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编号:10288249
抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体细胞株的建立
http://www.100md.com 《卫生研究》 2000年第1期
     作者:李燕俊 韩春卉 张靖 罗雪云

    单位:李燕俊(卫生部食品卫生监督检验所,北京 100021);韩春卉(卫生部食品卫生监督检验所,北京 100021);张靖(卫生部食品卫生监督检验所,北京 100021);罗雪云(卫生部食品卫生监督检验所,北京 100021)

    关键词:黄曲霉毒素M1;单克隆抗体

    摘要摘要:本研究建立了抗黄曲霉毒素AFM1的单克隆抗体细胞株。用AFM1-肟-牛血清白蛋白(AFM1-oxime-BSA)偶联物免疫Ba1b/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经3~4次亚克隆建立了3个稳定分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3G2,3G3,6G8。3株抗体均属IgG1亚类。培养上清液的稀释度为1∶2 000~1∶12 800,腹水的抗体稀释度为1∶3.2×106~1∶20×107,参考工作稀释度为1∶1×106~1∶2.5×106。3G3和6G8抗体的IgG含量分别为0.8和1.43 g/L,亲和常数分别为5.438和4.369。6G8抗体与其它类型黄曲霉毒素均无交叉反应。
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    中图分类号:R155.51 TS207.4 文献标识码:B

    文章编号:1000-8020(2000)01-0059-03

    Establishment of monoclonal antibodies against aflatoxin M1

    Li Yanjun,Han Chunhui,Zhang Jing,Luo Xueyun

    (Institute of Food Safety Control and Inspection,Ministry of Health,Beijing 100021,China)

    Abstract:The monoclonal antibodies against aflatoxin M1 were established.Spleen cells from Balb/c mice immunized with AFM1-oxime-BSA conjugate were fused with murine Sp2/0 myeloma cells.Three hybridoma cell lines secretine monoclonal antibodies against AFM1 were established after the fusion cells subcloned for 3~4 cycles.These antibodies were disignated as 3G2,3G3 and 6G8,respectively.All of them belonged to the subtype of IgG1.The titres of the antibody in ascites ranged from 1∶3.2×106~1∶20×106。There was no cross reaction between 6G8 monoclone antibody and other types of aflatoxin.
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    Key words:aflatoxin M1, monoclonal antibody

    黄曲霉毒素M1(AFM1)是动物摄入黄曲霉毒素B1(AFB1)后的代谢产物,以在动物乳中最为常见,乳与乳制品中的AFM1在生产和贮藏期间相对稳定,用巴氏消毒法难以破坏[1]。AFM1的急性毒性与AFB1大致相同,也具有致突变性和致癌性[2]。我国于1988年规定了牛乳中AFM1的允许限量标准为0.5μg/kg,乳制品按含牛乳量折算。由于AFM1的危害,国内外均有降低其限量标准的趋势。目前我国的国标方法是薄层色谱法,该法用目测半定量,已不适应需要,且需大量接触标准品,不利于保护操作者的健康。为此我们建立了免疫检测方法,即建立在单克隆抗体基础上的ELISA法,本法具备简单、快速、高灵敏度、高特异性、可同时检测大量样品等多项优点,值得在我国推广。
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    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    AFM1-oxime-BSA偶联物、AFM1、AFM2、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、HAT及HT选择性培养基、HEPES、8-氮杂鸟嘌呤、降植烷(pristane)、福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DMSO)、吐温20(Tween20)、聚乙二醇(PEG,MW 1000)、抗体亚类分型试剂(IgM、IgG、IgA、IgD、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)、3,3’,5,5’-四甲基联苯氨(TMB)、蛋白分子量标准(中范围)均购自Sigma公司。牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司、RPMI 1640培养基和新生小牛血清(杭州四季青公司购自邦定医学公司)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自中山试剂公司。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0由中国预防医学科学院微生物学流行病学研究所惠赠,经传代并经8-氮杂鸟嘌呤处理。Balb/c小鼠、昆明小鼠均购自中国医学科学院实验动物研究所动物繁育场。
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    1.2 实验方法

    1.2.1 免疫动物及细胞融合 对8周龄雌性Balb/c小鼠(体重18~22g),首次免疫用100μgAFM1-oxime-BSA与等量福氏完全佐剂混匀,腹腔注射。3周后第一批用10μgAFM1-oxime-BSA脾内注射,3天后取脾融合。第二批再用100μgAFM1-oxime-BSA与等量福氏不完全佐剂混匀后,腹腔注射追加免疫,3周后用10μg AFM1-oxime-BSA脾内注射,3天后按常规方法取脾融合。当镜检杂交瘤克隆生长达1/3~1/2视野时,取上清液进行筛选。

    1.2.2 杂交瘤筛选及抗体检测 以AFM1-oxime-BSA为包被抗原,用间接非竞争性ELISA法筛选分泌抗AFM1抗体的细胞孔,用毒素间接竞争抑制性ELISA法确证。以免疫小鼠的血清为阳性对照,以Sp2/0细胞培养的上清液为阴性对照,阳性细胞孔的判定标准为(A试验—A空白)/(A对照—A空白)≥2.1。
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    1.2.3 杂交瘤细胞的克隆化 采用培养瓶内准确计数稀释法[3],将阳性克隆细胞吹匀,取一微滴至培养瓶内,倒置显微镜下准确计数细胞个数,稀释为70个/ml,再取1ml稀释20倍,接种入96孔培养板中进行亚克隆。直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止。

    1.2.4 单克隆抗体的生产 采用动物体内诱生单克隆抗体的方法。吹打培养的杂交瘤细胞,1000r/min离心10min,弃上清,用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀,并将细胞数调至2×106/ml,每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml杂交瘤细胞,并同时于对侧腹腔注射0.5ml降植烷和不完全福氏佐剂混合物(1∶1混合),10~14天后收集腹水。

    1.2.5 单克隆抗体的纯化 采用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化[4],对文献方法略加改进。

    1.3 单克隆抗体的鉴定
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    抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用双向免疫扩散法[5]。抗体的IgG含量采用紫外分光光度法测定。抗体的分子量测定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法[6]。抗体滴度测定以AFM1-oxime-BSA为包被抗原,从1∶100倍开始将抗体进行倍比稀释,以Sp2/0细胞培养上清为阴性对照,用间接非竞争性ELISA方法测定抗体滴度。以(A试验—A空白)/(A对照—A空白)≥2.1的最大稀释倍数为滴定终点。抗体亲和力的测定系采用间接非竞争性ELISA法,即测定各抗体的亲和常数[6]。抗体特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性ELISA法进行测定,参试毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M2和载体蛋白BSA。

    2 结果
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    2.1 单克隆抗体的制备

    用AFM1-oxime-BSA免疫Balb/c小鼠获得了较好的免疫应答。共进行了四次成功的细胞融合,经三步试验筛选,并用间接竞争性ELIS确证,从中选择对AFM1有强抑制而对对照孔阳性较强的细胞,经3~4次亚克隆,建立了稳定分泌抗AFM1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3G2,3G3,6G8,半年内对获得的细胞株进行多次冻融,其分泌抗体的能力和稳定性均无改变。

    2.2 单克隆抗体的鉴定

    应用已获得的3株细胞制备了大量的腹水,3株抗AFM1的抗体均为IgG1亚类,其各项指标如附表所示。其中3G3抗体对AFM1最为敏感,其次为6G8抗体。此2株抗体和载体蛋白BSA及AFM2均无交叉反应,且6G8抗体与AFB1、AFG1也无交叉反应。
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    附表 单克隆抗体的特点(1)

    杂交瘤 细胞系

    抗体亚类

    分子量

    (KD)

    IgG含量

    (g/l)

    培养上清

    稀释度

    腹水稀释度

    参考工作

    稀释度

, http://www.100md.com     亲和常数

    (k)

    3G2

    IgG1

    -

    -

    1∶2000

    1∶3.2×106

    1∶1×106

    -

    3G3

    IgG1
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    -

    0.8

    1∶3200

    1∶2×107

    1∶2.5×106

    5.438

    6G8

    IgG1

    68

    1.43

    1∶12800

    1∶2×107
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    1∶1×106

    4.369

    杂交瘤

    细胞系

    敏感范围

    (ng/ml)

    线性范围

    (ng/ml)

    50%抑制

    浓度(ng/ml)

    与AFM2

    交叉
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    与AFB1

    AFG1交叉

    与AFB2

    AFG2交叉

    与载体

    BSA交叉

    3G2

    -

    -

    -

    -

    -
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    -

    不交叉

    3G3

    0.1~500

    2~200

    10.4

    不交叉

    交叉

    不交叉

    不交叉

    6G8

    1.0~500

    5~100
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    16.2

    不交叉

    不交叉

    不交叉

    不交叉

    注:(1)—:未作此项实验

    3 讨论

    AFM1是黄曲霉毒素B1在动物体内的主要衍生物,具有与AFM1相同的毒性,可致动物肿瘤。国内外的资料均提示AFM1的污染广泛,因而有必要建立敏感性好、特异性强、简便快速的免疫检测方法。

    本次研究中采用了2种免疫方案,即1次基础免疫后追加脾内免疫和2次基础免疫后追加脾内免疫。经过实验对照,2种方法的融合率和阳性克隆率无明显差别,故从缩短实验周期考虑,一次基础免疫后追加脾内免疫完全可满足激活动物免疫应答的需要。
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    经典的单克隆抗体制备中,细胞克隆化技术多采用有限稀释法,需要进行系列稀释,操作繁琐,对细胞计数的要求也较高,工作量大,需要的克隆轮次较多。本实验中采用了培养瓶内准确计数细胞稀释法,提高了实验效率,减少了克隆轮次,在较短的时间内,得到了分泌目标单克隆抗体的细胞株。

    传统的腹水法生产单克隆抗体,需在腹腔注射杂交瘤细胞株一周前先用降植烷处理小鼠,灭活腹腔巨噬细胞,以增加腹水含量。本研究在腹腔注射杂交瘤细胞株的同时,在对侧腹腔注射降植烷和福氏不完全佐剂的混合液,效果良好,一次约可采取6~7ml腹水,简化了实验步骤。

    黄曲霉毒素在自然界中有许多衍生物。由于其结构极其相似,建立在多克隆抗体基础上的AFM1检测方法多与其它黄曲霉素发生交叉反应,而使其应用价值降低[7,8]。应用目前经典的单克隆抗体技术,也很难制备针对这种微小差别的特异性抗体,我国尚未能成功制备分泌抗AFM1的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株,仅由上海细胞生物学研究所报道制备了5株分泌抗AFM1的大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株,并且该抗体与黄曲霉素B1有严重的交叉反应[9]。本研究制备了3株分泌抗AFM1的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株3G2、3G3和6G8,并测定了3G3、6G8抗体与其它黄曲霉毒素的交叉反应情况,其中3G3抗体与黄曲霉毒素B1,G1有交叉反应,6G8抗全则与其它黄曲霉毒素均无交叉反应,因而采用6G8抗体建立的ELISA方法可确保具有高度的特异性。
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    基金项目:卫生部科研基金项目(No.94-1-074)

    作者简介:李燕俊,女,硕士,助理研究员

    参考文献

    1,Heish DP.Cancer risks posed by aflatoxin M1.Princess Takamatsu Symp 1985,16:57—65

    2,Bujons J.Aflatoxin M1 8,9-epoxide:preparation and mutagenic activiy.Chemica Research of Toxicology.1995,8(3):328—32

    3,马世兴.准确快速的细胞克隆化实验研究.单克隆抗体通讯,1993,9(2):70—72
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    4,徐志凯.实用单克隆抗体技术.西安:陕西科学技术出版社,1991:125

    5,J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯著.分子克隆实验指南.金冬雁,等译.第2版.北京:科学出版社,1996,880—887

    6,万文徽.单克隆抗体亲和常数的测定.单克隆抗体通讯,1993,9(2):72—75

    7,Jackman.Determination of aflatoxins by enzyme-linked immunosorbent assay with special reference to afiatoxin M1 in raw mild. J Food Agri,1985,36:685—698

    8,WHO. Prodution and characterization of antibody against aflatoxin M1.Experientia,1979,35:1104—1107

    9,季永镛.分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株的建立及其特性的研究.生物工程学报,1992,8(2):150—156

    (1999-07-19收稿), 百拇医药