30.Wahl G M, Stern M and Stark G R. Proc.natn.Acad. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1979,76:3683-3687
31.Southern E M J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Molec Bio,1975,18:503-517
, 百拇医药
32.Maxam A M and Gilbert W.Proc.natn.Acad.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1977,74:560-564
33.Proudfoot NJ and Brownlec G G.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1976,263:211-214
34.Elzinga M and Trus B. in Methods in Peptide and proein Sequence Analysis(ed.Birr.Chr.) 1980:213-224(Elsevier. Amsterdam)
, 百拇医药
35.Stone D,Sode K J,Johnson P and Smillie L B. Proc.IX FEBS Meet.1975,31:125-136(North-Holland.Amsterdam).
36.Huxley H E and Brown H E J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Molec Biol. 1967,30:383-434
37.Weatherall D J and Clegg J B.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell 1979,16:467-479
38.Law S W and Dugaiczyk A.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1981,291:201-205
, 百拇医药
39.Ranerjec S K and Morkin E.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation Res. 1977,41:630-634
40.Goodkind M J,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Physiol. 1974,226:66-72
41.Banerjee S K,Flink I L and Morkin E.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation Res.1976,39:319-326
, 百拇医药
42.Smith,H O and Birnstiel M L.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nucleic Acads Res. 1978,3:2387-2398
43.Maxam A,Mand Gibert W.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Meth.E,1986,5:499-506
44.Soeiro R,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Molec.Biol,1966,19:362-372
, 百拇医药
45.Cox.R.A.Meth.Enzym.1968,12B:120-129
46.Benoff S,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1979,76:1853-1857
47.Thomas P S, et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1979,1853-1857
48.Wu.C.Bingham P.M. Livak K.J.Holmren R and Elgin S C R.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell.1979,16:797-806
, 百拇医药
49.W.Mahdavi,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nadal-Ginard.Natur Vol.1982.June.297,24,659-664
50.Schwartz K,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation,1993,87(suppl VⅡ):VⅡ-5-VⅡ-10
51.Larue C,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Clin Chem,1991;37(1):78-82
, http://www.100md.com
52.Tanigawa G.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell, 1990,62:991-998
53.Fanapazir L,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation, 1994,89:22-32
54.Macara IG.Physio Rev,1989,69:797-820
55.Tsuchimochi H,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Clin Invest, 1984,74:662-665
, 百拇医药
56.Feldman AM,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation,1991,83:1866-1872
57.Kurabayashi M,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Japanese Circulation Journal,1990,54:1192-1205
58.Hirzel Ho,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Biol Chem,1985;57:729-740
, 百拇医药
59.Noland TAJr,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Biol Chem,1991;266:4974-4978
60.Libera LD,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Basic Res Cardiol,1991;86:70-78
61.Scheuer J,et al. Molecular characterizationof two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Clin Invest.1982;70:1300-1305
, 百拇医药
62.Malhotra A,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Eur Heart J,1984;5(suppl F):61-67
63.Pirrelli AM.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Am J Med.1993;94(4A):50s-51s
64.Perricaudet SLD,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Clin Invest,1992;90:626-630
65.Pennock G.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Pharmacol Exp The,1992;263:163-169
66.Ginard BN,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Eur Heart,J,1993;14(suppl J):2-11
(1997.01.13收稿), http://www.100md.com
单位：张 冰 (清华大学体育教研部运动医学研究室(北京100084))；杨锡让 (北京体育大学)；黄佳鹏 王新娟 (北京医科大学分子生物学系)
关键词：
成年大鼠心脏两个肌球蛋白重链基因 表达的分子生物学特性前 言
研究表明，肌肉的几个特异收缩蛋白是由多基因家族编码。在无脊椎动物、鸟类和哺乳类动物中，不同的肌动蛋白(actin)[1-3]基因和不同的肌球蛋白轻链(MLCs)[4-6]在肌肉和非肌肉组织中都有表达。最近通过肽图谱[6—8]免疫交叉反应[8—9]和DNA分析证明[10—12]，在大鼠中至少有10个肌球蛋白重链的基因表达。在其他脊椎动物中，MHC基因也由多基因家族编码[12—13]。每种肌肉组织有特异MHCs，这些组织中所含特异MHCs与非肌肉组织MHC不同[12—17]。但是，不同横纹肌的MHCs却不仅在同种之间，而且在种与种之间都有巨大的序列同源性[12]。尽管如此，通过多肽和酶学的研究与分析表明，心肌的肌球蛋白与别的横纹肌的肌球蛋白不同[5—6]。动脉和静脉的细胞中存在心肌肌球蛋白，通过免疫组化和动力学方法，已经在大鼠和鸡身上得到证实。同骨骼肌的MHC一样[6—8]，心肌MHCs同样也是由发育调控的[6、15、19]。在几种哺乳动物体内，已被鉴定出来有3种不同Ca2+-ATP酶活性和MHCs及MHC组成的肌球蛋白心室同工酶(Myosin Ventricular isozymes)[6,15,19]。这3个同工酶被命名为V1、V2、V3，这是根据他们依次不同的电泳迁移率而命名的[15]。在大鼠中，这些同工酶之间的双向转换是与年龄相关的[15、19]。出生时V1Ca2+-ATP酶活性最高，而且终生存在。V3和异种二聚体V2同工酶不仅在胚胎时期存在，而且在出生后的两个月会再次出现。到成年后这些同工酶的比例可以在不同的生理和病理状态下得以调节[20—23]。在胚胎时期和成年时期，心脏的MLCs和MHCs多肽组成的差异表明在大鼠的发育高峰期有不同的肌球蛋白表达[6—21]。
, http://www.100md.com
为了提高对心肌MHC基因的发育特异性和组织特异性表达的分子生物学机制的理解，以及这些同工酶可能发生的生理、病理意义的理解，V.Mahdavi[49]等构建了重组cDNA克隆。此cDNA克隆含有心肌MHC的mRNA序列。研究表明至少有两个不同组密切相关的心肌MHC基因在成年大鼠的心脏得以表达。这两个基因明显受到发育过程的调节，这些心肌的MHC的cDNA克隆的结构和核苷酸序列将在下面进行讨论并同骨骼肌的MHCs进行比较。
1 从心肌中分离MHC cDNA克隆
MHC基因家族的广泛同源性，使得分布在不同细胞中并在发育高峰期才能表达的MHCs变得很困难[12]。因此，在分子水平上研究MHC基因调节使鉴定基因特异的序列变得很关键。V.Mahdavi[49]等构建了一个cDNA文库(通过G—C末端方法)，此文库构建于PBR322的PstI位点上[24]。poly(A)+RNA由3月大鼠的心室分离出来。以此作为cDNA合成的模板，通过Grunstein 和Hogness克隆杂交过程，鉴定了16个含MHC的重组质粒[25]。鉴定过程中，使用胚胎期骨骼肌MHC cDNA克隆pMHC25的320碱基对(bp)的内部PstI限制性片段作为探针。
, 百拇医药
业已证明，从L6E9肌小管中[26，27]得到的pCMHC25含有在肌浆MHC基因家族中高度保守序列，而且pCMHC25可与心肌mRNA交互杂交[10,12]。但是这个过程只限制了对那些可以与胚胎期骨骼肌MHC交叉杂交及含有对应于插入片段的MHC cDNA的探测。因此这16个克隆是cDNA克隆数目的最少估计。
4个含有最大插入片段的MHC cDNA克隆(690-1400核苷酸)选出来进行进一步分析。注意，由于MHC mRNA长为7，100个核苷酸[24]，因此最长的克隆pCMHC5含有MHC mRNA序列的23%[49]。
pCMHC5，pCMHC21，pCMHC26及pCMHC34有非常类似的限制性内切酶图谱。这些图谱的显著性质便是限制性内切酶PstI及PvuII位点的频繁出现。二者分别识别CTGCAG(Leu-Gln)和CAGCTG(Gln-Leu)。这个性质看来是脊椎动物MHC的特性[13，24，28，29]。Pst I和Ava I位点在不同克隆重叠的部分是保守的。以pCMHC5作为参照，pCMHC21在图的横坐标400处有一个附加的BgLI位点，pCMHC26在400处亦有一个BgLI位点，而且在80处有一个PvuII位点。pCMHC34占有900个核苷酸的长度，这个片段在所有4个cDNA克隆中含有相同的限制性内切酶位点。根据这些观察可见在心脏cDNA文库中表达的MHC cDNA与MHC mRNA覆盖同一区域，可以分为两类。一类由pCMHC21和pCMHC26表现；另一类由pCMHC5表现。pCMHC34可以属于任何一类。这两种的任一类来源于一个mRNA。这表明，最少在心脏的室壁肌肉里有两个心肌MHC基因表达。
, 百拇医药
2 MHC cDNA克隆对于心脏MHC序列是特异的
由于每一个肌肉和非肌肉组织有特异的MHCs[12—17]，V.Mahdavi[49]等研究了4个MHC cDNA克隆的组织特异性。这些cDNA克隆每个都与由不同横纹肌类型(心肌和骨骼肌)，平滑肌(子宫)及非肌肉组织(纤维母细胞)中提取，而且通过电泳分离的RNA相杂交[49]。所有的cDNA克隆都与一个从横纹肌组织中提取的31s的MHC杂交。但都不与平滑肌或非肌肉组织杂交。如果用poly(A)+RNA代替总RNA可以观察到同样的结果。因此，心肌MHC cDNA克隆不与非肌浆RNA杂交，可能是由于这些序列之间缺乏核苷酸同源性，而不是RNA样本中的MHC mRNA数量的多少差别[17]。cDNA克隆与从成年大鼠心脏中提取的MHC mRNA有最强的杂交。与L6E9肌小管和骨骼肌MHC mRNA杂交可以反应心脏MHC cDNA克隆与不同MHC mRNA中共同序列的交叉同源性。这些结果表明，所有MHC cDNA克隆是心脏所特异的，但不排除对应那些克隆的MHC mRNA在L6E9肌小管和骨骼肌中以低数量存在的可能性。
, 百拇医药
3 心脏MHC序列的基因组分布
以前对于MHC序列基因组组成的研究证明，最少有8个基因编码横纹肌的MHCs[10]。V.Mahdavi[49]等决定努力去鉴定那些横纹肌MHC基因，究竟有多少可以被认为是心脏所特异的。4个心脏cDNA克隆由32P标记[30]，单个与DNA的限制性消化杂交[31]。pCMHC5，pCMHC21，pCMHC26和pCMHC34当杂交到基因组DNA中时产生同样的类型。在高严格性上，这个类型主要含有两个大约8Kb和21Kb的强杂交片段。当用HindⅢ消化时产生4.5和18Kb两个片段。别的杂交带长时间暴露于自显影会变得更加明显。这反映了与对应骨骼肌基因片段的交叉杂交[10]。但是，由于凝胶系统的低分辨率，无法确定，是由一条带代表一个基因片段还是多个。
, http://www.100md.com
考虑到心脏MHC cDNA既无EcoRⅠ又无HindⅢ限制性位点。可能每一对强杂交片段代表了两个不同的MHC基因。当然，杂交类型也可以由一个单独的MHC基因产生。这个基因被插入了一个含合适限制性位点的序列。这种可能性几乎不存在。因为，pCMHC5和pCMHC21的内部PstⅠ限制性片段，产生了与用整个cDNA克隆杂交同样的杂交类型(hybridization pattern)。
这个结果表明，在基因组中存在多个MHC基因，但是，尚不能非常确切地知道有多少，以及哪一个是心脏的编码MHC mRNA，主要的阻碍是来自于这些基因明显的序列同源性。
4 心脏MHC cDNA克隆的序列分析
为了得到关于心脏MHC基因数目的明确信息，理解他们同源性的范围，以及鉴定基因特异性序列，V.Mahdavi[49]等用Maxam和Gilbert方法测定了4个cDNA克隆的全部核苷酸序列[32]。
, http://www.100md.com
序列分析表明，cDNA克隆含有编码430个C—末端氨基酸的的序列，完整的未翻译3’末端以及一部分poly(A)，这4个克隆代表了两个不同的MHC基因的转录产物。这两个基因有95%的同源性(编码区)。但是在未翻译3’末端却有明显的不同。pCMHC21，pCMHC26和pCMHC34大约有400个碱基对重叠，明显代表同一个MHC基因的转录产物。但是，在pCMHC34，未翻译3’末端比pCMHC21的长约11个核苷酸。这个额外的序列位于MHC mRNA的Poly(A)之前。这表明了Poly(A)位点的不均一性，pCMHC5对应于另一个MHC基因的一个片段。继续进行的核苷酸和衍生的氨基酸序列研究，将由pCMHC21，pCMHC26及pCMHC34代表的一个MHC及另外一个由pCMHC5代表的MHC，这两个心脏MHC mRNA这一部分的一个特性便是高的G+C含量(33.7%G及26.9%C)和低的U含量(11.2%)。这个特性和存在几个倒转重复序列，导致形成高度稳定的发卡结构(ΔG=-12到-17.5千卡)。计算机研究未发现存在显著性的直接重复序列[49]。
, 百拇医药
比较两个心脏MHC mRNA序列，可见此部分的分子结构相当类似。一段几乎完全相同的序列被单个的、间隔25-100个碱基对的核苷酸改变所打断。一个仅有两个碱基替换的长的保守片段，存在于从663位核苷酸到1,050位核苷酸。但是，这两个序列在两个区域都存在着显著的不同：360—433位核苷酸在此处序列完全不同。这个3’末端的不同有几个有趣的特性。在 pCMHC21/26这个编码，一个比pCMHC5多两个氨基酸的片段，包括编码序列中最后21个氨基酸，终止于UAA及一个60个核苷酸的未翻译3’末端，而且，这个mRNA，Poly(A)在AATAAA序列后10个核苷酸开始。AATAAA被认为是Poly(A)的形成信号[33]。在pCMHC5中，不同的3’编码部分仅有15个氨基酸长。而且，在这个mRNA，UAG(终止子)位于未翻译序列前100个核苷酸。Poly(A)在AATAAA后18个核苷酸才开始，核苷酸序列的巨大差异以及3’末端长度的差异，证实了至少在成年鼠有两个心脏MHC基因得以表达。
, http://www.100md.com
5 来源于心脏MHC cDNA克隆的氨基酸序列
pCMHC21/26和pCMHC5的编码区代表了两个MHCs的430个C-末端氨基酸，分子的这一部分形成了α-超螺旋-螺旋二聚体结构。命名为轻分生肌球蛋白Light meromyosin(LMM)[34]。这两个心脏MHCs的LMM氨基酸序列有97%同源性。而且，这些序列与鼠[29]、兔骨骼肌MHCs具有显著的同源性[34，66]。由这两个心脏来源的序列氨基酸组成，是LMM的代表性组成[33]。序列的一半由5个氨基酸(Glu,Gln,Leu,Lys,Ala)构成。没有打破α-螺旋的Pro残基。密码子的第三位经常是G或C。例如，Glu的89%是由GAG编码；Gln，98%CAG；Leu，65%CTG；Lys，90%AAG；ALA，62%GCC编码。值得注意的是，Caenorhabditis elegans细胞壁的MHC尽管与大鼠心脏的MHCs具有显著同源性，但二者依然不同。两个心脏MHC，50%的核苷酸替换发生在密码子的第三位。这样不会改变相应的核苷酸。几个改变了的氨基酸无论在疏水性还是电荷上都类似，即使在氨基酸替代堆积的区域(120-150位氨基酸pCMHC21/26以及两个心脏MHCs的C-末端)也是如此。尽管C-末端的序列长度不同，氨基酸序列不同，两个MHCs都终止于谷氨酸残基(pCMHC21,Gln-Lys-Ile-His-Asp-Glu;pCMHC5,Gly-Leu-Asn-Glu)。C-末端的Glu-Glu对于已经获得的MHC序列都具有共同特性[29，34]。
, 百拇医药
从结构上看，代表心肌的LMM序列，表示出一个非极性基团及带电残基的特异性间隔分布。非极性疏水残基一般是3，4，3，4间隔[35]，这与一个稳定的α-螺旋结构是相吻合的，偶尔偏差[34]。间隔3，3，4，4也可以观察到。正电和负电集团很好地分隔开来，大多数情况下是由同一氨基酸的重复构成。例如：Lys-Lys-Lys(正电)和Glu-Glu-X-Glu(负电)带电集团最佳的间隔是28个残基。这些结构上的性质，在大鼠[28，29，55]及兔的骨骼肌MHCs是保守的[34]。对于C-elegans的细胞壁MHC亦是如此。这可能与螺旋—螺旋二级结构的形成和保持有关。也与肌球蛋白的分子组成有关。这些带电基团在两个相邻肌球蛋白的相互作用下，可能在组成粗肌丝时发挥稳定作用。关于C.elegans的MHC的计算机模型实验表明，聚集于α-螺旋外表面的表面电荷，当两个并列的肌球蛋白肌丝错位98个残基时，将被中和。这就产生了一个146?的轴偏离。这个偏离与X-线衍射的结果极其吻合。X-线衍射表明在粗肌丝的肌球蛋白横桥以143?的间隔形成X-螺旋结构[36]。
, http://www.100md.com
6 心脏和骨骼肌LMMs有高度同源序列
横纹肌MHC基因的序列同源性， 不仅存在于同一种间，也存在于各种之间。如：线虫、海胆，大鼠及人类[12，52]。为了寻找两个来自不同横纹肌的序列保守性的范围及分布，V.Mahdavi[49，59，61，62]等比较了心肌MHC cDNA(pCMHC21/26)的序列和胚胎期的骨骼肌MHC cDNA(pCMHC25)[28]。这两个序列表现出密切相似性。高度保守区域以连续片段表示，被不同源区域所间断。
一半的pCMHC25的限制性片段(用于心脏探针cDNA克隆及其它MHC cDNA和基因组克隆)，与心肌克隆和别的来源于骨骼肌的MHC cDNA克隆有92%同源性[29，62]。
运用计算机分析由pCMHC25及pCMHC21/26编码的两个蛋白的氨基酸组成，通过比较可以清楚地看到，这两个cDNA克隆的氨基酸序列的同源性比核苷酸序列的同源性高(比较300-450位核苷酸和100-150位氨基酸的pCMHC25轴)，而且，在pCMHC25编码的蛋白片段上，带电及非极性残基的分布是保守的。肌浆MHC的结构及功能要求，可能会解释这样一个性质。
, 百拇医药
7 心脏的MHC基因是在发育过程中受调控的
在几种哺乳动物身上已经发现了依赖于年龄改变而改变的心脏肌球蛋白同工酶[15，16，18]。12周的大鼠心脏肌球蛋白V1占80%，胚胎型V3和异二聚体V2组成了肌球蛋白剩余的20%。当从3个月动物心脏mRNA中构建心脏MHC cDNA克隆时，一组cDNA克隆能与成年心脏肌球蛋白V1进行表达，为了验证这一可能性，cDNA克隆与不同发育时期分离出的以V1和V3为主导的心脏RNA进行了杂交[15，18，50，63]。实验结果表明，pCMHC5和pCMHC21(每个都含有不同mRNA序列的3’末端)主要从成年鼠心脏中提取的mRNA杂交，而与胚胎期和新生的mRNA结合很弱。实际上，两个完整的克隆和它们未翻译的3’末端分别与20天胚胎、出生1天的动物以及成年动物的MHC mRNA进行杂交时，表现出杂交强度的逐渐增加。这同已经报道的V1同工酶的ontogeny十分吻合[15，18]。但是，pCMHC5和pCMHC21都不主要与20天的胚胎心脏mRNA结合。在此，70%的肌球蛋白是胚胎型的V3。根据如下假设，即随着心脏的发育，稳定状态的MHC mRNA水平，作为总RNA的一部分，不会改变很大，这些观察充分表明，在大鼠心室肌肉中，不是一个，至少有两个不同的成年特异的MHC基因表达。对于胚胎MHC mRNA的弱杂交，可以反应这个心脏在发育早期的两个心脏MHC的表达。
, 百拇医药
这个结论与前面报道的仅存在一种或特异的心脏MHC同工酶并不矛盾[15，18，54]。根据氨基酸序列，这两个成年心脏的MHCs将是不可区分的，至少在LMM部分是不可区分的，即便是使用现在已知的技术，在蛋白质水平上去分辨MHC都是不可能的，要想在两个MHC的全长上检测是否都存在高度的同源性，依然不能确定。
研究结果已充分表明，心室中至少有两个成年特异的心脏MHC基因表达。由这两个MHC基因的存在，提出了几个问题：他们的生物学及生理学意义如何?这两个基因是以协同的方式进行表达的吗?什么时期是它们发育过程中最确切的高峰期，以及它们能以多高的水平进行转录?在别的肌肉组织中，他们表达吗?有些问题可以用3’末端的未翻译区域的基因特异序列解决吗?
心脏在发育过程中的MHC同工酶转换需要至少两组MHC基因的调控(胚胎型和成熟型)。心肌MHC的显著特性是，在大鼠和其他几种哺乳动物[18，50]的整个生命过程中，胚胎型和成熟型MHC的基因表达水平是变化的。而且，这些基因的表达可以逆转[61]。例如，在机械性过负荷及循环激素水平改变时[15，21—23，39—41]，都会使存在于心脏和其它横纹肌中的MHC基因表达产生适应性调节[8，10—13，64]。
, 百拇医药
在运动训练的过程中，当进行大运动量、超负荷的运动训练刺激后，特别是这些训练手段在高原低氧环境中运用时刺激深度就更显强烈，那么MHC基因家族为了满足和适应这些刺激强度的要求，将会发生什么样的变化和调节，以及这些变化是暂时的适应还是永久性的获得，对其进行科学系统的观察、分析和研究，对我们正确的理解和认识MHC的生化特性和肌肉运动的生理学将有重要的意义。
参考文献
1.Reviewed in firtel.R.A. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell 1981.24,6-7
2.Engle J N,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A. 1981,78:4674-4678
, 百拇医药
3.Shani M,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Decl Biol.1981,86:483-492.
4.Lowey S,Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expresed in the adult heart.Nature 1979;282:522-524
5.Hoh J F Y,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1980,280:321-323
6.Whalen R G,and Sell S M.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1980.286,731-733
, 百拇医药
7.Whalen R G,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A.1979,76:5197-5201
8.Whalen R G,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1981,292:805-809
9.Masaki T,and Yoshizaki C J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Biochem.Tokyo 1974,76:123-131
, 百拇医药
10.Wydro R M,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.1982,June.297,24,659-664
11.Nudel U,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nucleic Acids Res,1980,8:2133-2146
12.Nguyen H T,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Acad. Sci.U.S.A. Natur 1982,June.297,24,659-664
, 百拇医药
13.Umeda P K,et al. Acad. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A. 1981m78:2843-2847
14.Gauthier G F and Lowey S J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes exprewwed in the adult heart.Cell Biol. 1979,81:10-25
15.Hoh J F Y,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell Cardiol. 1978,10:1053-1076
, 百拇医药
16.Flink I L,Radar J H and Morkin E J. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Biol.Chem.1979,254:3105-3110
17.Pollard T D and Weihing R.CRC crit.Rev.Biochem.1974,2:1-65
18.Sartore S Pierobon-Bonmioli,and Schiaffino S.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1978,274:82-83
19.Lompre A M,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Devl Biol.1981,84:286-291
, 百拇医药
20.Schwartz K,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Bio Chem.1980,104:341-346
21.Hoh J F Y,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.FEBS Lett.1979,97:330-334
22.Lompre A M,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1981,282:105-107
, http://www.100md.com
23.Mercadier J J,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation Res.1981,49:525-532
24.Medford R M Wydro,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci U.S.A. 1980,77:5749-5759
25.Grunstein M,et al. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1975,72:3961-3965
, 百拇医药
26.Yaffe D,Proc.natn. Acad.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 61,1968,477-483
27.Nadal-Ginard B.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell 1978,15:855-864
28.Wydro R M,Periasamy M,and Nadal-Ginard B.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 192.June.297,24,659-664
, 百拇医药
29.Hornig D and Nadal-Ginard B J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Biol Chem,Nature 1982.June .297,24,659-664
30.Wahl G M, Stern M and Stark G R. Proc.natn.Acad. Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1979,76:3683-3687
31.Southern E M J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Molec Bio,1975,18:503-517
, 百拇医药
32.Maxam A M and Gilbert W.Proc.natn.Acad.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1977,74:560-564
33.Proudfoot NJ and Brownlec G G.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1976,263:211-214
34.Elzinga M and Trus B. in Methods in Peptide and proein Sequence Analysis(ed.Birr.Chr.) 1980:213-224(Elsevier. Amsterdam)
, 百拇医药
35.Stone D,Sode K J,Johnson P and Smillie L B. Proc.IX FEBS Meet.1975,31:125-136(North-Holland.Amsterdam).
36.Huxley H E and Brown H E J.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Molec Biol. 1967,30:383-434
37.Weatherall D J and Clegg J B.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell 1979,16:467-479
38.Law S W and Dugaiczyk A.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nature 1981,291:201-205
, 百拇医药
39.Ranerjec S K and Morkin E.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation Res. 1977,41:630-634
40.Goodkind M J,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Physiol. 1974,226:66-72
41.Banerjee S K,Flink I L and Morkin E.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation Res.1976,39:319-326
, 百拇医药
42.Smith,H O and Birnstiel M L.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nucleic Acads Res. 1978,3:2387-2398
43.Maxam A,Mand Gibert W.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Meth.E,1986,5:499-506
44.Soeiro R,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Molec.Biol,1966,19:362-372
, 百拇医药
45.Cox.R.A.Meth.Enzym.1968,12B:120-129
46.Benoff S,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1979,76:1853-1857
47.Thomas P S, et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Sci.U.S.A. 1979,1853-1857
48.Wu.C.Bingham P.M. Livak K.J.Holmren R and Elgin S C R.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell.1979,16:797-806
, 百拇医药
49.W.Mahdavi,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Nadal-Ginard.Natur Vol.1982.June.297,24,659-664
50.Schwartz K,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation,1993,87(suppl VⅡ):VⅡ-5-VⅡ-10
51.Larue C,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Clin Chem,1991;37(1):78-82
, http://www.100md.com
52.Tanigawa G.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Cell, 1990,62:991-998
53.Fanapazir L,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation, 1994,89:22-32
54.Macara IG.Physio Rev,1989,69:797-820
55.Tsuchimochi H,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Clin Invest, 1984,74:662-665
, 百拇医药
56.Feldman AM,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Circulation,1991,83:1866-1872
57.Kurabayashi M,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Japanese Circulation Journal,1990,54:1192-1205
58.Hirzel Ho,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Biol Chem,1985;57:729-740
, 百拇医药
59.Noland TAJr,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Biol Chem,1991;266:4974-4978
60.Libera LD,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Basic Res Cardiol,1991;86:70-78
61.Scheuer J,et al. Molecular characterizationof two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Clin Invest.1982;70:1300-1305
, 百拇医药
62.Malhotra A,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Eur Heart J,1984;5(suppl F):61-67
63.Pirrelli AM.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Am J Med.1993;94(4A):50s-51s
64.Perricaudet SLD,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Clin Invest,1992;90:626-630
65.Pennock G.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.J Pharmacol Exp The,1992;263:163-169
66.Ginard BN,et al.Molecular characterization of two myosin heavy chain genes expressed in the adult heart.Eur Heart,J,1993;14(suppl J):2-11
(1997.01.13收稿), http://www.100md.com