长期喉返神经损伤后疑核运动神经元睫状神经营养因子的表达
作者：郑宏良 由振东 周水淼 李兆基 路长林 严进 王成海 单晋杰
单位：郑宏良 由振东 周水淼 单晋杰(第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科,上海 200433)；路长林 严进 王成海(基础医学部神经生物学教研室)
关键词：神经再生；疑核；神经生长因子；喉返神经；损伤；运动神经元
第二军医大学学报001207 [摘要] 目的：研究长期喉返神经损伤后 疑核运动神经元睫状神经营养因子(CNTF)的表达及分布。方法：以犬 单侧喉返神经损伤为实验模型，采用原位杂交及免疫组织化学技术，结合图像分析技术测定 疑核CNTF mRNA及其蛋白表达呈阳性反应的神经元胞体灰度、体积及数量。结果： 疑核运动神经元能自分泌CNTF,神经损伤3周内神经元CNTF基因表达强度及反应 的胞体数明显下降，而CNTF蛋白表达增强，但表达的胞体数无改变。4周后基因表达强度和 反应的胞体数迅速增高，而CNTF表达强度恢复正常，反应的胞体数无变化。6周后基因及其 蛋白表达和神经元胞体数及体积均始终低于健侧。12周后CNTF及其蛋白表达、神经元胞体数 及体积趋向稳定。结论：长期喉返神经损伤疑核运动神经元仍保持较 高水平的CNTF表达，从中枢及神经营养因子角度提示晚期周围神经损伤具有修复价值。
, 百拇医药
[中图分类号] R 767.602 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1120-04
Expression of ciliary neurotrophic factor in ambiguous nucleus motoneuron af ter long-term laryngeal denervation
ZHENG Hong-Liang ZHOU Shui-Miao LI Zhao-Ji SHAN Jin-Jie
(Departm ent of Otolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Sh anghai 200433, China)
, 百拇医药
YOU Zhen-Dong LU Chang-Lin YAN Jin WANG Cheng-Hai
(Department of Neurobiology, Department of Basic Medicine)
[ABSTRACT] Objective:Ciliary neurotrophic factor (CNTF) plays important roles in the maintenance and survival of motor neurons. This study at tempted to explore the expression and distribution of CNTF mRNA and its protein in the ambiguous nucleus(Amb) motoneuron in order to clarify its functional s tate after long-term laryngeal denervation. Methods: The recurr ent laryngeal nerves were obtained from dogs. Brain stems were removed and secti oned for histochemistry, immunohistochemistry and in situ hybridization of C NTF. Amb motoneurons were identified by Nissl staining. The count and intensity of positive reactive motoneurons were measured by comput er image processing system. Results: Transection of the laryngeal nerve led to a very marked reduction in the count and intensity of CNTF mRNA pos itive reactive motoneurons, and reached minimal levels at week 3. CNTF immunoreactivi ty increased rapidly and reached maximal levels also at week 3. At week 4, a sig nificant increase in CNTF mRNA expression and decrease in CNTF immunoreactivity were observed. At week 6, both CNTF mRNA and its protein expression were signifi cantly less than those of unlesioned contraletaral sides. Although a difference between week 6 and 12 was observed, the motoneurons were generally stable in the expression level of CNTF mRNA and its protein, and in the size and count after 12 weeks, with 78%, 84.4%, 80.9% and 83.7% respectively as compared with t he unlesioned contralateral Amb. Conclusion: The results indicat e that although degenerating changes occurre in the Amb motoneurons after long -term laryngeal denervation, the ciliary neurotrophic factors activity of the l esioned motoneurons is still maintained at a certain level.
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[KEY WORDS] nerve regeneration; nerve growth factor; cilia ry neurotrophic factor; gene expression
周围神经再生程度取决于神经元的功能状态，尤其是神经营养因子的功能状态[1] 。周围神经损伤神经修复越早越好, 但临床所遇喉返神经、面神经损伤患者往往已长期失 神经支配。长期失神经后运动神经元的神经营养因子功能状态如何尚未见报道。本研究采用 原位杂交及免疫组织化学技术阐明长期喉返神经损伤后疑核运动神经元睫状神经营养因子(C NTF)的表达及分布，从中枢及神经营养因子角度探讨长期神经损伤后运动神经元可能的修复 、再生能力。
1 材料和方法
1.1 动物及取材 选健康成年犬14条，体质量8.0～15.0 kg，于右侧第4 气管环水 平切断喉返神经[2]，术后2，3，6，12，18，24，32周取材，每时间亚组2条犬； 取材时，双侧颈动脉插管灌注固定，取延髓及脑桥下1/3 部分置于4%多聚甲醛PBS中4℃再固 定12 h，冷冻切片，片厚50 mm，每隔6张取3片，第1至3片分别作原位杂交、免疫组化及Ni ssl染色。Nissl染色采用Cresyl Violet染色法。
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1.2 疑核CNTF mRNA原位杂交 切片经漂洗5 min，0.1 mol/L盐酸孵育10 min，Tr iton X-100孵育10 min，蛋白酶K(1 μg/ml)37℃消化30 min，4%多聚甲醛PBS终止酶消化 ，42℃预杂交2 h后42℃杂交过夜，地高辛标记的CNTF反意cRNA探针浓度约为0.5 μg/ml。 用4×SSC～0.1×SSC漂洗后，加入碱性磷酸酶交联的抗地高辛抗体(1∶1 000)，室 温2 h， 系列缓冲液洗，加入显色液NBT/BCIP避光显色4 h，贴片、常规脱水、二甲苯透明，封片保 存。对照一组以正意cRNA代替反意cRNA探针，对照二组加探针前以RNAase消化切片，其余步 骤均同实验组。
1.3 疑核CNTF免疫组化 切片用0.03%H2O2孵育10 min，以CNTF单克隆抗体( 本校神经科学研究所提供)4℃孵育48 h，工作浓度1∶2 000，再以1∶200生物素化的羊抗鼠 IgG(Sigma公司)室温反应2 h，ABC复合物室温1 h，最后以DAB液显色5 min，每步间用0.1 m ol/L PBS洗2次，贴片、常规脱水、封片。对照组采用3%BSA缓冲液代替一抗，其余同实验组。实 验过程中所有样品切片同时进行原位杂交或免疫组化反应。
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1.4 计算机图像分析 在图像采取卡(华东理工大学自动化研究所)、IBM586和Oly mpus B X 60显微镜组成的图像处理系统上，测量每一张切片上疑核神经元胞体CNTF mRNA杂 交 信号及CNTF阳性反应产物的灰度、胞体截面积、阳性反应胞体的数量。灰度值：0(黑)～255 (白)，无反应产物的样品灰度为255。将每一切片的术侧与健侧比较得术侧疑核神经元CNTF mRNA阳性反应物、胞体体积恢复率，阳性反应胞体的存活率。每一动物切片9～13张，切片数 即样本数。各时间亚组计平均值作t检验。喉返神经疑核头端与舌下神经核头端同一水 平，尾端与下橄榄核尾端同一水平[3]。
2 结果
2.1 CNTF mRNA及其蛋白在正常疑核运动神经元中的表达及分布 原位杂交显示正 常疑核运动神经元均呈深蓝色，细胞边界清楚，着色较均匀，核与胞质界限不明显，运动神 经元胞体体积大，呈多极型。胶质细胞也着色，其中突起少、体积小，呈点状的胶质细胞着 色浅淡，而突起较多、体积相对较大的胶质细胞着色较深。免疫组化显示疑核运动神经元CN TF阳性胞体呈棕黄色，细胞边界清楚，着色较均匀，核与胞质界限明显，胞质着色深，胞核 着色浅。突起较多的胶质细胞也着色，而少突胶质细胞基本不着色。疑核各平面CNTF mRNA 及其蛋白表达数为4～22个细胞体，分布极不均匀，以脑闩平面神经元最多。CNTF mRNA阳性 的喉返神经神经元为(218±17)个，CNTF阳性的神经元则为(226±13)个，两者无显著差异。 与Nissl染色所显示的神经元(223±12个)也均无明显区别。
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2.2 去喉返神经不同时限疑核运动神经元CNTF mRNA的表达 见图1A,1B。神经切 断后CNTF mRNA杂交信号明显下降，3周降至最低点，表达的神经元数也最少，与喉 返神经作 过相同处理的舌下神经的运动神经核也产生相同的改变，同一视野显示去神经侧表达明显低 于健侧。4周时表达增强，反应的细胞数明显增多(图2A)。6周后进一步增强、增多，并趋向 稳定。6周前各亚组间杂交信号强度及反应的神经元数差异均有显著性意义(P=0.04)， 6～32周后二指标各亚组间差异均无显著性意义，但均明显低于健侧(P=0.005, 图2B)。
图 1 去神经疑核CNTF mRNA及其蛋白的表达强度、表达的神经元数及截面积
Fig 1 The intense, count and area of CNTF mRNA and
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CNTF positive reactive moton eurons after laryngeal degeneration
A: The expression of CNTF mRNA and its protein (%);
B: The count of CNTF mRNA an d its protein positive reactive motoneurons (%);
C: The area of CNTF mRNA and its protein positive reactive motoneurons (%)；
●： CNTF mRNA； ▲：CNTF pr otein
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图 2 去神经4周(A) 及32周(B) 脑闩平面疑核CNTF mRNA原位杂交 (×200)
Fig 2 In situ hybridization of CNTF mRNA in injured Amb motoneuron
at week 4(A) and 32(B) after denervation (×200)
2.3 去喉返神经不同时限疑核运动神经元CNTF 蛋白表达 见图1A，1B。去神经后 CNTF阳性反应物强度增强，3周时达最高峰，与健侧相差显著(P=0.01)，而阳性的神经 元数无显著差异。与喉返神经作过相同处理的舌下神经的运动神经核也产生相同的改变，同 一视野显示损伤侧反应强度明显高于健侧。4周时反应强度及细胞数与健侧均无明显差异。6 周后阳性反应强度及细胞数明显弱于、少于健侧(P=0.03)。12周后趋向稳定，与18，2 4，32周均无明显差异，但均明显少于、弱于健侧(P=0.01)。
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2.4 去喉返神经不同时限疑核运动神经元胞体体积及数量改变 见图1C。 Nissl 染色显示胞体中Nissl体着色均匀，呈紫蓝色，胞核淡紫色或不着色，胞核、核仁置中、清 晰。去神经后胞核、核仁偏位，部分核仁消失。去神经2，3，4周时胞体肿胀，截面积均明 显大于健侧(P=0.04)，6周时截面积与正常无明显差异，但胞核、核仁仍偏离中心，神 经元明显少于健侧(P=0.01)。12周时截面积及神经元均进一步减少，与6周均有显著差 异(P=0.01)。12周后趋向稳定，各亚组间差异均不明显。各亚组神经元截面积与C NTF mRNA及其蛋白表达阳性的神经元截面积均无显著差异，神经元数量与CNTF表达阳性的神 经元数量差异也均无显著性意义。
2.5 原位杂交及免疫组化对照实验结果 CNTF mRNA原位杂交及CNTF免疫组织化 学对照实验结果，显色反应均呈阴性。
3 讨论
近年来，对周围神经、肌肉、运动终板及骨关节的实验研究及临床观察显示,晚期神经 损伤修复仍有较大临床价值[2,4]，但缺乏对神经再生中起主导作用的中枢神经元 的长期、深入的观察。神经元的功能活动主要表现在电位的变化和各种神经活性物质的变化 。有人观察了坐骨神经切断6个月的大鼠神经元形态改变, 降钙素基因相关 肽、脊髓后角P物质等神经活性物质变化, 证实去神经6个月运动神经元仍保持着一定水平的 功能活性[4]。但是上述神经活性物质不能直接反映神经营养因子的功能状态。现 已证实不同的神经元具有不同的神经营养因子受体[1,5,6]，需要不同的神经营养 因子的作用。所发现的神经营养因子中，CNTF、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因 子-4(NT-4)对运动神经元均具有保护、营养及促进运动神经纤维再生的作用，而神经生 长因子对运动神经元是否有作用存在争议[5,6]。研究证实，BDNF或(和)NT-4基因 缺失，或BDNF及NT-4受体trkB基因缺失的鼠均未引起运动神经元的死亡，而缺失CNTF基因 的鼠，运动神经元严重减少，说明CNTF对运动神经元的存活起非常重要的作用[5～7] 。但长期去神经的运动神经元内源性CNTF功能状态如何未见报道。本研究结果显示运动神 经元的形态、数量、体积等改变多集中于神经损伤前12周，此后形态学无明显变化。神经损 伤后，尽管早期CNTF蛋白阳性反应物强度迅速增加，但6周后CNTF基因及其蛋白表达强度和 表达阳性的神经元细胞数明显低于健侧，12周后趋于稳定。神经元的形态改变与CNTF表达变 化在时间上的一致性，提示神经元形态变化与神经元内源性NT表达改变有关。轴 突损伤破坏了中枢神经元与外周靶器官肌肉一体化的平衡[1,6,8]，尽管神经元能 自分泌CNTF，但主要来自于靶器官的NT，如CNTF等的营养和保护作用减弱或消失，从而使神 经 元产生病理改变，甚至死亡[6,8]。本研究从中枢及其NT表达的角度证实运动神经 元需要NT的营养和保护，周围神经损伤，如给予外源性NT，不仅能营养、保护神 经元，还为进一步促进神经再生和功能完善提供物质保证。尽管长期周围神经损伤，运动神 经元数有一定程度下降，但神经元胞体的形态去神经3个月后基本保持稳定，与去神经8个月 无明显差异，CNTF表达、Nissl体仍具有较高水平，提示神经元存在自我保护、调控的潜力 ，若晚期神经损伤得以修复，从中枢神经元及NT角度看，仍有恢复运动功能的基础。
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[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39600162).
[作者简介] 郑宏良(1962-),男(汉族),硕士,副教授,硕士生导 师.
参考文献
[1] Fu SY, Gordon J. The cellular and molecular basis of peripher al nerve regeneration[J]. Mol Neurobiol, 1997, 14(1):67-76.
[2] Zheng HL, Zhou S, Li Z, et al. An experimental comparison of dif ferent kinds of laryngeal muscle reinnervation[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998, 119( 5 ): 540-547.
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[3] Portillo F, Pasaro R. Location of motoneurons supplying the intrinsi c laryngeal muscles of rats [J] . Brain Behav Evol, 1988, 32(2):220-225.
[4] 黄耀添，王树森，楮晓朝. 周围神经损伤后脊髓神经元形态及神经活性物质变 化的研究[J].中国修复重建外科杂志，1997,11(1)：6-9.
[5] Zochodne DW, Cheng C. Neurotrophins and other grouth factors in the regeneration milieu of proximal nerve stump tips[J]. J Anat, 2000, 196(2):279 -283.
[6] Ho PR, Coan GM, Cheng ET. Repair with collagen tubules linked with B DNF and CNTF in a rat sciatic nerve injury model[J]. Arch Otolaryngol Head Ne ck Surg, 1998, 124(7):761-766.
, 百拇医药
[7] Sagot Y, Rosse T, Vejsada R, et al. Differential effects of neur otrophic factors on motoneuron retrograde labeling in a murine model of motoneur on disease[J]. Neuroscience, 1998, 18(6): 1132-1141.
[8] Sendtner M, Sltockli KA， Thoenen H. Synthesis and localization of ciliary neurotrophic factor in the sciatic nerve of the adult rat after lesion and during regeneration[J]. J Cell Biol, 1992, 118(2):139-148.
[收稿日期] 2000-06-23
[修回日期] 2000-11-30, 百拇医药
单位：郑宏良 由振东 周水淼 单晋杰(第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科,上海 200433)；路长林 严进 王成海(基础医学部神经生物学教研室)
关键词：神经再生；疑核；神经生长因子；喉返神经；损伤；运动神经元
第二军医大学学报001207 [摘要] 目的：研究长期喉返神经损伤后 疑核运动神经元睫状神经营养因子(CNTF)的表达及分布。方法：以犬 单侧喉返神经损伤为实验模型，采用原位杂交及免疫组织化学技术，结合图像分析技术测定 疑核CNTF mRNA及其蛋白表达呈阳性反应的神经元胞体灰度、体积及数量。结果： 疑核运动神经元能自分泌CNTF,神经损伤3周内神经元CNTF基因表达强度及反应 的胞体数明显下降，而CNTF蛋白表达增强，但表达的胞体数无改变。4周后基因表达强度和 反应的胞体数迅速增高，而CNTF表达强度恢复正常，反应的胞体数无变化。6周后基因及其 蛋白表达和神经元胞体数及体积均始终低于健侧。12周后CNTF及其蛋白表达、神经元胞体数 及体积趋向稳定。结论：长期喉返神经损伤疑核运动神经元仍保持较 高水平的CNTF表达，从中枢及神经营养因子角度提示晚期周围神经损伤具有修复价值。
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[中图分类号] R 767.602 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1120-04
Expression of ciliary neurotrophic factor in ambiguous nucleus motoneuron af ter long-term laryngeal denervation
ZHENG Hong-Liang ZHOU Shui-Miao LI Zhao-Ji SHAN Jin-Jie
(Departm ent of Otolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Sh anghai 200433, China)
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YOU Zhen-Dong LU Chang-Lin YAN Jin WANG Cheng-Hai
(Department of Neurobiology, Department of Basic Medicine)
[ABSTRACT] Objective:Ciliary neurotrophic factor (CNTF) plays important roles in the maintenance and survival of motor neurons. This study at tempted to explore the expression and distribution of CNTF mRNA and its protein in the ambiguous nucleus(Amb) motoneuron in order to clarify its functional s tate after long-term laryngeal denervation. Methods: The recurr ent laryngeal nerves were obtained from dogs. Brain stems were removed and secti oned for histochemistry, immunohistochemistry and in situ hybridization of C NTF. Amb motoneurons were identified by Nissl staining. The count and intensity of positive reactive motoneurons were measured by comput er image processing system. Results: Transection of the laryngeal nerve led to a very marked reduction in the count and intensity of CNTF mRNA pos itive reactive motoneurons, and reached minimal levels at week 3. CNTF immunoreactivi ty increased rapidly and reached maximal levels also at week 3. At week 4, a sig nificant increase in CNTF mRNA expression and decrease in CNTF immunoreactivity were observed. At week 6, both CNTF mRNA and its protein expression were signifi cantly less than those of unlesioned contraletaral sides. Although a difference between week 6 and 12 was observed, the motoneurons were generally stable in the expression level of CNTF mRNA and its protein, and in the size and count after 12 weeks, with 78%, 84.4%, 80.9% and 83.7% respectively as compared with t he unlesioned contralateral Amb. Conclusion: The results indicat e that although degenerating changes occurre in the Amb motoneurons after long -term laryngeal denervation, the ciliary neurotrophic factors activity of the l esioned motoneurons is still maintained at a certain level.
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[KEY WORDS] nerve regeneration; nerve growth factor; cilia ry neurotrophic factor; gene expression
周围神经再生程度取决于神经元的功能状态，尤其是神经营养因子的功能状态[1] 。周围神经损伤神经修复越早越好, 但临床所遇喉返神经、面神经损伤患者往往已长期失 神经支配。长期失神经后运动神经元的神经营养因子功能状态如何尚未见报道。本研究采用 原位杂交及免疫组织化学技术阐明长期喉返神经损伤后疑核运动神经元睫状神经营养因子(C NTF)的表达及分布，从中枢及神经营养因子角度探讨长期神经损伤后运动神经元可能的修复 、再生能力。
1 材料和方法
1.1 动物及取材 选健康成年犬14条，体质量8.0～15.0 kg，于右侧第4 气管环水 平切断喉返神经[2]，术后2，3，6，12，18，24，32周取材，每时间亚组2条犬； 取材时，双侧颈动脉插管灌注固定，取延髓及脑桥下1/3 部分置于4%多聚甲醛PBS中4℃再固 定12 h，冷冻切片，片厚50 mm，每隔6张取3片，第1至3片分别作原位杂交、免疫组化及Ni ssl染色。Nissl染色采用Cresyl Violet染色法。
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1.2 疑核CNTF mRNA原位杂交 切片经漂洗5 min，0.1 mol/L盐酸孵育10 min，Tr iton X-100孵育10 min，蛋白酶K(1 μg/ml)37℃消化30 min，4%多聚甲醛PBS终止酶消化 ，42℃预杂交2 h后42℃杂交过夜，地高辛标记的CNTF反意cRNA探针浓度约为0.5 μg/ml。 用4×SSC～0.1×SSC漂洗后，加入碱性磷酸酶交联的抗地高辛抗体(1∶1 000)，室 温2 h， 系列缓冲液洗，加入显色液NBT/BCIP避光显色4 h，贴片、常规脱水、二甲苯透明，封片保 存。对照一组以正意cRNA代替反意cRNA探针，对照二组加探针前以RNAase消化切片，其余步 骤均同实验组。
1.3 疑核CNTF免疫组化 切片用0.03%H2O2孵育10 min，以CNTF单克隆抗体( 本校神经科学研究所提供)4℃孵育48 h，工作浓度1∶2 000，再以1∶200生物素化的羊抗鼠 IgG(Sigma公司)室温反应2 h，ABC复合物室温1 h，最后以DAB液显色5 min，每步间用0.1 m ol/L PBS洗2次，贴片、常规脱水、封片。对照组采用3%BSA缓冲液代替一抗，其余同实验组。实 验过程中所有样品切片同时进行原位杂交或免疫组化反应。
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1.4 计算机图像分析 在图像采取卡(华东理工大学自动化研究所)、IBM586和Oly mpus B X 60显微镜组成的图像处理系统上，测量每一张切片上疑核神经元胞体CNTF mRNA杂 交 信号及CNTF阳性反应产物的灰度、胞体截面积、阳性反应胞体的数量。灰度值：0(黑)～255 (白)，无反应产物的样品灰度为255。将每一切片的术侧与健侧比较得术侧疑核神经元CNTF mRNA阳性反应物、胞体体积恢复率，阳性反应胞体的存活率。每一动物切片9～13张，切片数 即样本数。各时间亚组计平均值作t检验。喉返神经疑核头端与舌下神经核头端同一水 平，尾端与下橄榄核尾端同一水平[3]。
2 结果
2.1 CNTF mRNA及其蛋白在正常疑核运动神经元中的表达及分布 原位杂交显示正 常疑核运动神经元均呈深蓝色，细胞边界清楚，着色较均匀，核与胞质界限不明显，运动神 经元胞体体积大，呈多极型。胶质细胞也着色，其中突起少、体积小，呈点状的胶质细胞着 色浅淡，而突起较多、体积相对较大的胶质细胞着色较深。免疫组化显示疑核运动神经元CN TF阳性胞体呈棕黄色，细胞边界清楚，着色较均匀，核与胞质界限明显，胞质着色深，胞核 着色浅。突起较多的胶质细胞也着色，而少突胶质细胞基本不着色。疑核各平面CNTF mRNA 及其蛋白表达数为4～22个细胞体，分布极不均匀，以脑闩平面神经元最多。CNTF mRNA阳性 的喉返神经神经元为(218±17)个，CNTF阳性的神经元则为(226±13)个，两者无显著差异。 与Nissl染色所显示的神经元(223±12个)也均无明显区别。
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2.2 去喉返神经不同时限疑核运动神经元CNTF mRNA的表达 见图1A,1B。神经切 断后CNTF mRNA杂交信号明显下降，3周降至最低点，表达的神经元数也最少，与喉 返神经作 过相同处理的舌下神经的运动神经核也产生相同的改变，同一视野显示去神经侧表达明显低 于健侧。4周时表达增强，反应的细胞数明显增多(图2A)。6周后进一步增强、增多，并趋向 稳定。6周前各亚组间杂交信号强度及反应的神经元数差异均有显著性意义(P=0.04)， 6～32周后二指标各亚组间差异均无显著性意义，但均明显低于健侧(P=0.005, 图2B)。
图 1 去神经疑核CNTF mRNA及其蛋白的表达强度、表达的神经元数及截面积
Fig 1 The intense, count and area of CNTF mRNA and
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CNTF positive reactive moton eurons after laryngeal degeneration
A: The expression of CNTF mRNA and its protein (%);
B: The count of CNTF mRNA an d its protein positive reactive motoneurons (%);
C: The area of CNTF mRNA and its protein positive reactive motoneurons (%)；
●： CNTF mRNA； ▲：CNTF pr otein
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图 2 去神经4周(A) 及32周(B) 脑闩平面疑核CNTF mRNA原位杂交 (×200)
Fig 2 In situ hybridization of CNTF mRNA in injured Amb motoneuron
at week 4(A) and 32(B) after denervation (×200)
2.3 去喉返神经不同时限疑核运动神经元CNTF 蛋白表达 见图1A，1B。去神经后 CNTF阳性反应物强度增强，3周时达最高峰，与健侧相差显著(P=0.01)，而阳性的神经 元数无显著差异。与喉返神经作过相同处理的舌下神经的运动神经核也产生相同的改变，同 一视野显示损伤侧反应强度明显高于健侧。4周时反应强度及细胞数与健侧均无明显差异。6 周后阳性反应强度及细胞数明显弱于、少于健侧(P=0.03)。12周后趋向稳定，与18，2 4，32周均无明显差异，但均明显少于、弱于健侧(P=0.01)。
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2.4 去喉返神经不同时限疑核运动神经元胞体体积及数量改变 见图1C。 Nissl 染色显示胞体中Nissl体着色均匀，呈紫蓝色，胞核淡紫色或不着色，胞核、核仁置中、清 晰。去神经后胞核、核仁偏位，部分核仁消失。去神经2，3，4周时胞体肿胀，截面积均明 显大于健侧(P=0.04)，6周时截面积与正常无明显差异，但胞核、核仁仍偏离中心，神 经元明显少于健侧(P=0.01)。12周时截面积及神经元均进一步减少，与6周均有显著差 异(P=0.01)。12周后趋向稳定，各亚组间差异均不明显。各亚组神经元截面积与C NTF mRNA及其蛋白表达阳性的神经元截面积均无显著差异，神经元数量与CNTF表达阳性的神 经元数量差异也均无显著性意义。
2.5 原位杂交及免疫组化对照实验结果 CNTF mRNA原位杂交及CNTF免疫组织化 学对照实验结果，显色反应均呈阴性。
3 讨论
近年来，对周围神经、肌肉、运动终板及骨关节的实验研究及临床观察显示,晚期神经 损伤修复仍有较大临床价值[2,4]，但缺乏对神经再生中起主导作用的中枢神经元 的长期、深入的观察。神经元的功能活动主要表现在电位的变化和各种神经活性物质的变化 。有人观察了坐骨神经切断6个月的大鼠神经元形态改变, 降钙素基因相关 肽、脊髓后角P物质等神经活性物质变化, 证实去神经6个月运动神经元仍保持着一定水平的 功能活性[4]。但是上述神经活性物质不能直接反映神经营养因子的功能状态。现 已证实不同的神经元具有不同的神经营养因子受体[1,5,6]，需要不同的神经营养 因子的作用。所发现的神经营养因子中，CNTF、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因 子-4(NT-4)对运动神经元均具有保护、营养及促进运动神经纤维再生的作用，而神经生 长因子对运动神经元是否有作用存在争议[5,6]。研究证实，BDNF或(和)NT-4基因 缺失，或BDNF及NT-4受体trkB基因缺失的鼠均未引起运动神经元的死亡，而缺失CNTF基因 的鼠，运动神经元严重减少，说明CNTF对运动神经元的存活起非常重要的作用[5～7] 。但长期去神经的运动神经元内源性CNTF功能状态如何未见报道。本研究结果显示运动神 经元的形态、数量、体积等改变多集中于神经损伤前12周，此后形态学无明显变化。神经损 伤后，尽管早期CNTF蛋白阳性反应物强度迅速增加，但6周后CNTF基因及其蛋白表达强度和 表达阳性的神经元细胞数明显低于健侧，12周后趋于稳定。神经元的形态改变与CNTF表达变 化在时间上的一致性，提示神经元形态变化与神经元内源性NT表达改变有关。轴 突损伤破坏了中枢神经元与外周靶器官肌肉一体化的平衡[1,6,8]，尽管神经元能 自分泌CNTF，但主要来自于靶器官的NT，如CNTF等的营养和保护作用减弱或消失，从而使神 经 元产生病理改变，甚至死亡[6,8]。本研究从中枢及其NT表达的角度证实运动神经 元需要NT的营养和保护，周围神经损伤，如给予外源性NT，不仅能营养、保护神 经元，还为进一步促进神经再生和功能完善提供物质保证。尽管长期周围神经损伤，运动神 经元数有一定程度下降，但神经元胞体的形态去神经3个月后基本保持稳定，与去神经8个月 无明显差异，CNTF表达、Nissl体仍具有较高水平，提示神经元存在自我保护、调控的潜力 ，若晚期神经损伤得以修复，从中枢神经元及NT角度看，仍有恢复运动功能的基础。
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[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39600162).
[作者简介] 郑宏良(1962-),男(汉族),硕士,副教授,硕士生导 师.
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[收稿日期] 2000-06-23
[修回日期] 2000-11-30, 百拇医药