表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建
作者：赵 军 张秀根 陈溥言 蔡宝祥
单位：南京农业大学动物医学院，南京210095
关键词：新城疫病毒；血凝素-神经氨酸酶(HN)基因；重组HVT
中国病毒学/990312 摘 要 应用聚合酶链反应技术，用设计带有限制性酶切位点的引物，特异地扩增从起始密码子开始的1.8kb新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因开放式阅读框，然后插入pTK2B的Nhe Ⅰ位点，构建了含NDV HN基因的插入载体 pTKHN1和pTKHN2，再与感染火鸡疱疹病毒(HVT)细胞的总DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，经有限稀释法和Dot-blot筛选，得到含有HN基因的重组体rHVT1和rHVT2。经组织培养传代和Western blot分析，表明重组体在感染细胞中表达了HN蛋白。重组体在CEF上的生长特性与亲本病毒相同，且在连续传代过程中保持稳定。为国内新城疫基因工程疫苗研制奠定了基础。
, 百拇医药
Construction of a Recombinant Herpesvirus of Turkey Expressing
the Haemagglutinin-Neuraminidase Gene of Newcastle Disease Virus
Zhao Jun Zhang Xiugen Chen Puyan Cai Baoxiang
(College of Animal Medicine, Nanjing Agricultural University, Nangjing 210095)
Abstract A 1.8 kb fragment of Newcastle disease virus (NDV) haemagglutinin-neuraminidase (HN) gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with primers containing enzyme cleavage sites, and inserted into a nonessential gene of herpesvirus of turkey (HVT). Recombinant viruses were screened by Dot-blot hybridization with digoxigenin labelled probe and purified by plaque-formation technique. The expression of NDV HN gene can be detected by Western blotting in CEF cells infected with recombinant virus. Recombinant HVT strains were replicated stably in cell cultures.
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Key words NDV, HN gene, Recombinant HVT
新城疫病毒(NDV)是目前世界养禽业最重要的病原之一，给养禽业造成极大危害。该病毒引起一种主要侵害鸡和火鸡的急性、高度传播性疾病，导致鸡的严重呼吸困难和高死亡率。NDV是副粘病毒科腮腺炎病毒属成员，是一种具有囊膜、负链、不分节段的RNA病毒。病毒粒子包含两种囊膜蛋白：融合(F)蛋白和血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白。HN蛋白兼有血凝性和神经氨酸酶活性，它们分别负责病毒粒子与其细胞受体的起始吸附和受体破坏活性[1]。F蛋白参与病毒穿入、细胞融合和溶血等[2]，它们在决定病毒的毒力和免疫应答等方面起着极其重要的作用[3，4]，已相继在痘病毒[5]、禽痘病毒[6]、火鸡疱疹病毒[7]及杆状病毒[8]中得到表达，免疫学试验均显示良好的免疫原性。
, http://www.100md.com
HVT是最近发展起来的新型载体，由于对鸡及其它动物均无致病性，使用安全，接种鸡体后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症，且终生潜伏感染，可刺激机体产生较高的抗体水平并维持终生，接种一次即可获得终生免疫，同时HVT是预防马立克氏病(MD)的常规疫苗，因此，HVT作为构建禽用基因工程苗的载体，具有其它载体不可比拟的优点。目前，HVT已成为国内外研究病毒载体的热点，国外已成功地表达了多种禽病保护性抗原基因，国内在这方面的研究尚未见报道。本研究利用PCR技术对NDV强毒株Miyadera株HN基因进行人工修饰，利用HVT自身启动子成功地在我们新构建的HVT载体中(HVT载体的构建将另文报道)得到有效表达，为国内ND基因工程疫苗的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒和细胞
HVT FC126株，按常规方法在SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖，并从感染细胞中提取基因组总DNA，用于共转染实验。
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1.1.2 质粒与宿主菌
含NDV Miyadera株HN基因开放式阅读框的质粒M6B12，由中国农科院哈尔滨兽医研究所曹殿军博士惠赠；插入载体pTK2B由作者构建；pUC19和宿主菌JM109为本室保存。
1.1.3 工具酶及试剂
工具酶与兔抗鸡IgY-HRP结合物购自Promega公司，地高辛试剂盒购自宝灵曼公司。
1.1.4 PCR引物由中国科学院上海植物生理所合成。
1.2 方法
1.2.1 NDV HN基因的PCR扩增与克隆
1.2.1.1 PCR扩增 根据检索到的Miyadera株HN基因序列，利用Goldkey软件设计一对引物，恰能覆盖HN基因开放式阅读框，并分别在5′端加酶切位点Primer 1(32 mer):5′GGCAAAGCTTATCATGGACCGCACAGTTAACC3′; Primer 2(28 mer):5′TGAAGTCGACCCAGTTTGATTCTTGGCG3′。P1划线部分为Hind Ⅲ酶切位点，P2划线部分为SalⅠ酶切位点，前面为保护碱基。按常规方法进行PCR扩增。
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1.2.1.2 PCR扩增片段的克隆及鉴定 取适量PCR产物分别用HindⅢ和SalⅠ在相应buffer中进行双酶切，1%琼脂糖电泳，分离纯化1.8kb的条带。按常规方法克隆入pUC19中，将插入HN基因的重组体质粒命名为pHN。
1.2.2 表达NDV HN基因转移载体的构建
取适量pTK2B重组质粒用NheⅠ消化，加入dNTP和由pHN中分离、纯化的HN开放式阅读框，补平连接，转化于JM109中。挑取单个菌落，碱裂解法快速提取质粒，酶切后电泳鉴定HN基因是否插入及插入方向，符合要求者命名为pTKHN。
1.2.3 表达NDV HN基因的重组HVT的筛选与纯化
1.2.3.1 NDV HN基因探针的制备 取10～20μg含NDV HN基因的质粒pHN，用HindⅢ和SalⅠ充分消化，经低熔点琼脂糖回收1.8kb片段溶于适量水中，按试剂盒说明用地高辛标记。
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1.2.3.2 共转染和重组体HVT的筛选[9] 用磷酸钙沉淀法，将3μg BamHI线性化的pTKHN质粒DNA与20μg HVT总DNA一起转染新鲜制备的CEF细胞，37℃ 5%CO2培养6～7d，当出现大量细胞病变时，收获细胞，-20℃冻融3次，低速离心除去细胞碎片，上清作为检查重组病毒的材料，10倍递增稀释，分别感染于24孔培养板上已长成单层的CEF。当出现单个分散的病毒蚀斑时，覆盖营养琼脂，凝固后，翻转培养至出现大量单个病毒蚀斑。挑取单个蚀斑，于24孔培养板上扩大培养，当出现大量病变时，收获细胞，-20℃冻融3次，离心取上清，按常规方法进行斑点杂交试验。
1.2.4 SDS-PAGE电泳及Western blot分析
将杂交阳性的重组体分别感染CEF扩大培养。收获的感染细胞用裂解缓冲液裂解后，与等体积2×SDS凝胶加样缓冲液混合，煮沸10min，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色观察。
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将SDS-PAGE分离的蛋白转印到硝酸纤维素(NC)膜上，用1%BSA缓冲液(0.15mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl pH7.5)封闭2h，然后分别用鸡抗NDV高免血清(1∶100稀释)和HRP标记的兔抗鸡IgY(1∶2000稀释)室温作用2h。充分洗涤后，用DAB(二氨基联苯胺)和H2O2显色。
1.2.5表达NDV HN蛋白的重组体HVT的生长特性
将重组体HVT在CEF中连续传代10代以上，观察重组体HVT在CEF上的病变形态，并与亲本HVT病毒进行比较。
2 结果
2.1 PCR特异性扩增HN基因
采用1%琼脂糖电泳分析PCR产物，可见扩增产物在1.9kb和1.58kb之间出现单一的条带(图1)，表明我们的PCR方法特异地扩增了预定大小的靶片段。为了检查扩增片段两端所加酶切位点是否有效，我们对扩增片段进行了克隆。通过酶切和电泳分析表明所加酶切位点有效，对HN基因的人工修饰是成功的(图2)。对克隆阳性的重组质粒，用HindⅢ和SalⅠ酶切，能切出1.8kb的HN基因和2.69kb的pUC19载体两个片段，SalⅠ可将pHN线性化为4.49kb的片段。
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图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 PCR amplified products
eletrophoresed with 1% agarose gel
A:λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers
B: PCR amplified products
图2 pHN的酶切分析
Fig.2 Restriction pattern of pHN
A:λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers
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B:Digested with HindⅢ+SalⅠ
C:Digested with SalⅠ
2.2 含NDV HN基因转移载体的构建
将修饰过的HN基因平端插入pTK2B中的NheⅠ位点，通过筛选，获得两个重组质粒pTKHN1和pTKHN2。在pTKHN1中，HN基因的插入方向与TK基因转录方向相同；而在pTKHN2中，HN基因的插入方向与TK基因的相反。由于TK基因和HN基因中均各有一个EcoRI位点，故选择用HindⅢ、EcoRI双酶切鉴定HN的插入方向。当HN与TK同向时，可切出857bp、1.842kb、2.248kb及2.69kb四条带；当HN与TK反向时，可切出857bp、2.69kb和3.616kb和474bp四条带，在电泳时474bp条带看不出，故只呈现三条带(图3)。
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图3 pTKHN的酶切分析
Fig.3 Restriction pattern of pTKHN
2.3 斑点杂交筛选重组病毒
将重组转移载体与HVT总DNA共同转染CEF，等出现病变后，收获感染细胞，冻融后的上清进行有限稀释，再感染CEF，挑取单个蚀斑扩大培养。用病变CEF冻融后的上清进行斑点杂交筛选阳性重组体。结果表明用pTKHN1和pTKHN2转染的CEF中均分离到阳性重组体，分别命名为rHVT1和rHVT2(图4)。
图4 斑点杂交筛选阳性重组体结果
Fig.4 Dot-blot hybridization for the screening of recombinant
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A: rHVT1 hybridization B:Result of rHVT2 hybridization
2.4 HN蛋白的SDS-PAGE电泳和Western blot表达检测
将rHVT1和rHVT2及HVT的CEF接种物裂解后进行SDS-PAGE电泳，对比重组病毒和野生型病毒的电泳条带，差异不甚明显，但在Western blot分析中，重组病毒呈现特异性条带，分子量也与预计相符，约为66kD左右(图5)。
图5 HN基因表达产物的SDS-PAGE和Western blot
Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of expression product of HN gene
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A:High range protein molecular weight markers B:CEF cells infected with rHVT1;
C:CEF cells infected with rHVT2; D:CEF cells infected with HVT Fc126 strains
2.5 表达NDV HN蛋白的重组体HVT的生长特性
将rHVT1和rHVT2在CEF上连续传代，观察重组体在CEF上的病变形态，发现重组体HVT与亲本HVT在CEF上的病变形态相同，均表现折光性增强的细胞增多，相互聚集成葡萄串状。
3 讨论
3.1 新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白，在NDV的致病过程中起重要作用。已有的资料表明，HN基因的表达产物能诱导机体产生对NDV的抵抗力，因而HN蛋白和另一种融合(F)蛋白被作为重组疫苗中外源基因的首选对象。国外在这方面已有多篇报道，我国在这方面尚无报道。为了弥补这方面的不足和进一步考查我们所构建的HVT插入载体表达外源基因的能力，我们引进含有NDV强毒Miyadera株HN基因的重组质粒M6B12，以期在HVT系统中进行表达。由于重组质粒M6B12中的HN基因两端均存在非编码序列，我们利用Goldkey软件设计两个特异引物，通过聚合酶链反应(PCR)技术，扩增了1.8kb的HN基因开放阅读框架，成功地在HN基因起始密码子前和终止密码子后分别添加了一个HindⅢ和SalⅠ位点，从而为今后HN基因调出，尤其为构建HVT转移载体质粒提供了方便。
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3.2 将扩增的NDV HN基因插入到pTK2B的NheⅠ位点，得到两个重组转移载体质粒pTKHN1和pTKHN2。在pTKHN1中，HN基因的方向与TK基因的转录方向相同；而在pTKHN2中情况恰好相反。将pTKHN1和pTKHN2分别与HVT总DNA共转染CEF，利用斑点杂交方法，各筛选到一阳性重组体rHVT1和rHVT2。对两个重组体HVT进行Western blot分析，rHVT1和rHVT2均显示一条约66kD的蛋白带，表明二者均表达了NDV HN蛋白。这更进一步说明了HVT TK基因中的NheⅠ位点适于外源基因插入，同时从另一侧面也反映了HVT自身启动子能够启动外源基因表达。
3.3 将重组体rHVT1和rHVT2分别在CEF中连续传代，观察二者在CEF上的病变形态，发现与亲本HVT在CEF上的病变完全相同，说明插入外源HN基因后HVT自身生长特性没有变化。有关重组体在鸡体内的复制情况和所表达的HN蛋白的免疫原性研究均在进行中。
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参考文献
1 Scheid A, Choppin P W. Isolation and purification of the envelope proteins of Newcastle disease virus. J Gen Virol, 1973, 11:263～271
2 Nagai Y, Klenk H-D. Proteolytic cleavage of the viral glycoprotein and its significance for the virulence of Newcastle disease virus. Virology, 1976,72:494～508
3 Nagai Y, Shimokata K, Yoshida T et al. The spread of a pathogenic and an apathogenic strain of Newcastle disease virus in the chick embryo as depending on the protease senstivity of the virus glycoproteins. J Gen Virol, 1979,45:263～272
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4 Umino Y. Kohama T. Kohase M et al. Protective effect of antibodies to two viral envelope glycoproteins on lethal infection with Newacstle disease virus. Arch Virology, 1987, 94:97～107
5 Meulemans G, Letellier C, Gonze M et al. Newcastle disease virus glycoprotein expressed from a recombinant vaccinia virus vector protect chickens against live virus challenge. Avian Pathol, 1988,17:821～827
6 Boursnell M E G, Green P F, Samson A C R et al. A recombinant fowl pox virus expressing the hemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle disease virus (NDV) protects chickens against challenge by NDV. Virology, 1990, 178:296～300
, 百拇医药
7 Heckert R A, Riva J, Cook S et al. Onset of protective immunity in chicks after vaccination with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing Newcastle disease virus fusion and hemagglutinin-neuraminidase antigens. Avian Dis, 1996, 40:770～777
8 Nagy E, Derbyshire J B, Dobos P et al. Cloning and expression of NDV hemagglutinin-neuraminidase cDNA in a baculovirus expression vector system. Virology, 1990, 176:426～438
9 Morgan R W, Cantello J L, McDermott C H. Transfection of chicken embryo fibroblasts with Marek's disease virus DNA. Avian Dis, 1990, 34:345～351, 百拇医药
单位：南京农业大学动物医学院，南京210095
关键词：新城疫病毒；血凝素-神经氨酸酶(HN)基因；重组HVT
中国病毒学/990312 摘 要 应用聚合酶链反应技术，用设计带有限制性酶切位点的引物，特异地扩增从起始密码子开始的1.8kb新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因开放式阅读框，然后插入pTK2B的Nhe Ⅰ位点，构建了含NDV HN基因的插入载体 pTKHN1和pTKHN2，再与感染火鸡疱疹病毒(HVT)细胞的总DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，经有限稀释法和Dot-blot筛选，得到含有HN基因的重组体rHVT1和rHVT2。经组织培养传代和Western blot分析，表明重组体在感染细胞中表达了HN蛋白。重组体在CEF上的生长特性与亲本病毒相同，且在连续传代过程中保持稳定。为国内新城疫基因工程疫苗研制奠定了基础。
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Construction of a Recombinant Herpesvirus of Turkey Expressing
the Haemagglutinin-Neuraminidase Gene of Newcastle Disease Virus
Zhao Jun Zhang Xiugen Chen Puyan Cai Baoxiang
(College of Animal Medicine, Nanjing Agricultural University, Nangjing 210095)
Abstract A 1.8 kb fragment of Newcastle disease virus (NDV) haemagglutinin-neuraminidase (HN) gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with primers containing enzyme cleavage sites, and inserted into a nonessential gene of herpesvirus of turkey (HVT). Recombinant viruses were screened by Dot-blot hybridization with digoxigenin labelled probe and purified by plaque-formation technique. The expression of NDV HN gene can be detected by Western blotting in CEF cells infected with recombinant virus. Recombinant HVT strains were replicated stably in cell cultures.
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Key words NDV, HN gene, Recombinant HVT
新城疫病毒(NDV)是目前世界养禽业最重要的病原之一，给养禽业造成极大危害。该病毒引起一种主要侵害鸡和火鸡的急性、高度传播性疾病，导致鸡的严重呼吸困难和高死亡率。NDV是副粘病毒科腮腺炎病毒属成员，是一种具有囊膜、负链、不分节段的RNA病毒。病毒粒子包含两种囊膜蛋白：融合(F)蛋白和血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白。HN蛋白兼有血凝性和神经氨酸酶活性，它们分别负责病毒粒子与其细胞受体的起始吸附和受体破坏活性[1]。F蛋白参与病毒穿入、细胞融合和溶血等[2]，它们在决定病毒的毒力和免疫应答等方面起着极其重要的作用[3，4]，已相继在痘病毒[5]、禽痘病毒[6]、火鸡疱疹病毒[7]及杆状病毒[8]中得到表达，免疫学试验均显示良好的免疫原性。
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HVT是最近发展起来的新型载体，由于对鸡及其它动物均无致病性，使用安全，接种鸡体后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症，且终生潜伏感染，可刺激机体产生较高的抗体水平并维持终生，接种一次即可获得终生免疫，同时HVT是预防马立克氏病(MD)的常规疫苗，因此，HVT作为构建禽用基因工程苗的载体，具有其它载体不可比拟的优点。目前，HVT已成为国内外研究病毒载体的热点，国外已成功地表达了多种禽病保护性抗原基因，国内在这方面的研究尚未见报道。本研究利用PCR技术对NDV强毒株Miyadera株HN基因进行人工修饰，利用HVT自身启动子成功地在我们新构建的HVT载体中(HVT载体的构建将另文报道)得到有效表达，为国内ND基因工程疫苗的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒和细胞
HVT FC126株，按常规方法在SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖，并从感染细胞中提取基因组总DNA，用于共转染实验。
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1.1.2 质粒与宿主菌
含NDV Miyadera株HN基因开放式阅读框的质粒M6B12，由中国农科院哈尔滨兽医研究所曹殿军博士惠赠；插入载体pTK2B由作者构建；pUC19和宿主菌JM109为本室保存。
1.1.3 工具酶及试剂
工具酶与兔抗鸡IgY-HRP结合物购自Promega公司，地高辛试剂盒购自宝灵曼公司。
1.1.4 PCR引物由中国科学院上海植物生理所合成。
1.2 方法
1.2.1 NDV HN基因的PCR扩增与克隆
1.2.1.1 PCR扩增 根据检索到的Miyadera株HN基因序列，利用Goldkey软件设计一对引物，恰能覆盖HN基因开放式阅读框，并分别在5′端加酶切位点Primer 1(32 mer):5′GGCAAAGCTTATCATGGACCGCACAGTTAACC3′; Primer 2(28 mer):5′TGAAGTCGACCCAGTTTGATTCTTGGCG3′。P1划线部分为Hind Ⅲ酶切位点，P2划线部分为SalⅠ酶切位点，前面为保护碱基。按常规方法进行PCR扩增。
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1.2.1.2 PCR扩增片段的克隆及鉴定 取适量PCR产物分别用HindⅢ和SalⅠ在相应buffer中进行双酶切，1%琼脂糖电泳，分离纯化1.8kb的条带。按常规方法克隆入pUC19中，将插入HN基因的重组体质粒命名为pHN。
1.2.2 表达NDV HN基因转移载体的构建
取适量pTK2B重组质粒用NheⅠ消化，加入dNTP和由pHN中分离、纯化的HN开放式阅读框，补平连接，转化于JM109中。挑取单个菌落，碱裂解法快速提取质粒，酶切后电泳鉴定HN基因是否插入及插入方向，符合要求者命名为pTKHN。
1.2.3 表达NDV HN基因的重组HVT的筛选与纯化
1.2.3.1 NDV HN基因探针的制备 取10～20μg含NDV HN基因的质粒pHN，用HindⅢ和SalⅠ充分消化，经低熔点琼脂糖回收1.8kb片段溶于适量水中，按试剂盒说明用地高辛标记。
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1.2.3.2 共转染和重组体HVT的筛选[9] 用磷酸钙沉淀法，将3μg BamHI线性化的pTKHN质粒DNA与20μg HVT总DNA一起转染新鲜制备的CEF细胞，37℃ 5%CO2培养6～7d，当出现大量细胞病变时，收获细胞，-20℃冻融3次，低速离心除去细胞碎片，上清作为检查重组病毒的材料，10倍递增稀释，分别感染于24孔培养板上已长成单层的CEF。当出现单个分散的病毒蚀斑时，覆盖营养琼脂，凝固后，翻转培养至出现大量单个病毒蚀斑。挑取单个蚀斑，于24孔培养板上扩大培养，当出现大量病变时，收获细胞，-20℃冻融3次，离心取上清，按常规方法进行斑点杂交试验。
1.2.4 SDS-PAGE电泳及Western blot分析
将杂交阳性的重组体分别感染CEF扩大培养。收获的感染细胞用裂解缓冲液裂解后，与等体积2×SDS凝胶加样缓冲液混合，煮沸10min，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色观察。
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将SDS-PAGE分离的蛋白转印到硝酸纤维素(NC)膜上，用1%BSA缓冲液(0.15mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl pH7.5)封闭2h，然后分别用鸡抗NDV高免血清(1∶100稀释)和HRP标记的兔抗鸡IgY(1∶2000稀释)室温作用2h。充分洗涤后，用DAB(二氨基联苯胺)和H2O2显色。
1.2.5表达NDV HN蛋白的重组体HVT的生长特性
将重组体HVT在CEF中连续传代10代以上，观察重组体HVT在CEF上的病变形态，并与亲本HVT病毒进行比较。
2 结果
2.1 PCR特异性扩增HN基因
采用1%琼脂糖电泳分析PCR产物，可见扩增产物在1.9kb和1.58kb之间出现单一的条带(图1)，表明我们的PCR方法特异地扩增了预定大小的靶片段。为了检查扩增片段两端所加酶切位点是否有效，我们对扩增片段进行了克隆。通过酶切和电泳分析表明所加酶切位点有效，对HN基因的人工修饰是成功的(图2)。对克隆阳性的重组质粒，用HindⅢ和SalⅠ酶切，能切出1.8kb的HN基因和2.69kb的pUC19载体两个片段，SalⅠ可将pHN线性化为4.49kb的片段。
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图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 PCR amplified products
eletrophoresed with 1% agarose gel
A:λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers
B: PCR amplified products
图2 pHN的酶切分析
Fig.2 Restriction pattern of pHN
A:λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers
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B:Digested with HindⅢ+SalⅠ
C:Digested with SalⅠ
2.2 含NDV HN基因转移载体的构建
将修饰过的HN基因平端插入pTK2B中的NheⅠ位点，通过筛选，获得两个重组质粒pTKHN1和pTKHN2。在pTKHN1中，HN基因的插入方向与TK基因转录方向相同；而在pTKHN2中，HN基因的插入方向与TK基因的相反。由于TK基因和HN基因中均各有一个EcoRI位点，故选择用HindⅢ、EcoRI双酶切鉴定HN的插入方向。当HN与TK同向时，可切出857bp、1.842kb、2.248kb及2.69kb四条带；当HN与TK反向时，可切出857bp、2.69kb和3.616kb和474bp四条带，在电泳时474bp条带看不出，故只呈现三条带(图3)。
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图3 pTKHN的酶切分析
Fig.3 Restriction pattern of pTKHN
2.3 斑点杂交筛选重组病毒
将重组转移载体与HVT总DNA共同转染CEF，等出现病变后，收获感染细胞，冻融后的上清进行有限稀释，再感染CEF，挑取单个蚀斑扩大培养。用病变CEF冻融后的上清进行斑点杂交筛选阳性重组体。结果表明用pTKHN1和pTKHN2转染的CEF中均分离到阳性重组体，分别命名为rHVT1和rHVT2(图4)。
图4 斑点杂交筛选阳性重组体结果
Fig.4 Dot-blot hybridization for the screening of recombinant
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A: rHVT1 hybridization B:Result of rHVT2 hybridization
2.4 HN蛋白的SDS-PAGE电泳和Western blot表达检测
将rHVT1和rHVT2及HVT的CEF接种物裂解后进行SDS-PAGE电泳，对比重组病毒和野生型病毒的电泳条带，差异不甚明显，但在Western blot分析中，重组病毒呈现特异性条带，分子量也与预计相符，约为66kD左右(图5)。
图5 HN基因表达产物的SDS-PAGE和Western blot
Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of expression product of HN gene
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A:High range protein molecular weight markers B:CEF cells infected with rHVT1;
C:CEF cells infected with rHVT2; D:CEF cells infected with HVT Fc126 strains
2.5 表达NDV HN蛋白的重组体HVT的生长特性
将rHVT1和rHVT2在CEF上连续传代，观察重组体在CEF上的病变形态，发现重组体HVT与亲本HVT在CEF上的病变形态相同，均表现折光性增强的细胞增多，相互聚集成葡萄串状。
3 讨论
3.1 新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白，在NDV的致病过程中起重要作用。已有的资料表明，HN基因的表达产物能诱导机体产生对NDV的抵抗力，因而HN蛋白和另一种融合(F)蛋白被作为重组疫苗中外源基因的首选对象。国外在这方面已有多篇报道，我国在这方面尚无报道。为了弥补这方面的不足和进一步考查我们所构建的HVT插入载体表达外源基因的能力，我们引进含有NDV强毒Miyadera株HN基因的重组质粒M6B12，以期在HVT系统中进行表达。由于重组质粒M6B12中的HN基因两端均存在非编码序列，我们利用Goldkey软件设计两个特异引物，通过聚合酶链反应(PCR)技术，扩增了1.8kb的HN基因开放阅读框架，成功地在HN基因起始密码子前和终止密码子后分别添加了一个HindⅢ和SalⅠ位点，从而为今后HN基因调出，尤其为构建HVT转移载体质粒提供了方便。
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3.2 将扩增的NDV HN基因插入到pTK2B的NheⅠ位点，得到两个重组转移载体质粒pTKHN1和pTKHN2。在pTKHN1中，HN基因的方向与TK基因的转录方向相同；而在pTKHN2中情况恰好相反。将pTKHN1和pTKHN2分别与HVT总DNA共转染CEF，利用斑点杂交方法，各筛选到一阳性重组体rHVT1和rHVT2。对两个重组体HVT进行Western blot分析，rHVT1和rHVT2均显示一条约66kD的蛋白带，表明二者均表达了NDV HN蛋白。这更进一步说明了HVT TK基因中的NheⅠ位点适于外源基因插入，同时从另一侧面也反映了HVT自身启动子能够启动外源基因表达。
3.3 将重组体rHVT1和rHVT2分别在CEF中连续传代，观察二者在CEF上的病变形态，发现与亲本HVT在CEF上的病变完全相同，说明插入外源HN基因后HVT自身生长特性没有变化。有关重组体在鸡体内的复制情况和所表达的HN蛋白的免疫原性研究均在进行中。
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