IGF1R在介导IGF1促糖代谢过程中的作用研究
http://www.100md.com
中国糖尿病杂志 2000年第3期第8卷 论著
北京基础医学研究所 邮政编码 100850 刘宝英 薛沿宁 聂尚海 杜清友 丁红梅 王会信
关键词：受体；胰岛素抗性细胞；基因转染
摘要：
中国糖尿病杂志000309 摘要 目的 研究胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)在介导IGF1促糖代谢过程中的作用。方法 建立胰岛素抗性细胞模型、IGF1R封闭细胞模型和IGF1R高表达细胞模型，检测IGF1对这3个细胞模型的促糖代谢作用。结果 ①IGF1对胰岛素抗性细胞的促糖代谢效应没有被阻抑。②IGF1对IGF1R封闭细胞的降糖效应得到了明显的阻抑。③IGF1R的高表达，大大增强了IGF1的促糖代谢效应。结论 IGF1R在IGF1的促糖代谢过程中起着十分重要的作用。
The study of IGF1R on mediating the glucose metabolism of IGF1
, http://www.100md.com
Liu Baoying,Xue Yanning,Nie Shanghai,et al
(Institute of Beijing Basic Medical Sciences,Beijing 100850)
Abstract Objective To study the effect of insulin-like growth factor 1 (IGF1) on glucose metabolism mediated by IGF1 receptor (IGF1R).Methods We constructed insulin resistant cell model,antibody blocking cell model,IGF1R high-expressed cell model and tested the metabolic effect of IGF1 on these three cell models.Results ①The metabolic effect of IGF1 on insulin-resistant cell was not inhibited.②The hypoglycemic effect of IGF1 on IGF1R blocked cell by its antibody was apparently inhibited.③IGF1's hypoglycemic effect on IGF1R high-expressed cell was greatly improved.Conclusion IGF1R played an important role in glucose metabolism of IGF1.
, 百拇医药
Key words Receptor Insulin resistant cell Gene transfection
近年来，有关胰岛素样生长因子1(IGF1)在临床方面的研究不断增多。有证据表明：IGF1可以作为胰岛素在1型糖尿病治疗中的辅助用药，并可明显改善对胰岛素抗性的2型糖尿病病人的代谢状态[1]。IGF1既可以通过IGF1受体(IGF1R)，又可以通过胰岛素受体(IR)起作用。过去人们认为：IGF1的促生长作用主要通过IGF1R，而代谢调控功能是通过IR起作用的。但是在有些情况下，如胰岛素抵抗的代谢状态，可以通过IGF1作用于它本身受体得以纠正。本研究旨在探索在细胞水平上，IGF1R在介导IGF1促糖代谢过程中的作用。
材料和方法
一、材料
1.质粒与细胞株：pCVN-IGF1R重组质粒为Dr.Renato Baserga惠赠。NIH3T3成纤维细胞与HepG2肝肉瘤细胞为本室保存。
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2.试剂：rhIGF1为本室基因工程产品，IGF1R单克隆抗体为Santa Cruz产品，胰岛素、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替吡啉(4-AAP)、N-乙基-N-硫丙基甲苯兰(TOPS)均为Sigma产品，G418、lipofectin为Gibico产品。
二、方法
1.细胞代谢测定：GOD-POD法。将IGF1按3倍梯度稀释接种于96孔板中，然后将对数生长期的NIH 3T3/HepG2细胞消化，重悬于低糖无血清培养基，其成分为：葡萄糖含量为1.0mg/ml的DMEM，10mmol/L Hepes，2mmol/L谷氨酰胺，10μg/ml转铁蛋白，1mg/ml BSA，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。按4×104细胞/孔和2×104细胞/孔接种NIH3T3细胞和HepG2细胞，37℃培养22小时后，加50μl生色液(0.4U/ml葡萄糖氧化酶，0.68U/ml过氧化物酶，360μg/ml 4-AAP，490μg/ml TOPS，溶于pH6.0的PBS缓冲液中)，反应30分钟。反应结束后，在波长为595nm下用酶联仪测定光吸收。
, 百拇医药
2.胰岛素抗性细胞的诱导[2]：先将处于对数生长期的HepG2用无血清的DMEM洗两次，并在此培养基中37℃孵育5小时，然后用高浓度胰岛素(5×10-7mol/L)37℃继续孵育16小时。在测糖代谢试验前，用新鲜的无胰岛素的DMEM洗两次，20分钟/次。
3.抗体封闭试验：将IGF1R单克隆抗体按3倍稀释，与IGF1同时接种，测定细胞糖代谢效应。
4.基因转染：用脂质体转染试剂介导，将pCVN-IGF1R及对照质粒pCVN转染NIH3T3细胞，见操作手册。用G418筛选1个月，挑取单克隆，放大培养。
5.免疫印迹：按常规方法进行[3]。
结 果
一、IGF1对胰岛素抗性的HepG2细胞糖代谢效应的影响
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图1 胰岛素(A)和IGF1(B)的促糖代谢作用
IGF1对胰岛素抗性的HepG2细胞糖代谢效应见图1。高剂量胰岛素诱导HepG2细胞，造成细胞对胰岛素抵抗(图1A)。但是IGF1对这种胰岛素抗性细胞的促糖代谢效应没有被阻抑(图1B)，说明IGF1与胰岛素的作用机制并不是完全相同的。另外我们还发现，IGF1对抗性细胞的降糖效应比对正常细胞的作用增强，这有可能是由于IR脱敏后，作用于IGF1R的IGF1浓度相对增高而引起的。
附表 IGF1及其IGF1R单克隆抗体对HepG2细胞培养基葡萄糖相对含量的影响(
±s)
IGF1R抗体浓度(ng/ml)
0
, http://www.100md.com 0.6
1.8
-IGF1
100
97.7±1.1
96.2±2.2
+IGF1
85.4±0.4
92.5±1.7
94.5±0.2
* P<0.01
, 百拇医药
图2 NIH3T3细胞裂解液的Western Blot图谱
1：NIH3T3细胞；2.转染pCVN的细胞；3：转染
pCVN-IGF1R的细胞(蛋白上样量为40μg)
二、IGF1R单克隆抗体封闭HepG2细胞的糖代谢效应
为了验证IGF1R在IGF1的促糖代谢过程中是否发挥作用，我们采用IGF1R单克隆抗体封闭受体，然后观察IGF1的促糖代谢效应，结果见附表。单独用IGF1(1.37μg/ml)作用于HepG2细胞，降糖作用明显，但是，在此基础上，同时加入不同浓度的IGF1R单克隆抗体。我们发现：IGF1的降糖作用得到了明显的阻抑，与只加IGF1而不加抗体的降糖效果相比，有显著性差异，P<0.01。IGF1R单克隆抗体是针对IGF1R的α链，它可以抑制IGF1与其受体的结合，与胰岛素受体和IGF2R无交叉反应。因此实验表明，IGF1R在IGF1促糖代谢过程中发挥作用。
, 百拇医药
三、IGF1对IGF1R高表达细胞株的糖代谢效应
我们利用基因转染技术，构建了高表达IGF1R的NIH3T3细胞株。通过PCR扩增、RNA点杂交(结果未列出)和蛋白免疫印迹(图2)，均已证明了我们构建的IGF1R高表达细胞株是成功的。
然后，我们观察IGF1对IGF1R高表达NIH3T3细胞的促糖代谢效应(图3)。与正常的NIH3T3细胞相比，IGF1R的高表达大大增强了IGF1的促糖代谢作用。
图3 IGF1对IGF1R高表达的NIH3T3细胞促糖代谢作用
讨 论
IGF1作为一种类胰岛素样生长因子，在糖尿病的治疗中具有一定的临床应用前景。人们普遍认为：IGF1的促糖代谢效应是通过IR介导的。但是在胰岛素抵抗的2型糖尿病中，IGF1往往能起到较好的疗效。另外，在细胞水平上，人们也发现，表达胰岛素受体β亚单位酪氨酸激酶缺陷的成纤维细胞使胰岛素刺激的糖运输下降，但是IGF1的作用未受影响。这就提示我们：IGF1R在介导IGF1的促糖代谢过程中的作用不容忽视。我们采用细胞生物学的方法，在细胞水平，通过抗体阻断、细胞受体高表达之加减受体的办法，证明IGF1R在介导促糖代谢中起着很重要的作用。同时，从胰岛素受体脱敏的细胞糖代谢效应来看，IGF1与胰岛素的作用机制，包括受体和受体后机制并不是完全相同的。另外我们也看到：单克隆抗体封闭了IGF1R，但是IGF1的降糖作用并没有被完全阻抑，说明除了IGF1R以外，IGF1很可能同时也通过IR发挥作用。
, 百拇医药
HepG2是肝肉瘤细胞，肝是产生IGF1的主要场所，又是胰岛素作用的主要靶点，是研究糖代谢常用的细胞模型[4]，所以我们选择它作为我们的靶细胞。此外，因为正常的NIH3T3细胞上的IGF1R较少，我们通过高表达IGF1R的NIH3T3细胞观察糖代谢效应的变化，以反映IGF1R的作用。
IGF1与IGF1R的结合力是与胰岛素受体结合力的100倍[5]。IGF1R和IR结构同源，它们信号转导的许多细胞内底物也是相同的。但是二者信号转导通路并不是完全一致的，可能与两种受体分布的差异以及受体激活动力学等方面有关[6]。我们在证明IGF1R在IGF1促糖代谢方面的重要性后，正在进行受体后机制的探讨。
参 考 文 献
1，Bondy CA,Underwood LE,Clemmons DR,et al.Clinical uses of insulin-like growth factor 1.Annals of Internal Medicine,1994,120:593.
, 百拇医药
2，Melin B,Cherqui G,Blivet MJ,et al.Dual effect of metformin in cultured rat hepatocytes:potentiation of insulin action and prevention of insulin-induced resistance.Metabolism,1990,39:1089.
3，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratary mannual.2nd ed.New York.Cold Spring Harbor.1989：18～60.
4，Simpson AM,Tuch BE,Swan MA,et al.Functional expression of the human insulin gene in a human hepatoma cell line (HepG2).Gene Therapy,1995,2:223.
5，Stewart CEH,Rotwein P.Growth,differentiation and survival:multiple physiological functions for insulin-like growth factors.Physiological Reviews,1996,76:1005.
6，刘宝英，王会信.胰岛素样生长因子1受体激活机制及信号转导特异性.生理科学进展，1998，29：249.
(收稿：1999-01-13 修回：1999-10-13), http://www.100md.com
关键词：受体；胰岛素抗性细胞；基因转染
摘要：
中国糖尿病杂志000309 摘要 目的 研究胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)在介导IGF1促糖代谢过程中的作用。方法 建立胰岛素抗性细胞模型、IGF1R封闭细胞模型和IGF1R高表达细胞模型，检测IGF1对这3个细胞模型的促糖代谢作用。结果 ①IGF1对胰岛素抗性细胞的促糖代谢效应没有被阻抑。②IGF1对IGF1R封闭细胞的降糖效应得到了明显的阻抑。③IGF1R的高表达，大大增强了IGF1的促糖代谢效应。结论 IGF1R在IGF1的促糖代谢过程中起着十分重要的作用。
The study of IGF1R on mediating the glucose metabolism of IGF1
, http://www.100md.com
Liu Baoying,Xue Yanning,Nie Shanghai,et al
(Institute of Beijing Basic Medical Sciences,Beijing 100850)
Abstract Objective To study the effect of insulin-like growth factor 1 (IGF1) on glucose metabolism mediated by IGF1 receptor (IGF1R).Methods We constructed insulin resistant cell model,antibody blocking cell model,IGF1R high-expressed cell model and tested the metabolic effect of IGF1 on these three cell models.Results ①The metabolic effect of IGF1 on insulin-resistant cell was not inhibited.②The hypoglycemic effect of IGF1 on IGF1R blocked cell by its antibody was apparently inhibited.③IGF1's hypoglycemic effect on IGF1R high-expressed cell was greatly improved.Conclusion IGF1R played an important role in glucose metabolism of IGF1.
, 百拇医药
Key words Receptor Insulin resistant cell Gene transfection
近年来，有关胰岛素样生长因子1(IGF1)在临床方面的研究不断增多。有证据表明：IGF1可以作为胰岛素在1型糖尿病治疗中的辅助用药，并可明显改善对胰岛素抗性的2型糖尿病病人的代谢状态[1]。IGF1既可以通过IGF1受体(IGF1R)，又可以通过胰岛素受体(IR)起作用。过去人们认为：IGF1的促生长作用主要通过IGF1R，而代谢调控功能是通过IR起作用的。但是在有些情况下，如胰岛素抵抗的代谢状态，可以通过IGF1作用于它本身受体得以纠正。本研究旨在探索在细胞水平上，IGF1R在介导IGF1促糖代谢过程中的作用。
材料和方法
一、材料
1.质粒与细胞株：pCVN-IGF1R重组质粒为Dr.Renato Baserga惠赠。NIH3T3成纤维细胞与HepG2肝肉瘤细胞为本室保存。
, http://www.100md.com
2.试剂：rhIGF1为本室基因工程产品，IGF1R单克隆抗体为Santa Cruz产品，胰岛素、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替吡啉(4-AAP)、N-乙基-N-硫丙基甲苯兰(TOPS)均为Sigma产品，G418、lipofectin为Gibico产品。
二、方法
1.细胞代谢测定：GOD-POD法。将IGF1按3倍梯度稀释接种于96孔板中，然后将对数生长期的NIH 3T3/HepG2细胞消化，重悬于低糖无血清培养基，其成分为：葡萄糖含量为1.0mg/ml的DMEM，10mmol/L Hepes，2mmol/L谷氨酰胺，10μg/ml转铁蛋白，1mg/ml BSA，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。按4×104细胞/孔和2×104细胞/孔接种NIH3T3细胞和HepG2细胞，37℃培养22小时后，加50μl生色液(0.4U/ml葡萄糖氧化酶，0.68U/ml过氧化物酶，360μg/ml 4-AAP，490μg/ml TOPS，溶于pH6.0的PBS缓冲液中)，反应30分钟。反应结束后，在波长为595nm下用酶联仪测定光吸收。
, 百拇医药
2.胰岛素抗性细胞的诱导[2]：先将处于对数生长期的HepG2用无血清的DMEM洗两次，并在此培养基中37℃孵育5小时，然后用高浓度胰岛素(5×10-7mol/L)37℃继续孵育16小时。在测糖代谢试验前，用新鲜的无胰岛素的DMEM洗两次，20分钟/次。
3.抗体封闭试验：将IGF1R单克隆抗体按3倍稀释，与IGF1同时接种，测定细胞糖代谢效应。
4.基因转染：用脂质体转染试剂介导，将pCVN-IGF1R及对照质粒pCVN转染NIH3T3细胞，见操作手册。用G418筛选1个月，挑取单克隆，放大培养。
5.免疫印迹：按常规方法进行[3]。
结 果
一、IGF1对胰岛素抗性的HepG2细胞糖代谢效应的影响
, http://www.100md.com
图1 胰岛素(A)和IGF1(B)的促糖代谢作用
IGF1对胰岛素抗性的HepG2细胞糖代谢效应见图1。高剂量胰岛素诱导HepG2细胞，造成细胞对胰岛素抵抗(图1A)。但是IGF1对这种胰岛素抗性细胞的促糖代谢效应没有被阻抑(图1B)，说明IGF1与胰岛素的作用机制并不是完全相同的。另外我们还发现，IGF1对抗性细胞的降糖效应比对正常细胞的作用增强，这有可能是由于IR脱敏后，作用于IGF1R的IGF1浓度相对增高而引起的。
附表 IGF1及其IGF1R单克隆抗体对HepG2细胞培养基葡萄糖相对含量的影响(
±s)IGF1R抗体浓度(ng/ml)
0
, http://www.100md.com 0.6
1.8
-IGF1
100
97.7±1.1
96.2±2.2
+IGF1
85.4±0.4
92.5±1.7
94.5±0.2
* P<0.01
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图2 NIH3T3细胞裂解液的Western Blot图谱
1：NIH3T3细胞；2.转染pCVN的细胞；3：转染
pCVN-IGF1R的细胞(蛋白上样量为40μg)
二、IGF1R单克隆抗体封闭HepG2细胞的糖代谢效应
为了验证IGF1R在IGF1的促糖代谢过程中是否发挥作用，我们采用IGF1R单克隆抗体封闭受体，然后观察IGF1的促糖代谢效应，结果见附表。单独用IGF1(1.37μg/ml)作用于HepG2细胞，降糖作用明显，但是，在此基础上，同时加入不同浓度的IGF1R单克隆抗体。我们发现：IGF1的降糖作用得到了明显的阻抑，与只加IGF1而不加抗体的降糖效果相比，有显著性差异，P<0.01。IGF1R单克隆抗体是针对IGF1R的α链，它可以抑制IGF1与其受体的结合，与胰岛素受体和IGF2R无交叉反应。因此实验表明，IGF1R在IGF1促糖代谢过程中发挥作用。
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三、IGF1对IGF1R高表达细胞株的糖代谢效应
我们利用基因转染技术，构建了高表达IGF1R的NIH3T3细胞株。通过PCR扩增、RNA点杂交(结果未列出)和蛋白免疫印迹(图2)，均已证明了我们构建的IGF1R高表达细胞株是成功的。
然后，我们观察IGF1对IGF1R高表达NIH3T3细胞的促糖代谢效应(图3)。与正常的NIH3T3细胞相比，IGF1R的高表达大大增强了IGF1的促糖代谢作用。
图3 IGF1对IGF1R高表达的NIH3T3细胞促糖代谢作用
讨 论
IGF1作为一种类胰岛素样生长因子，在糖尿病的治疗中具有一定的临床应用前景。人们普遍认为：IGF1的促糖代谢效应是通过IR介导的。但是在胰岛素抵抗的2型糖尿病中，IGF1往往能起到较好的疗效。另外，在细胞水平上，人们也发现，表达胰岛素受体β亚单位酪氨酸激酶缺陷的成纤维细胞使胰岛素刺激的糖运输下降，但是IGF1的作用未受影响。这就提示我们：IGF1R在介导IGF1的促糖代谢过程中的作用不容忽视。我们采用细胞生物学的方法，在细胞水平，通过抗体阻断、细胞受体高表达之加减受体的办法，证明IGF1R在介导促糖代谢中起着很重要的作用。同时，从胰岛素受体脱敏的细胞糖代谢效应来看，IGF1与胰岛素的作用机制，包括受体和受体后机制并不是完全相同的。另外我们也看到：单克隆抗体封闭了IGF1R，但是IGF1的降糖作用并没有被完全阻抑，说明除了IGF1R以外，IGF1很可能同时也通过IR发挥作用。
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HepG2是肝肉瘤细胞，肝是产生IGF1的主要场所，又是胰岛素作用的主要靶点，是研究糖代谢常用的细胞模型[4]，所以我们选择它作为我们的靶细胞。此外，因为正常的NIH3T3细胞上的IGF1R较少，我们通过高表达IGF1R的NIH3T3细胞观察糖代谢效应的变化，以反映IGF1R的作用。
IGF1与IGF1R的结合力是与胰岛素受体结合力的100倍[5]。IGF1R和IR结构同源，它们信号转导的许多细胞内底物也是相同的。但是二者信号转导通路并不是完全一致的，可能与两种受体分布的差异以及受体激活动力学等方面有关[6]。我们在证明IGF1R在IGF1促糖代谢方面的重要性后，正在进行受体后机制的探讨。
参 考 文 献
1，Bondy CA,Underwood LE,Clemmons DR,et al.Clinical uses of insulin-like growth factor 1.Annals of Internal Medicine,1994,120:593.
, 百拇医药
2，Melin B,Cherqui G,Blivet MJ,et al.Dual effect of metformin in cultured rat hepatocytes:potentiation of insulin action and prevention of insulin-induced resistance.Metabolism,1990,39:1089.
3，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratary mannual.2nd ed.New York.Cold Spring Harbor.1989：18～60.
4，Simpson AM,Tuch BE,Swan MA,et al.Functional expression of the human insulin gene in a human hepatoma cell line (HepG2).Gene Therapy,1995,2:223.
5，Stewart CEH,Rotwein P.Growth,differentiation and survival:multiple physiological functions for insulin-like growth factors.Physiological Reviews,1996,76:1005.
6，刘宝英，王会信.胰岛素样生长因子1受体激活机制及信号转导特异性.生理科学进展，1998，29：249.
(收稿：1999-01-13 修回：1999-10-13), http://www.100md.com