雌激素受体基因多态性在中国汉族人群中的分布特点
作者：刘 浩 刘志红 陈朝红 刘 栋 黎磊石
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：雌激素受体；基因多态性；种族
肾脏病与透析肾移植杂志990202 摘 要 目的：了解雌激素受体(ER)基因多态性在中国正常人群中的分布及其在不同种族中分布的差异。方法：通过PCR-限制性酶切方法对172名正常个体的基因组DNA中ER基因RFLP多态性进行了观察，并结合文献进行了不同种族间的分析比较。 结果：中国正常人群中ER基因型以pp型，xx型和ppxx型发生频率最高，这种分布特点在正常男女间差异不显著。与其他种族相比较，ER基因型在中国正常人群中的分布与日本人群中的分布较为接近，而与瑞典，美国人群中的分布差异显著。 结论：ER基因RFLP基因多态性在不同种族间分布存在着明显的差异，这种差异有可能是导致一些疾病在不同种族间发病率和临床表现存在显著不同的因素之一。
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DISTRIBUTION OF ESTROGEN RECEPTOR GENE
POLYMORPHISM IN CHINESE
Liu Hao，Liu Zhihong，Chen Zhaohong，Liu Dong，Li Leishi
Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，Nanjing University School of Medicine(Nanjing 210002)
OBJECTIVE Estrogen may participate in the pathogenesis of many diseases via its intracellular receptor.The gene for the receptor has two known polymorphism in intron 1：Pvull and Xbal，which are reported to be associated with receptor expression and function.In this study，we investigated the distribution of estrogen receptor(ER)gene polymorphism in healthy Chinese population，and compared its difference between Chinese and Caucasian population.
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METHODOLOGY Pvull and Xbal restriction fragment length polymorphism(RFLP)of estrogen receptor gene were analyzed in 101 male and 71 female healthy subjects by polymerase chain reaction and restriction digestion with Pvull and Xbal.
RESULTS The distribution of ER gene polymorphism was similar between female and male subjects in Chinese population.However，the distribution of ER genotype in different ethnic groups were quite different.There was a significant increase in the frequencies of genotype xx，pp and ppxx among Chinese as compared to Caucasian.However，the frequencies of genotype Xx，Pp and PpXx were much higher in Caucasian than in Chinese.
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CONCLUSION The distribution of ER gene polymorphism is quite different between Chinese and Caucasian.The variation of ER gene polymorphism among different ethnic groups may account for the varied clinical spectrum of some estrogen-related diseases.
Key words estrogen receptor gene polymorphism ethnic groups
人体内雌激素通过与其特异性受体相结合进而调节一系列基因的表达，发挥其重要的生理效应。因此，机体内雌激素的最终效应不仅取决于雌激素本身的分泌与代谢，还与雌激素受体(estrogen receptor，ER)的表达与功能密切相关。分子遗传学的研究表明，人类ER基因定位于第6号染色体上的q24～q27，总共有超过14万碱基对，其中包括8个外显子和7个内含子[1]。人群中ER基因在1号内含子中有两处常可发生点突变，由于这两处点突变发生在限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ的识别位点上，于是对ER基因的扩增片段进行酶切便可以区分出ER的不同基因型[2～4]。由于1号内含子中含有增强子、启动子等重要调节序列，因而在其中发生的点突变将有可能影响到ER的表达与功能[3，5]，因此人群中不同的ER基因型有可能决定了不同个体间ER的表达与功能上的差异，进而影响到体内雌激素的最终生物学效应[5]。众所周知，雌激素的生物效应与多种疾病的发生，转归和预后密切相关，因此研究雌激素受体的基因多态性与疾病间的关系将有助于从基因水平更深刻的阐明这些疾病的致病机制。不同种族间基因多态性的分布可能存在着差异，了解我国人群中ER基因多态性的分布，不仅为今后进一步研究我国人群中某些疾病的发生发展与ER基因多态性间的关系奠定基础，也将有助于我们更深入的理解这些疾病在不同种族间所具有的不同发病率和临床特点的基因背景。本文对我国汉族正常人群中ER基因多态性的分布进行了观察统计，并结合国外文献对不同种族间ER基因多态性的分布特点进行了比较。
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1 对象和方法
1.1 观察对象 172名汉族健康献血员，均符合卫生部制定的“供血者健康检查标准”，其中男性101名，女性71名，年龄18～55岁。
1.2 DNA的提取 取新鲜全血(柠檬酸抗凝)2ml，用Triton X-100同时破碎红细胞和白细胞，直接得到白细胞核，然后用NaClO4，SDS解聚核蛋白，最后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀。
1.3 ER基因多态性分析 样本基因组DNA通过PCR扩增，PCR引物由中科院上海细胞生物学研究所合成，正引物序列为5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3'，负引物序列为5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3'。扩增产物大小为1.3Kb，包括ER基因1号内含子及部分2号外显子。PCR反应体系为50μl，Taq酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)为Promega产品，变性，退火和延伸条件分别为94℃30s，61℃40s，72℃90s，共35个循环(Perkin-Eimer Cetus DNA扩增仪)，PCR扩增后分别取15μl与6单位PvuⅡ，10单位XbaⅠ于37℃酶切2h，酶切产物经1.5%琼脂糖溴乙锭电泳分离，紫外灯下判断结果。使用PvuⅡ酶切可区分出3种基因型：PP型(终产物为一1.3kb大小的条带)，Pp型(终产物为1.3kb，850bp，450bp大小的三条带)，pp型(终产物为850bp，450bp大小的二条带)，使用XbaⅠ进行酶切可以区分出XX型(1.3kb)，Xx型(1.3kb，910bp，390bp)，xx型(910bp，390bp)。以上大写字母均表示存在点突变而使该酶切位点消失，小写字母表示存在该酶切位点(附图)。
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附图 ER基因多态性分析的电泳结果
泳道2为XX型；泳道1，3，6为Xx型；泳道4，5为xx型
泳道8，9，13为PP型；泳道12，14为Pp型；泳道10，11为pp型
泳道7为分子量标志
1.4 统计学处理 计算出正常人群中ER等位基因的频率，然后经Hardv-weinberg遗传平衡定律检验，表明各基因频率已达遗传平衡，具有群体代表性。对男女间及不同种族间ER基因各亚型频率和等位基因频率采用多样本未配对资料的R×C表进行χ2检验，以P<0.05为差异显著。
2 结 果
2.1 ER基因多态性在中国正常人群中的分布 分析ER基因上PvuⅡ和XbaⅠ两个酶切位点上的基因多态性，ER基因型分别以pp型，xx型最多，而以PP型，XX型最少。综合两个酶切位点的多态性结果，ER基因型以ppxx型最多，PpXx型及Ppxx型次之。这种分布在男女之间差异不显著。在我们观察的人群中，女性中未检测到PpXX，ppXx，ppXX三种基因型，男性中未检测到ppXX型(表1，表2)。
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表1 我国正常男女的ER基因多态性的分布 性别
n
ER基因型
PPXX
PPXx
PPxx
PpXX
PpXx
Ppxx
ppXX
ppXx
ppxx
正常男性
, 百拇医药
101
5
7
2
1
18
15
0
3
50
(5.0)
(6.9)
(2.0)
(1.0)
, 百拇医药
(16.8)
(14.9)
(0)
(3.0)
(50.5)
正常女性
71
1
5
4
0
13
15
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0
0
33
(1.4)
(7.0)
(5.6)
(0)
(18.3)
(21.1)
(0)
(0)
(46.5)
合计
, 百拇医药
172
6
12
6
1
31
30
0
3
83
(3.5)
(6.9)
(3.5)
(0.6)
, 百拇医药
(17.5)
(17.5)
(0)
(1.7)
(48.9)
括号内为百分数表2 我国正常男女的ER基因PvuⅡ基因型的分布
n
ER基因型
等位基因频率
PP
Pp
pp
, 百拇医药
P
p
正常男性
101
14(13.9)
33(32.7)
54(53.5)
30.2
69.8
正常女性
71
10(14.1)
28(39.4)
, 百拇医药
33(46.5)
33.8
66.2
合 计
172
24(14.0)
61(35.5)
87(50.5)
31.7
68.3
括号内为百分数2.2 不同种族女性间ER基因多态性分布的比较 将日本，瑞典，美国等国报道的人群中ER基因多态性的分布与本文资料相比较，可以看出不同种族间ER基因多态性的分布存在着一定的差异。我国人群中ER基因型的分布与其在日本人群中的分布较为接近，而与瑞典，美国的人群中ER基因型的分布差异显著(P<0.05)。在我国人群中以pp型最常见，明显高于瑞典(P<0.05)，美国(P<0.01)，而瑞典以Pp型最常见，明显高于我国(P<0.05)；我国人群中xx型的发生频率显著高于瑞典(P<0.01)，而Xx型的发生频率显著低于瑞典(P<0.01)；我国人群中PpXx和PPXX基因型的发生频率也显著低于瑞典(P<0.01)。此外，在中、日、瑞三国女性中均未检测到ppXX型，而我国与日本女性中ppXx型和PpXX型亦未检测到(表3，表4，表5)。
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表3 我国正常男女的ER基因XbaⅠ基因型的分布
n
ER基因型
等位基因频率
XX
Xx
xx
X
x
正常男性
101
6(6.0)
27(26.7)
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68(67.3)
19.3
80.7
正常女性
71
1(1.4)
18(25.4)
52(73.2)
14.1
85.9
合 计
172
7(4.1)
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45(26.2)
120(69.7)
17.2
82.8
括号内为百分数表4 不同种族女性ER基因PvuⅡ基因型分布的比较
n
ER基因频率
等位基因频率
PP
Pp
pp
P
, http://www.100md.com
p
中国
71
0.141
0.394
0.465
0.268
0.662
日本[3]
318
0.179
0.459
0.362
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0.409
0.591
瑞典[4]
101
0.139
0.554*
0.307*
0.416
0.584
美国[5]
145
0.234
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0.517
0.248**
0.493**
0.507**
*P<0.05 **P<0.01 中国vs瑞典和美国表5 不同种族间女性ER基因XbaⅠ基因型分布的比较
n
ER基因频率
等位基因频率
XX
Xx
, 百拇医药
xx
X
x
中国
71
0.014
0.254
0.732
0.141
0.859
日本
318
0.028
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0.308
0.664
0.182
0.818
瑞典
101
0.097
0.446*
0.475**
0.302**
0.698**
*P<0.05 **P<0.01 中国vs瑞典表6 不同种族女性ER基因PvuⅡ和XbaⅠ基因型分布的比较 国别
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n
ER基因频率
PPXX
PpXx
ppxx
PpXX
PpXx
Ppxx
ppXX
ppXx
ppxx
中国
71
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0.014
0.070
0.056
0
0.183
0.211
0
0
0.465
日本
318
0.028
0.104
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0.047
0
0.204
0.255
0
0
0.365
瑞典
101
0.079**
0.069
0.050
0.020
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0.371**
0.153
0
0.050
0.297
**P<0.01中国vs瑞典3 讨 论
在所有的疾病中，除外伤性疾病外，几乎都是遗传因素与环境因素相互作用的结果，只是二者所占的比重在不同的疾病中有所不同而已。不同的基因背景可以造成不同人群对于某些疾病存在不同的易感性。对于人类基因多态性的研究可以了解各种基因的不同基因型在人群中的分布，有助于我们从基因水平更深刻的阐明各种疾病在不同种族，不同人群中存在不同发病率和不同临床表现、临床特点的内在机制[6]。因此，基因多态性的研究是解释多种疾病临床表现多样化的一个有力工具。而在对一些致病基因的多态性分布进行研究时，首先了解其在正常人群中的分布特点是正确分析基因多态性与疾病之间关系的前提条件[7，8]。
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人类ER基因的1号内含子内的点突变导致了ER基因多态性的产生，而这些点突变由于发生在两种限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ识别位点上，因此可以使用这两种内切酶对不同个体的基因扩增片段进行酶切，根据酶切位点是否因突变而消失从而得到不同长度的酶切片段，来对不同的基因型加以区分。这就是利用限制性片段长度的多态性(restriction fragment-length polymorphism，RFLP)来对ER的基因多态性进行分析的基本原理。使用内切酶PvuⅡ进行酶切可区分出PP，Pp，pp三种基因型；而使用XbaⅠ进行酶切可区分出XX，Xx，xx三种基因型，将个体中的两种酶切结果加以联合分析便可得到诸如PPXX，PpXX，ppxx等9种基因型。各种基因型在人群中的分布并不均一。在我们的研究中，我国人群中以pp型和xx型最多，而PP型和XX型最少；以ppxx型最多，PpXx型及Ppxx型次之。ER的基因多态性在不同种族间的分布存在着差异；我国与日本的人群中分布较为接近[3]，而与瑞典，美国人群中的分布有显著的差异，我国人群中pp型和xx型的发生频率显著高于美国，瑞典，而瑞典Pp型，Xx型及XxPp型的发生频率则显著高于我国[4，5]。值得注意的是，在以上的各国资料和我们的研究中均未检测到ppXX型，且PpXX型和ppXx型亦很少出现，这至少说明在一个染色体上pX型的单倍体很少出现，这其中是否存在某种机制还有待于进一步的研究。
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虽然，基因多态性是人类基因组中一个普遍存在的现象，但是基因组中某些位点上的多态性会对其基因产物的生成和功能造成不同程度的影响，进而导致不同生物个体在这些基因产物的效应方面存在差异。本研究中的ER基因PvuⅡ和XbaⅠ两种多态性均发生在雌激素受体基因的1号内含子内，而1号内含子内具有该基因的增强子和启动子等与基因的转录调控密切相关的重要调节序列[9，10]。因此，这些多态性的发生可能直接影响到ER基因的转录能力。此外，近来还有研究报道：1号内含子内发生的点突变对于其基因产物的蛋白合成也具有显著影响[11]。因此，人群中存在的不同ER基因型有可能导致不同个体中ER的转录表达水平和受体功能存在着一定的差异。这一推测目前已被一些研究证实：在对乳腺癌患者进行的ER基因多态性的研究中发现，不同的ER基因型与不同个体中雌激素受体的表达及其激素结合活力显著相关[5]。
雌激素及其受体参与人体多种重要生理功能的调节，ER的不同表达水平和功能差异必将直接影响到个体内雌激素的最终生理效应，进而对多种疾病的发生、发展和预后产生影响。因此ER的不同基因型有可能作为基因背景，决定了不同人群对于某些疾病具有不同的易感性和不同的临床特征。国外已有学者开始对ER的基因多态性与一些疾病的相关性进行研究，初步的研究结果表明：ER的基因多态性与女性乳腺癌[5，12，13]，高血压[14]，冠心病[9]，骨关节炎[3]和骨质疏松[15，16]等多种疾病的发生发展具有一定的相关性。例如，有研究表明ER基因型中PpXx型在骨关节炎患者中的出现频率显著高于正常人群中的出现频率，表明ER基因多态性与骨关节炎的发生可能有关[7]。有趣的是，我们的研究表明PpXx基因型在西方人群中出现的机率显著高于我国人群中的机率，而同时流行病学的调查也显示骨关节炎在西方的发病率要显著高于我国。因此我们认为造成这种发病率的差异不仅是由于不同种族间生活环境和生活习惯的不同所致，不同的基因背景也是其中不可忽视的一个重要原因。
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综上所述，我们的研究表明雌激素受体基因多态性的分布在不同种族间存在差异，这对于我们进一步认识临床上与雌激素相关的多种疾病，如肿瘤，心血管疾病，自身免疫性疾病等在不同种族间临床上所表现出来的差异具有重要的意义。此外，我们的研究得到了雌激素受体基因多态性在我国汉族正常人群中的分布情况，也为今后在我国人群中研究雌激素受体基因多态性与疾病间的相互关系奠定了基础。
作者简介：刘浩 南京大学医学院博士研究生
参考文献
1 Ponglikitmongkol M，Green S，Chambon P.Genomic organization of the human oestrogen receptor gene.EMBO J，1988，7：3385
2 Castotagnoli A，Maestri I，Bernardi F et al.Pvu Ⅱ RFLP inside the human estrogen receptor gene.Nucleic Acid Res，1987，15：866
, 百拇医药
3 Ushiyama T，Ueyama H，Inoue K et al.Estrogen receptor gene polymorphism and generalized osteoarthritis.J Rhenmatol，1998，25：134
4 Carling T，Rastad J，Kindmark A et al.Estrogen receptor gene polymorphism in postmenopausal primary hyperparathyroidism.Surgery，1997，122：1101
5 Hill SM，Fuqua SA，Chamness GC et al.Estrogen receptor expression in human breast cancer-associated with an estrogen receptor gene restriction fragment length polymorphism.Cancer Res，1989，49：145
, 百拇医药
6 刘志红，黎磊石.基因多态性分析与肾脏病的研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6：1
7 刘志红，陈朝红，关天俊等.南方汉族人群血管紧张素转换酶基因多态性的分布特点.中华医学杂志，1996，76：778
8 陈朝红，刘志红，关天俊等.白细胞介素-1受体拮抗剂基因多态性在正常人群中的分布特点.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6：429
9 Matsubara Y，Muratta M，Kawano K et al.Genotype distribution of estrogen receptor polymorphism in men and postmenopausal women from healthy and coromary populations and its relation to serum lipid levels.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17：3006
, 百拇医药
10 Laurie CC，Stam LF.The effect of an intronic polymorphism on alcohol dehydrogenase expression in Drosophila melanogaster.Genetics，1994，138：379
11 Gasch A，Hinz U，Renkawitz-Pohl R.Intron and upstream sequences regulate expression of the Drosophila beta 3-tubulin gene in the visceral and somatic musculature，respectively.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：3215
12 Yaich L，Dupont WD，Cavener DR et al.Analysis of the PvuⅡ restriction fragment-length polymorphism and exon structure of the estrogen receptor gene in breast cancer and peripheral blood.Cancer Res，1992，52：77
, 百拇医药
13 Andersen VI，Heimdal TR，Skredem et al.Estrogen receptor(ESR) polymorphisms and breast cancer susceptibility.Hum Genet，1994，94：665
14 Lehrer S，Rabin J，Kalir T et al. Estrogen receptor variant and hypertension in women.Hypertension，1993，21：439
15 Mizunuma H，Hosoi T，Okano H et al. Estrogen receptor gene polymorphism and bone mineral density at the lumbar spine of pre-and postmenopausal woman.Bone，1997，21：379
16 Kobayashi TI，Heimdal KR，Skrded M et al.Association of bone mineral density with polymorphism of the estrogen receptor gene.J Bone Miner Res，1996，11：306
(1999-02-20收稿), 百拇医药
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：雌激素受体；基因多态性；种族
肾脏病与透析肾移植杂志990202 摘 要 目的：了解雌激素受体(ER)基因多态性在中国正常人群中的分布及其在不同种族中分布的差异。方法：通过PCR-限制性酶切方法对172名正常个体的基因组DNA中ER基因RFLP多态性进行了观察，并结合文献进行了不同种族间的分析比较。 结果：中国正常人群中ER基因型以pp型，xx型和ppxx型发生频率最高，这种分布特点在正常男女间差异不显著。与其他种族相比较，ER基因型在中国正常人群中的分布与日本人群中的分布较为接近，而与瑞典，美国人群中的分布差异显著。 结论：ER基因RFLP基因多态性在不同种族间分布存在着明显的差异，这种差异有可能是导致一些疾病在不同种族间发病率和临床表现存在显著不同的因素之一。
, 百拇医药
DISTRIBUTION OF ESTROGEN RECEPTOR GENE
POLYMORPHISM IN CHINESE
Liu Hao，Liu Zhihong，Chen Zhaohong，Liu Dong，Li Leishi
Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，Nanjing University School of Medicine(Nanjing 210002)
OBJECTIVE Estrogen may participate in the pathogenesis of many diseases via its intracellular receptor.The gene for the receptor has two known polymorphism in intron 1：Pvull and Xbal，which are reported to be associated with receptor expression and function.In this study，we investigated the distribution of estrogen receptor(ER)gene polymorphism in healthy Chinese population，and compared its difference between Chinese and Caucasian population.
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METHODOLOGY Pvull and Xbal restriction fragment length polymorphism(RFLP)of estrogen receptor gene were analyzed in 101 male and 71 female healthy subjects by polymerase chain reaction and restriction digestion with Pvull and Xbal.
RESULTS The distribution of ER gene polymorphism was similar between female and male subjects in Chinese population.However，the distribution of ER genotype in different ethnic groups were quite different.There was a significant increase in the frequencies of genotype xx，pp and ppxx among Chinese as compared to Caucasian.However，the frequencies of genotype Xx，Pp and PpXx were much higher in Caucasian than in Chinese.
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CONCLUSION The distribution of ER gene polymorphism is quite different between Chinese and Caucasian.The variation of ER gene polymorphism among different ethnic groups may account for the varied clinical spectrum of some estrogen-related diseases.
Key words estrogen receptor gene polymorphism ethnic groups
人体内雌激素通过与其特异性受体相结合进而调节一系列基因的表达，发挥其重要的生理效应。因此，机体内雌激素的最终效应不仅取决于雌激素本身的分泌与代谢，还与雌激素受体(estrogen receptor，ER)的表达与功能密切相关。分子遗传学的研究表明，人类ER基因定位于第6号染色体上的q24～q27，总共有超过14万碱基对，其中包括8个外显子和7个内含子[1]。人群中ER基因在1号内含子中有两处常可发生点突变，由于这两处点突变发生在限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ的识别位点上，于是对ER基因的扩增片段进行酶切便可以区分出ER的不同基因型[2～4]。由于1号内含子中含有增强子、启动子等重要调节序列，因而在其中发生的点突变将有可能影响到ER的表达与功能[3，5]，因此人群中不同的ER基因型有可能决定了不同个体间ER的表达与功能上的差异，进而影响到体内雌激素的最终生物学效应[5]。众所周知，雌激素的生物效应与多种疾病的发生，转归和预后密切相关，因此研究雌激素受体的基因多态性与疾病间的关系将有助于从基因水平更深刻的阐明这些疾病的致病机制。不同种族间基因多态性的分布可能存在着差异，了解我国人群中ER基因多态性的分布，不仅为今后进一步研究我国人群中某些疾病的发生发展与ER基因多态性间的关系奠定基础，也将有助于我们更深入的理解这些疾病在不同种族间所具有的不同发病率和临床特点的基因背景。本文对我国汉族正常人群中ER基因多态性的分布进行了观察统计，并结合国外文献对不同种族间ER基因多态性的分布特点进行了比较。
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1 对象和方法
1.1 观察对象 172名汉族健康献血员，均符合卫生部制定的“供血者健康检查标准”，其中男性101名，女性71名，年龄18～55岁。
1.2 DNA的提取 取新鲜全血(柠檬酸抗凝)2ml，用Triton X-100同时破碎红细胞和白细胞，直接得到白细胞核，然后用NaClO4，SDS解聚核蛋白，最后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀。
1.3 ER基因多态性分析 样本基因组DNA通过PCR扩增，PCR引物由中科院上海细胞生物学研究所合成，正引物序列为5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3'，负引物序列为5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3'。扩增产物大小为1.3Kb，包括ER基因1号内含子及部分2号外显子。PCR反应体系为50μl，Taq酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)为Promega产品，变性，退火和延伸条件分别为94℃30s，61℃40s，72℃90s，共35个循环(Perkin-Eimer Cetus DNA扩增仪)，PCR扩增后分别取15μl与6单位PvuⅡ，10单位XbaⅠ于37℃酶切2h，酶切产物经1.5%琼脂糖溴乙锭电泳分离，紫外灯下判断结果。使用PvuⅡ酶切可区分出3种基因型：PP型(终产物为一1.3kb大小的条带)，Pp型(终产物为1.3kb，850bp，450bp大小的三条带)，pp型(终产物为850bp，450bp大小的二条带)，使用XbaⅠ进行酶切可以区分出XX型(1.3kb)，Xx型(1.3kb，910bp，390bp)，xx型(910bp，390bp)。以上大写字母均表示存在点突变而使该酶切位点消失，小写字母表示存在该酶切位点(附图)。
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附图 ER基因多态性分析的电泳结果
泳道2为XX型；泳道1，3，6为Xx型；泳道4，5为xx型
泳道8，9，13为PP型；泳道12，14为Pp型；泳道10，11为pp型
泳道7为分子量标志
1.4 统计学处理 计算出正常人群中ER等位基因的频率，然后经Hardv-weinberg遗传平衡定律检验，表明各基因频率已达遗传平衡，具有群体代表性。对男女间及不同种族间ER基因各亚型频率和等位基因频率采用多样本未配对资料的R×C表进行χ2检验，以P<0.05为差异显著。
2 结 果
2.1 ER基因多态性在中国正常人群中的分布 分析ER基因上PvuⅡ和XbaⅠ两个酶切位点上的基因多态性，ER基因型分别以pp型，xx型最多，而以PP型，XX型最少。综合两个酶切位点的多态性结果，ER基因型以ppxx型最多，PpXx型及Ppxx型次之。这种分布在男女之间差异不显著。在我们观察的人群中，女性中未检测到PpXX，ppXx，ppXX三种基因型，男性中未检测到ppXX型(表1，表2)。
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表1 我国正常男女的ER基因多态性的分布 性别
n
ER基因型
PPXX
PPXx
PPxx
PpXX
PpXx
Ppxx
ppXX
ppXx
ppxx
正常男性
, 百拇医药
101
5
7
2
1
18
15
0
3
50
(5.0)
(6.9)
(2.0)
(1.0)
, 百拇医药
(16.8)
(14.9)
(0)
(3.0)
(50.5)
正常女性
71
1
5
4
0
13
15
, http://www.100md.com
0
0
33
(1.4)
(7.0)
(5.6)
(0)
(18.3)
(21.1)
(0)
(0)
(46.5)
合计
, 百拇医药
172
6
12
6
1
31
30
0
3
83
(3.5)
(6.9)
(3.5)
(0.6)
, 百拇医药
(17.5)
(17.5)
(0)
(1.7)
(48.9)
括号内为百分数表2 我国正常男女的ER基因PvuⅡ基因型的分布
n
ER基因型
等位基因频率
PP
Pp
pp
, 百拇医药
P
p
正常男性
101
14(13.9)
33(32.7)
54(53.5)
30.2
69.8
正常女性
71
10(14.1)
28(39.4)
, 百拇医药
33(46.5)
33.8
66.2
合 计
172
24(14.0)
61(35.5)
87(50.5)
31.7
68.3
括号内为百分数2.2 不同种族女性间ER基因多态性分布的比较 将日本，瑞典，美国等国报道的人群中ER基因多态性的分布与本文资料相比较，可以看出不同种族间ER基因多态性的分布存在着一定的差异。我国人群中ER基因型的分布与其在日本人群中的分布较为接近，而与瑞典，美国的人群中ER基因型的分布差异显著(P<0.05)。在我国人群中以pp型最常见，明显高于瑞典(P<0.05)，美国(P<0.01)，而瑞典以Pp型最常见，明显高于我国(P<0.05)；我国人群中xx型的发生频率显著高于瑞典(P<0.01)，而Xx型的发生频率显著低于瑞典(P<0.01)；我国人群中PpXx和PPXX基因型的发生频率也显著低于瑞典(P<0.01)。此外，在中、日、瑞三国女性中均未检测到ppXX型，而我国与日本女性中ppXx型和PpXX型亦未检测到(表3，表4，表5)。
, 百拇医药
表3 我国正常男女的ER基因XbaⅠ基因型的分布
n
ER基因型
等位基因频率
XX
Xx
xx
X
x
正常男性
101
6(6.0)
27(26.7)
, http://www.100md.com
68(67.3)
19.3
80.7
正常女性
71
1(1.4)
18(25.4)
52(73.2)
14.1
85.9
合 计
172
7(4.1)
, http://www.100md.com
45(26.2)
120(69.7)
17.2
82.8
括号内为百分数表4 不同种族女性ER基因PvuⅡ基因型分布的比较
n
ER基因频率
等位基因频率
PP
Pp
pp
P
, http://www.100md.com
p
中国
71
0.141
0.394
0.465
0.268
0.662
日本[3]
318
0.179
0.459
0.362
, 百拇医药
0.409
0.591
瑞典[4]
101
0.139
0.554*
0.307*
0.416
0.584
美国[5]
145
0.234
, http://www.100md.com
0.517
0.248**
0.493**
0.507**
*P<0.05 **P<0.01 中国vs瑞典和美国表5 不同种族间女性ER基因XbaⅠ基因型分布的比较
n
ER基因频率
等位基因频率
XX
Xx
, 百拇医药
xx
X
x
中国
71
0.014
0.254
0.732
0.141
0.859
日本
318
0.028
, 百拇医药
0.308
0.664
0.182
0.818
瑞典
101
0.097
0.446*
0.475**
0.302**
0.698**
*P<0.05 **P<0.01 中国vs瑞典表6 不同种族女性ER基因PvuⅡ和XbaⅠ基因型分布的比较 国别
, 百拇医药
n
ER基因频率
PPXX
PpXx
ppxx
PpXX
PpXx
Ppxx
ppXX
ppXx
ppxx
中国
71
, http://www.100md.com
0.014
0.070
0.056
0
0.183
0.211
0
0
0.465
日本
318
0.028
0.104
, 百拇医药
0.047
0
0.204
0.255
0
0
0.365
瑞典
101
0.079**
0.069
0.050
0.020
, 百拇医药
0.371**
0.153
0
0.050
0.297
**P<0.01中国vs瑞典3 讨 论
在所有的疾病中，除外伤性疾病外，几乎都是遗传因素与环境因素相互作用的结果，只是二者所占的比重在不同的疾病中有所不同而已。不同的基因背景可以造成不同人群对于某些疾病存在不同的易感性。对于人类基因多态性的研究可以了解各种基因的不同基因型在人群中的分布，有助于我们从基因水平更深刻的阐明各种疾病在不同种族，不同人群中存在不同发病率和不同临床表现、临床特点的内在机制[6]。因此，基因多态性的研究是解释多种疾病临床表现多样化的一个有力工具。而在对一些致病基因的多态性分布进行研究时，首先了解其在正常人群中的分布特点是正确分析基因多态性与疾病之间关系的前提条件[7，8]。
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人类ER基因的1号内含子内的点突变导致了ER基因多态性的产生，而这些点突变由于发生在两种限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ识别位点上，因此可以使用这两种内切酶对不同个体的基因扩增片段进行酶切，根据酶切位点是否因突变而消失从而得到不同长度的酶切片段，来对不同的基因型加以区分。这就是利用限制性片段长度的多态性(restriction fragment-length polymorphism，RFLP)来对ER的基因多态性进行分析的基本原理。使用内切酶PvuⅡ进行酶切可区分出PP，Pp，pp三种基因型；而使用XbaⅠ进行酶切可区分出XX，Xx，xx三种基因型，将个体中的两种酶切结果加以联合分析便可得到诸如PPXX，PpXX，ppxx等9种基因型。各种基因型在人群中的分布并不均一。在我们的研究中，我国人群中以pp型和xx型最多，而PP型和XX型最少；以ppxx型最多，PpXx型及Ppxx型次之。ER的基因多态性在不同种族间的分布存在着差异；我国与日本的人群中分布较为接近[3]，而与瑞典，美国人群中的分布有显著的差异，我国人群中pp型和xx型的发生频率显著高于美国，瑞典，而瑞典Pp型，Xx型及XxPp型的发生频率则显著高于我国[4，5]。值得注意的是，在以上的各国资料和我们的研究中均未检测到ppXX型，且PpXX型和ppXx型亦很少出现，这至少说明在一个染色体上pX型的单倍体很少出现，这其中是否存在某种机制还有待于进一步的研究。
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虽然，基因多态性是人类基因组中一个普遍存在的现象，但是基因组中某些位点上的多态性会对其基因产物的生成和功能造成不同程度的影响，进而导致不同生物个体在这些基因产物的效应方面存在差异。本研究中的ER基因PvuⅡ和XbaⅠ两种多态性均发生在雌激素受体基因的1号内含子内，而1号内含子内具有该基因的增强子和启动子等与基因的转录调控密切相关的重要调节序列[9，10]。因此，这些多态性的发生可能直接影响到ER基因的转录能力。此外，近来还有研究报道：1号内含子内发生的点突变对于其基因产物的蛋白合成也具有显著影响[11]。因此，人群中存在的不同ER基因型有可能导致不同个体中ER的转录表达水平和受体功能存在着一定的差异。这一推测目前已被一些研究证实：在对乳腺癌患者进行的ER基因多态性的研究中发现，不同的ER基因型与不同个体中雌激素受体的表达及其激素结合活力显著相关[5]。
雌激素及其受体参与人体多种重要生理功能的调节，ER的不同表达水平和功能差异必将直接影响到个体内雌激素的最终生理效应，进而对多种疾病的发生、发展和预后产生影响。因此ER的不同基因型有可能作为基因背景，决定了不同人群对于某些疾病具有不同的易感性和不同的临床特征。国外已有学者开始对ER的基因多态性与一些疾病的相关性进行研究，初步的研究结果表明：ER的基因多态性与女性乳腺癌[5，12，13]，高血压[14]，冠心病[9]，骨关节炎[3]和骨质疏松[15，16]等多种疾病的发生发展具有一定的相关性。例如，有研究表明ER基因型中PpXx型在骨关节炎患者中的出现频率显著高于正常人群中的出现频率，表明ER基因多态性与骨关节炎的发生可能有关[7]。有趣的是，我们的研究表明PpXx基因型在西方人群中出现的机率显著高于我国人群中的机率，而同时流行病学的调查也显示骨关节炎在西方的发病率要显著高于我国。因此我们认为造成这种发病率的差异不仅是由于不同种族间生活环境和生活习惯的不同所致，不同的基因背景也是其中不可忽视的一个重要原因。
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综上所述，我们的研究表明雌激素受体基因多态性的分布在不同种族间存在差异，这对于我们进一步认识临床上与雌激素相关的多种疾病，如肿瘤，心血管疾病，自身免疫性疾病等在不同种族间临床上所表现出来的差异具有重要的意义。此外，我们的研究得到了雌激素受体基因多态性在我国汉族正常人群中的分布情况，也为今后在我国人群中研究雌激素受体基因多态性与疾病间的相互关系奠定了基础。
作者简介：刘浩 南京大学医学院博士研究生
参考文献
1 Ponglikitmongkol M，Green S，Chambon P.Genomic organization of the human oestrogen receptor gene.EMBO J，1988，7：3385
2 Castotagnoli A，Maestri I，Bernardi F et al.Pvu Ⅱ RFLP inside the human estrogen receptor gene.Nucleic Acid Res，1987，15：866
, 百拇医药
3 Ushiyama T，Ueyama H，Inoue K et al.Estrogen receptor gene polymorphism and generalized osteoarthritis.J Rhenmatol，1998，25：134
4 Carling T，Rastad J，Kindmark A et al.Estrogen receptor gene polymorphism in postmenopausal primary hyperparathyroidism.Surgery，1997，122：1101
5 Hill SM，Fuqua SA，Chamness GC et al.Estrogen receptor expression in human breast cancer-associated with an estrogen receptor gene restriction fragment length polymorphism.Cancer Res，1989，49：145
, 百拇医药
6 刘志红，黎磊石.基因多态性分析与肾脏病的研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6：1
7 刘志红，陈朝红，关天俊等.南方汉族人群血管紧张素转换酶基因多态性的分布特点.中华医学杂志，1996，76：778
8 陈朝红，刘志红，关天俊等.白细胞介素-1受体拮抗剂基因多态性在正常人群中的分布特点.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6：429
9 Matsubara Y，Muratta M，Kawano K et al.Genotype distribution of estrogen receptor polymorphism in men and postmenopausal women from healthy and coromary populations and its relation to serum lipid levels.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17：3006
, 百拇医药
10 Laurie CC，Stam LF.The effect of an intronic polymorphism on alcohol dehydrogenase expression in Drosophila melanogaster.Genetics，1994，138：379
11 Gasch A，Hinz U，Renkawitz-Pohl R.Intron and upstream sequences regulate expression of the Drosophila beta 3-tubulin gene in the visceral and somatic musculature，respectively.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：3215
12 Yaich L，Dupont WD，Cavener DR et al.Analysis of the PvuⅡ restriction fragment-length polymorphism and exon structure of the estrogen receptor gene in breast cancer and peripheral blood.Cancer Res，1992，52：77
, 百拇医药
13 Andersen VI，Heimdal TR，Skredem et al.Estrogen receptor(ESR) polymorphisms and breast cancer susceptibility.Hum Genet，1994，94：665
14 Lehrer S，Rabin J，Kalir T et al. Estrogen receptor variant and hypertension in women.Hypertension，1993，21：439
15 Mizunuma H，Hosoi T，Okano H et al. Estrogen receptor gene polymorphism and bone mineral density at the lumbar spine of pre-and postmenopausal woman.Bone，1997，21：379
16 Kobayashi TI，Heimdal KR，Skrded M et al.Association of bone mineral density with polymorphism of the estrogen receptor gene.J Bone Miner Res，1996，11：306
(1999-02-20收稿), 百拇医药