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编号:10288186
抗癌新靶点:端粒及端粒酶抑制剂研究进展
http://www.100md.com 《世界华人消化杂志》 1999年第7期
     作者:郭 臻 杨善民

    单位:厦门大学抗癌研究中心 福建省厦门市 361005

    关键词:端粒酶;端粒结合蛋白;端粒

    世界华人消化杂志990719

    中国图书馆分类号 R979.1

    Subject headings telomerase; telomere binding proteins; telomere

    端粒酶在绝大多数恶性肿瘤中特异性表达,这使得人们对肿瘤的抗端粒酶疗法产生了特别的关注. 设想以端粒、端粒酶为靶点,通过抑制癌细胞端粒酶活性或直接抑制端粒延长、稳定,而使细胞无法连续增殖,继而进入衰老途径,直至死亡. 同时端粒、端粒酶在肿瘤细胞与正常体组织之间的差别又可以减少端粒、端粒酶抑制剂对机体的毒副作用. 现对端粒、端粒酶抑制剂研究进展予以分类介绍.
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    1 控制端粒延长靶点的物质

    目前对端粒的研究表明,端粒是真核生物染色体末端的特殊结构,包含若干的DNA双链重复序列,其末端为含多个G的单链DNA. 不同物种端粒的重复序列和长度是不一样的,但每种生物体有其特定的序列和平均长度[如人的端粒为(TTAGGG)n,大约在15kb左右]. 此外,端粒DNA上还结合有蛋白质,有两种结合形式:一种是结合于单链DNA;另一种则与端粒双链进行结合. 前者在端粒末端提供帽状结构以稳定端粒;后者可能直接参与端粒长度平衡的维持,是端粒延伸的负调节因子[1]. 目前所分离到的人端粒结合蛋白hTRF是一种双链结合蛋白,它参与维持端粒长度的稳定[2]. 改变端粒结构和功能的抑制剂介绍如下.

    1.1 改变端粒结构导致的端粒酶活性失常 端粒是由大量串联的重复序列组成的,其中一条链富含G,另一条富含C. 端粒合成时先由端粒酶将端粒重复序列加到富G链上去,再由DNA聚合酶合成富C链. 不同生物的端粒G链一般都采用紧实结构. 而在所有的结构中,G-四联体是理论上最稳定的结构,它除了可在两条DNA分子间形成外,还可以在含四段重复端粒序列单链DNA中形成. Zahler et al[3]考察了端粒DNA的不同折叠方式作为引物时对四膜虫端粒酶的影响. 他们发现端粒G-四联体结构启动端粒酶延伸端粒的效率最差,不能作为端粒酶的引物,另外,他们的进一步研究发现,端粒酶所需的引物可能不应有任何折叠. 折叠的端粒DNA结构由于无法作为引物与端粒酶RNA组分碱基配对、结合,或者改变了端粒引物从端粒酶解离的速度而影响端粒的延伸. 目前,所有已知生物的端粒都是在富G的那条链上由端粒酶进行端粒合成,因此,能促使或稳定端粒形成G-四联体结构的物质可能对癌症有潜在治疗意义. 在Zahler et al[3]的报道中指出体外生理浓度(20mmol/L)下的K+、Na+离子可以形成稳定G-四联体结构,以前者的效果更明显. Sun et al[4]应用经典的引物端粒酶延伸技术为手段进行实验,发现小分子化合物2,6—二酰胺蒽醌能抑制端粒酶活性,其IC50为23μmol/L,在约100μmol/L时几乎可以完全抑制端粒酶活性 他们用UV(ultraviolet spectroscopy)和1H-NMR(1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy)检测滴定结果,证明了该种物质对端粒酶的抑制是与端粒G-四联体结构直接相关的. 与此有关的细胞内抑制端粒酶作用正在研究之中. Fedoroff et al[5]也采用NMR的方法进行研究,报道了3,4,9,10-perylenetetracarboxylic diimide-based化合物结合G-四联体结构从而抑制端粒酶活性. 另外,Burger et al[6]最新的研究表明,早已被应用于临床的抗癌药物顺铂也是一种序列专一性的G-Pt-G交联剂,研究发现顺铂能抑制人睾丸肿瘤细胞中的端粒酶活性,这可能正是顺铂能有效治疗多种肿瘤的原因之一. 类似化合物还有炭花青Carbocynamine.
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    1.2 端粒结合蛋白与端粒活性抑制 关于端粒的延伸、加工机制有多种不同的假设模型,无论哪一种都认为,端粒结合蛋白(telomere binding proteins, TBPs)及其他一些附属因子在端粒长度的调节中起着不可或缺的作用. 它们或者通过影响端粒酶活性,或者通过直接对端粒进行加工、剪切来共同完成对端粒长度的调节[1]. 在对四膜虫单链TBPs的研究过程中发现,该α/β异二聚体蛋白质中α,β蛋白在体内都是磷酸化的;体外研究也表明,β亚基的磷酸化是随细胞周期而调节的. 这一磷酸化机制很可能在端粒酶延伸端粒的过程中起作用[1]. 另外,酵母的Rapl是目前研究最深入的一种端粒双链TBP,它在端粒的长度调节机制中的作用十分复杂,是通过与其他一些蛋白的相互作用来完成的[1]. 因此,设想以TBPs为靶点,通过抑制或调节TBPs及相关因子的活性来抑制端粒酶,缩短端粒,从而使肿瘤细胞死亡. 但目前尚未有关于人端粒结合蛋白特异性抑制物的报道.

    2 抑制端粒酶结构和功能靶点的物质
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    端粒酶是一种核糖核酸蛋白质复合物. 其RNA组分为端粒合成提供模板. 现认为,人的端粒酶RNA分为两个区与引物作用:一个是模板区,含有与引物互补的11个核苷酸5'-(CUAACCCUAAC)-3';另一个是锚定区,与引物的5'端相连,为DNA链向端粒酶外延伸提供路径[7],而端粒酶中的蛋白质则起催化反应合成的作用. 目前分离的人端粒酶蛋白质有两种,TPl含2627个氨基酸[8],可能介导端粒酶与端粒之间的相互作用;另一种是hEST2p,它可能是人端粒酶的催化亚基,对端粒酶活性的表达、调节具有重要意义[9].

    2.1 针对端粒酶RNA模板抑制端粒酶活性 Kanazawa et al[10]制备了以端粒酶RNA组分为靶点的榔头样核酶TeloRZ(a hammered ribozyme),试图通过实验搞清楚它是否可以抑制端粒酶. 结果表明:TeloRZ对他们所合成的含端粒酶RNA组分的一段核苷酸具有专一的剪切能力,它能在模板区的第一个5'-C↓U处剪切多核苷酸. 将TeloRZ加入到肝癌细胞株HepG2或Huh-7细胞提取物中,对两者的端粒酶均起抑制作用,且与剂量成正相关,在大约10μmol/L时就可以抑制大约90%的端粒酶活性. 另外,Wan et al[11]报道了具有更高生物稳定性的2'-O-甲基化榔头样核酶能在大约0.4μmol/L时抑制人神经胶质瘤U87-MG细胞中90%的端粒酶活性. 能降解端粒酶RNA组分的核酶有希望成为一种抗癌新药物.
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    Feng et al[12]在体外采用了与模板区互补的反义寡核苷酸来抑制端粒酶活性. 转染了反义hTR(human telomerase RNA)的HeLa细胞在经过23~26代倍增后,大部分细胞株(33株中的28株)进入危机期,端粒酶活性受到抑制,细胞开始死亡. Norton et al[13]设计了针对人端粒酶RNA模板区的反义硫代寡核苷酸(PS)和肽核苷酸(PNA),PNA能专一识别结合人端粒酶,并在从P mol/L~n mol/L的范围内达到IC50的抑制活性. 他们的实验证明PNA对端粒酶活性的抑制效力比其类似物硫代寡核苷酸PS高出10~50倍;而且后者对端粒酶是非序列选择性抑制,PNA对端粒酶抑制则是高专一性的. 最近,Pitts et al[14]则发现2'-O-甲基RNA能对细胞培养和实验动物产生专一性的影响,其抑制端粒酶的作用要超过肽核苷酸PNA. Glukhov et al[15]以黑色素瘤细胞株SK-Mel-28为对象,研究认为:互补于hTR模板区的反义核苷酸对端粒酶活性的抑制强于其他反义核苷酸,在5nmol/L时即可产生强烈抑制,而20nmol/L的样品可以完全抑制端粒酶活性. 这些研究结果显示了hTR反义寡核苷酸的良好应用前景.
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    2.2 针对端粒酶的逆转录酶性质抑制端粒酶活性 端粒酶实际上是一种特殊的专一逆转录酶. Strahl et al[16]以人B细胞系的JY616细胞和T细胞系的Jurkat E6-1细胞(这两种细胞均表现端粒酶活性)为研究对象,考察已知的反转录病毒逆转录酶抑制剂是否会影响这些细胞的端粒长度和培养时的生长速率. 实验表明,ddG可以使分裂细胞的端粒发生复制性的逐渐缩短,并稳定在较短状态. azidothymidine (AZT)也可以使部分细胞的端粒逐渐缩短. Yegorov et al[17]的类似实验表明,在逆转录酶抑制剂AZT和Carbovir存在下,鼠的胚胎成纤维细胞可以自发转化形成无端粒酶的克隆,发生类似于衰老的过程. 但这一抑制过程是可逆的 ,AZT,ddG这些逆转录酶抑制剂可能是通过优先占据端粒酶的核苷酸结合位点而抑制了端粒合成.

    2.3 针对端粒酶促反应底物抑制端粒酶活性 端粒酶作为一种末端转移酶,它把脱氧核苷酸加到端粒的末端上从而延长端粒. Fletcher et al[18]的实验表明7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP会抑制端粒酶活性. 7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP分别在11μmol/L和8μmol/L时可以抑制人胚肾293细胞株中50%的端粒酶活性. 二者可以被端粒酶加入到端粒DNA中去,但因不是端粒酶的正确、高效底物而抑制了端粒酶的活性,导致端粒提前成熟(pre-maturing),表现为缩短的端粒,提示N7对于端粒酶活性可能是必须的. 这一模型可以用来研究DNA二级结构在端粒酶机制中的作用,同时又为设计新的端粒酶抑制剂提供了一个可供参考的思路.
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    2.4 针对端粒酶的DNA锚着区抑制端粒酶活性 端粒酶以锚着区与作为引物的端粒DNA的5'端结合,继而延伸端粒. 通过破坏端粒酶的DNA锚着区可抑制端粒酶进行端粒合成,使肿瘤细胞端粒缩短而死亡[19]. 但目前尚未有关于此类物质的报道.

    2.5 磷酸酯酶2A对端粒酶活性的抑制 Li et al[20]以人乳腺癌细胞PMC42为研究材料,发现磷酸酯酶2A(PP2A)与受试肿瘤细胞核提取物共温育时能够显著抑制其端粒酶活性. 这种效应呈浓度依赖性(ED50为10U±2U),并且非常迅速(10s即出现显著抑制,2min时出现完全抑制). 但PP2A与受试细胞膜提取物共温育时对其端粒酶活性的抑制稍弱一些,与细胞质共温育时则基本不抑制其端粒酶活性. 此外,PP2A对核端粒酶活性的抑制作用可能是专一的,因为蛋白磷酸酯酶1或2B都不影响端粒酶活性. Li et al用PP2A的催化抑制剂okadaic acid证明了PP2A诱导的端粒酶抑制是与蛋白去磷酸化有关的. 最近Sogawa et al[21]发现了一种从海洋微球藻中分离出来的胞外多糖也具有抑制K562细胞中端粒酶活性的能力,实验表明,当K562细胞与该多糖共培养时,蛋白磷酸酯酶1的催化亚基PP1γ1的表达下降. 这些实验表明,某些端粒酶的蛋白质组分或端粒酶调节因子的磷酸化、去磷酸化对于癌症细胞的端粒合成是具有重要意义的.
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    2.6 PKC抑制剂对端粒酶活性的抑制 Ku et al[22]以培养的鼻咽癌细胞NPC-076为研究对象,发现有2种蛋白激酶(PKC)抑制剂bisindoplylmaleimideⅠ和H-7能够显著抑制受试细胞中的端粒酶活性;而另外2种PKC抑制剂中,Staurosporine能中度抑制端粒酶活性,神经鞘氨醇则仅轻微抑制. 此外,在实验中还观察到,处理后的细胞大部分仍是可养活的(超过75%),且维持了相当高水平的蛋白质合成能力. 这一发现为研究端粒酶机制以及癌症的端粒酶疗法提供了新的思路.

    2.7 一些小分子化合物对端粒酶活性的抑制 Perry et al[23]报道了1,4-和2,6-双取代氨基蒽-9,10-dione衍生物对端粒酶和Taq酶活性的抑制,如氮己环抑制端粒酶活性的IC50值为4μmol/L~11μmol/L,它在目前已知的非核酸端粒酶抑制剂中显示出较强效力. 另外,Maasani et al[24]的实验表明,茶叶中的主要儿茶酚(catechin)成分—epigallocatechin的没食子酸盐能够直接强烈抑制端粒酶活性,这可能是茶叶抗癌效果的主要机制之一. Bare et al[25]以铕标记探针和瞬时荧光(time-resolved fluorescence)的新方法对125000种化合物进行筛选,确定了一系列含isothiazolone的端粒酶抑制剂,其中最具效力的物质在次微摩尔水平就可达IC50值. 最近的研究还表明DMSO能可逆抑制端粒酶活性.
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    3 结语

    端粒、端粒酶已成为当今最引人注目的抗肿瘤治疗新靶点之一,近来的一些研究表明,端粒酶抑制剂不但可以直接导致肿瘤细胞的死亡,还可以提高肿瘤细胞对破坏DNA的抗肿瘤药的敏感性以及对凋亡的感受性(U251-MG细胞)[26],这一结果使得端粒酶抑制剂的应用前景更加看好. 虽然对于这种疗法并非全无顾虑,比方说担心端粒酶抑制剂会对干细胞和生殖细胞造成不利影响,以及担心端粒酶抑制剂的使用可能会诱发非端粒酶的端粒延长途径等. 但就目前的知识来看,对前者的忧虑可以通过设计疗程而得到某种程度的避免(但也有个别报道说肿瘤细胞的端粒并不都比干细胞短),而对后者的担心则还需通过实验的证明以及进一步的实验来解决.

    可以肯定的是,对端粒酶抑制剂的寻找和研究工作要依赖于对端粒、端粒酶的研究. 伴随着对端粒、端粒酶结构功能和调节机制研究的不断深入,对端粒酶抑制剂的研究也一定会越来越深入. 但从目前的研究来看,对端粒酶抑制剂的研究大多尚处于体外细胞实验阶段,体内药理作用及药代动力学情况究竟如何鲜有报道. 端粒酶抑制剂应用于临床时的效果及毒副作用也还需要事实的进一步验证.
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    通讯作者 郭臻

    4 参考文献

    1 Greider CW. Telomere length regulation. Annu Rev Biochem, 1996;65:337-365

    2 Chong L, Steensel BV, Broccoli D. A human telomeric protein. Science, 1995;270:1663-1667

    3 Zahler AM, Williamson JR, Cech TR, Prescott DM. Inhibition of telomerase by G-quartet DNA structure. Nature, 1991;350:718-720

    4 Sun D, Thompson B, Cathers BE, Salazar M, Kerein SM, Trent JO. Inhibition of human telomerase by a G-quadruplex-interactive compound. J Med Chem, 1997;40:2113-2116
, http://www.100md.com
    5 Fedoroff OY, Salazar M, Han HY, Chemeris VV, Kerwin SM, Harley LH. NMR-based model of telomerase-inhibiting compound bound to G-quardruplex DNA. Biochem, 1998;37:12367-12374

    6 Burger AM, Double JA, Newell DR, Inhibition of telomerase activity by cisplatin in human testicular cancer cells. Eur J Cancer, 1997;33:638-644

    7 Autexier C, Pruzan R, Funk WD, Greider CW. Reconstition of human telomerase activity and identification of a minimal function region of the human telomerase RNA. EMBO J, 1996;15:5928-5935
, 百拇医药
    8 Harrington L, McPhail T, Mar V, Zhou W, Oulton R, Bass MB, Arruda I, Robinson MO. A mammalian telomerase-associated protein. Science, 1997;275:973-977

    9 Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, Ellisen LW, Steiner P, Caddle SD, Ziaugra L, Beijersbergen RL, Davidoff MJ, Liu QY, Bacchetti S, Haber DA, Weinberg RA. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell, 1997;90:785-795
, 百拇医药
    10 Kanazawa Y, Ohkawa K, Ueda K, Mita E, Takehara T, Sasaki Y, Kasahara A, Hayashi N. Hammerhead ribozyme-mediated inhibition of telomerase activity in extracts of human hepatocellular cells. Biochem Biophs Res Commun, 1996;225:570-576

    11 Wan MSK, Fell PL, Akhtar S. Synthetic 2' -O-methyl-modified hammerhead ribozymed targeted to the RNA component of telomerase as sequence-specific inhibitors of telomerase activity. Antisense & Nucleic Acid Drug Develop, 1998;8:309-317
, 百拇医药
    12 Feng J, Funk WD, Wang SS, Weinrich SL, Avilion AA, Chiu CP, Adams RR, Chang E, Allsopp RC, Yu JH, Le S, West MD, Harley CB, Andrews WH, Greider CW, Villeponteau B. The RNA component of human telomerase. Science, 1995;269:1236-1241

    13 Norton JC, Piatyszek MA, Wright WE, Shay JW, Corey DR. Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids. Nature Biotech, 1996;14:615-619

    14 Pitts AE, Corey DR. Inhibition of human telomerase by 2'-O-methyl-RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1998;95:11549-11554
, http://www.100md.com
    15 Glukhov AI, Zimnik OV, Gordeev SA, Severin SE. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides. Biochem Biophys Res Commun, 1998;248:368-371

    16 Strahl C, EH Blackburn. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase activity in two immortalized human cell lines. Mol Cell Biol, 1996;16:53-65

    17 Yegorov YE, Chemov DN, Akimov SS, Bolsheva NL, Krayevsky AA, Zelenin AV. Reverse transcriptase inhibitors suppress telomerase function and induce senescence-like processes in cultured mouse fibroblasts. FEBS Lett, 1996;389:115-118
, 百拇医药
    18 Fletcher TM, Salazar M, Chen SF. Human telomerase inhibition by 7-deaza-2'-deoxypurine nucleoside trisphosphates. Biochem, 1996;35:15611-15617

    19 Melek M, Greene EC, Shippen DE. Processing of nontelomeric 3'ends by telomerase: default template alignment and endonucleolytic cleavage. Mol Cell Biol, 1996;16:3437-3445

    20 Li H, Zhao LL, Funder JW, Liu JP. Protein phosphatase 2A inhibits nuclear telomerase activity in human breast cancer cells. J Biol Chem, 1997;272:16729-16732
, 百拇医药
    21 Sogawa K, Sumida T, Hamakawa H. Inhibitory effect of a marine microalgal polysaccharide on the telomerase activity in K562 cells. Res Mol Pathol, 1998;99:259-265

    22 Ku WC, Cheng AJ, Wang TCV. Inhibition of telomerase activity by PKC inhibitors in human nasopharyngeal cancer cells in culture. Biochem Biophys Res Commun, 1997;241:730-736

    23 Perry PJ, Gowan SW, Reszka AP, Polucci P, Jenkins TC, Kelland LR, Neidle S. 1, 4-and 2, 6-disubstituted midoanthracene-9, 10-dione derivatives as inhibitors of human telomerase. J Med Chem, 1998;41:3252-3260
, 百拇医药
    24 Maasani I, Seimiya H, Tsuruo T. Telomerase inhibition, telomerase shortening, and senescence of cancer cells by tea catechins. Biochem Biophs Res Commun, 1998;249:391-396

    25 Bare LA, Trinh L, Wu S, Devlin JJ. Identification of a series of potent telomerase inhibitors using a time-resolved fluorescence-based assay. Drug Develop Res, 1998;43:109-116

    26 Kondo S, Tanaka Y, Kondo Y, Haqqi T, Barna BP, Cowell JK. Inhibition of telomerase increase the susceptibility of human malignant glioblastoma cells to cisplatin-induced apoptosis. Oncogene, 1998;16:2243-2248

    收稿日期 1999-03-06 修回日期 1999-04-28, 百拇医药