一种新的人内皮细胞可诱导性粘附分子PTA1的表达、调变及粘附功能
作者：陈丽华 金伯泉 贾卫 谢鑫 刘雪松 欧阳为明
单位：陈丽华 金伯泉 贾卫 谢鑫 刘雪松 欧阳为明(第四军医大学免疫学教研室，陕西西安710033)
关键词：PTA1；内皮细胞；Jurkat细胞；粘附
细胞与分子免疫学杂志000107
摘要：目的观察PTA1分子在活化人内皮细胞的表达、调变及其所参与的粘附功能。方法用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察PTA1在内皮细胞的表达和分布；用RTPCR方法检测内皮细胞中PTA1mRNA的表达；用Na251CrO4标记静止和TPA活化Jurkat细胞，采用4h粘附实验观察不同条件下内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附以及PTA1/Ig融合蛋白的粘附阻断作用。结果①静止内皮细胞表达很弱的PTA1分子，TNFα、LPS可显著上调PTA1在内皮细胞的表达，TNFα刺激8h、LPS刺激2d后PTA1分子在内皮细胞的表达达到高峰。用RTPCR方法在TNFα刺激6h后的内皮细胞中可检测到较高水平的PTA1mRNA，但静止内皮细胞中只能检测到极微弱的PTA1mRNA。②TNFα活化内皮细胞与Jurkat细胞的粘附作用明显高于静止内皮细胞与Jurkat细胞的粘附作用，TPA活化Jurkat细胞与内皮细胞间的粘附作用明显高于静止Jurkat细胞与内皮细胞间的粘附作用，且这两种粘附作用均可部分被PTA1/Ig融合蛋白所阻断。结论TNFα和LPS刺激后的活化内皮细胞可表达较高水平的PTA1mRNA和PTA1蛋白，且此PTA1分子可直接参与活化内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附，表明PTA1是内皮细胞上一种新的可诱导性粘附分子。
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中图号：Q343.6 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0023-26
Expression，Modulation and adhesive function of a novel inducible adhesion molecule PTA1 on human endothelial cells
CHEN Li-hua， JIN Bo-quan, JIA Wei， XIE Xin, LIU Xue-shong， OU-YANG Wei-ming
Department of Immunology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033， Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Abstract: Aim To investigate the expression and regulation of inducible PTA1 on the human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) and ECV304 cells and its adhesive role in the adhesion between endothelial cells and Jurkat cells. Methods Indirect fluorescent staining, FCM analysis and RT-PCR were employed to detect the expression and regulation of PTA1 at the levels of PTA1 protein and PTA1mRNA. Na251CrO4 labeled resting or TPA activated Jurkat cells were added into HUVEC in the presence or absence of PTA1/Ig fusion protein to examine the adhesion effect. Results ① The expressions of PTA1 molecule and PTA1mRNA were very weak on resting HUVEC and ECV304 cells, whereas high level expression could be observed when these cells were stimulated by TNF-α or LPS. After 8h stimulation with TNF-α or 48h stimulation with LPS the expression of PTA1 protein reached its peak. ② The adhesion between TNF-α activated HUVEC and Jurkat cells was much higher than that between resting HUVEC and Jurkat cells. Similarly the adhesion between TPA-activated Jurkat cells and HUVEC was higher than that between resting Jurkat cells and HUVEC. The binding activities between endothelial cells and Jurkat cells either in resting or in activated status could partly be blocked by the addition of PTA1/Ig fusion protein. Conclusion TNF-α or LPS activated HUVEC and ECV304 cells can express high level PTA1 protein and PTA1mRNA,and PTA1 is involved in the adhesion between endothelial and Jurkat cells,suggesting that PTA1 is a novel inducible adhesion molecule on human endothelial cells.
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Keywords: PTA1 endothelial cells Jurkat cells adhesion
淋巴细胞和内皮细胞间的粘附在淋巴细胞穿越血管壁游走至炎症部位的过程中具有十分重要的作用。目前已经发现一些十分重要的分子参与淋巴细胞和内皮细胞间的粘附，其中包括ICAM-1/LFA-1，CD62E/CD15，CD34/CD62L，CD31/CD31以及VCAM-1/VLA-4等[1,2]。血小板T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)是97年基因克隆的新分子，主要表达于血小板、活化T细胞和NK细胞表面，参与血小板的凝集、CTL的分化和NK细胞的杀伤等功能[3～7]。Shibuya等发现DNAM-1(PTA1)参与T淋巴细胞杀伤过程中的粘附[8]，并证明PTA1分子在发挥其粘附功能的过程中需LFA-1的参与[9]。新近我室在研究PTA1分子分布的过程中发现其在TNF-α和LPS活化的内皮细胞表面表达明显增强，鉴于活化Jurkat细胞表达PTA1分子及其配体，我们在证实PTA1在TNF-α和LPS刺激后的活化内皮细胞表面表达明显增强的基础上进一步观察了PTA1分子在内皮细胞和Jurkat细胞粘附过程中的作用。本结果对全面了解PTA1分子的生物学功能有着重要的意义。
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1 材料和方法
1.1 抗体和细胞系 抗PTA1mAb(IgG1，κ)杂交瘤细胞系LeoA1，由澳大利亚Newcastle大学Burns教授惠赠，本室制备腹水，经硫酸铵盐析后FPLC纯化。抗葡萄球菌肠毒素B(SEB)mAb(IgG1，κ)由本室自制。VIII因子单抗为Dako公司产品。FITC-羊抗鼠IgG购自Sigma公司。PTA1/Ig稳定转染CHO细胞由澳大利亚Newcastle大学Burns教授惠赠，细胞培养上清经LeoA1单克隆抗体亲合层析柱纯化，浓度为0.5 g/L。人IgG1对照抗体购自Sigma公司。人脐静脉内皮细胞按文献[10]制备单层培养。Jurkat细胞为本室冻存。人内皮细胞系ECV304购自ATCC公司。
1.2 仪器和试剂 流式细胞仪为Coulter公司产品。Na251CrO4购自英国Amersham公司。M199，HEPES，LPS和Trizol Reagent RNA提取试剂盒为GibcoBRL公司产品。内皮细胞生长因子和反转录试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。I型胶原酶和TPA为Sigma公司产品。 TNF-α由中国科学院上海生物工程研究中心陈常庆教授惠赠。小牛血清购自杭州四季青工程材料研究所。
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1.3 人脐静脉内皮细胞的体外培养和鉴定 按文献[10]操作。简言之，培养瓶内加入少量2 g/L明胶(覆盖瓶底)，置37℃，包被30 min。弃去瓶内明胶溶液，接种分离得到的人脐静脉内皮细胞，加200 mL/L FCS199培养基，内含内皮细胞生长因子和肝素。待内皮细胞长至近单层，用1 g/L胰酶-0.2 g/L EDTA消化培养内皮细胞，用上述培养基传代扩增。在加有盖玻片的24孔板包被明胶后接种胰酶消化的培养人脐静脉内皮细胞，待内皮细胞长至近单层时取出24孔板内的盖玻片，1∶1(v∶v)丙酮:甲醇固定5 min，PBS冲洗5 min，3次。加1∶100稀释的VIII因子单抗，4℃作用4 h。PBS洗涤后，加1∶250 FITC-羊抗鼠IgG，室温下作用1 h。PBS洗涤后荧光显微镜观察并照相。
1.4 间接免疫荧光染色和FCM分析 取TNF-α(106U /L)或LPS(10-3g/L)刺激不同时间点的细胞悬液，应用100 mL/L FCS199培养基调整对数生长期人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞浓度分别为1×109/L和5×109/L，各取50 μL细胞悬液加5 μL灭活兔血清封闭，再加入2 μL PTA1mAb(5g/L)或对照抗体SEB，混匀后4℃作用30 min。洗涤液洗涤2次，加入50 μL工作浓度的FITC-羊抗鼠IgG，混匀后4℃作用30 min。洗涤液洗涤2次，400 μL固定液固定后用Coulter EPICS ELITE EPS 型流式细胞仪分析。
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1.5 RT-PCR分析 引物设计依照人PTA1cDNA序列，针对PTA1分子胞膜外区及胞膜外区第2结构域设计上游引物p1和p2以及下游引物p3。引物序列如下：
P1： 5′ GC AAG CTT CAG AGA TGG ATT ATC CTA CT 3′
P2： 5′GC AAG CTT GGC AGA AGG TGA TAC AGG 3′
P3： 5′GC GGA TCC AGT CAA TCT CAT CAG GAA GG 3′
各引物在PTA1cDNA序列中的位置如图1所示。
图1 各引物在PTA1cDNA序列中的位置
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Fig1 Location of PTA1 primers
1.5.1 反转录 分别收集TNF-α(106 U/L)刺激2，4，6 h的活化HUVEC和TPA活化Jurkat细胞各2×106，用Trizol Reagent RNA kit提取细胞总RNA。在DEPC处理过的Eppendorf管中依次加入：细胞总RNA 5 μg，Oligo(dT)151μL(0.5 μg)，5×AMV buffer 4 μL，Rnasin 2 μL，10mmol/L dNTP 2 μL，AMV反转录酶3 μL(20U)，最后加DEPC水补足20 μL。42℃作用60 min，然后70℃10 min灭活反转录酶。
1.5.2 PCR 以反转录产物为模板，先以引物p1和p3进行第一轮扩增；再以第1轮PCR反应产物为模板，以引物p2和p3进行半巢式第2轮扩增，扩增产物行琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6 内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附阻断实验 在96孔平底培养板中，以HUVEC作为铺底细胞，1×104/孔。37℃，50 mL/L CO2培养24 h，使之紧密贴附。实验前6 h加入TNF-α(106 U/L)使之成为活化内皮细胞。 用3.7 ×106Bq 51Cr标记活化或未活化的Jurkat细胞，洗涤后将标记细胞加入上内皮细胞培养板中，1×105/孔，37℃，50 mL/L CO2培养4 h。用PBS轻柔洗去未粘附的Jurkat细胞，每孔加入含10 mL/L TritonX100的PBS 150 μL裂解细胞，取100 μL测定cpm值。在粘附阻断实验中，分别在内皮细胞和Jurkat细胞中预先加入PTA1/Ig融合蛋白或IgG对照，观察其在内皮细胞和Jurkat细胞粘附中的特异性阻断作用。
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2 结 果
2.1 人脐静脉内皮细胞的鉴定 VIII因子单抗间接免疫荧光染色结果显示所培养的细胞表达较高密度的VIII因子，阳性率为100%(图2)，证明所培养的细胞为人脐静脉内皮细胞。
图2 VIII因子间接免疫荧光染色结果
Fig 2 VIII factor positive staining of HUVEC
2.2 人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞的FCM分析 流式细胞仪分析显示，静止HUVEC和ECV304细胞仅有微弱的PTA1分子表达。TNF-α刺激4 h后PTA1有所表达，8 h时表达到达高峰，HUVEC和ECV304的阳性百分率分别为33.4%和57.9% ；LPS刺激24 h后PTA1有所表达，48 h时表达到达高峰，HUVEC和ECV304的阳性百分率分别为22.9%和40.1%(图3)。
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图3 HUVEC和ECV304在TNF-α,LPS刺激后不同时间点时PTA1的表达
Fig 3 PTA1 expression on TNF-α,LPSactivated HUVEC and ECV304
2.3 PTA1 mRNA在内皮细胞的表达和调变 RT-PCR结果显示，静止HUVEC和ECV304细胞未见有明显的PTA1mRNA表达，TPA活化Jurkat细胞及TNFα刺激2，4和6 h 的HUVEC在370bp处可见明显的扩增条带(图4)。
2.4 PTA1在内皮细胞和Jurkat细胞粘附中的作用 TNF-α(1×106U/L)预作用6 h的活化内皮细胞与静止内皮细胞中分别加入TPA活化Jurkat细胞，结果发现TNFα活化内皮细胞与TPA活化Jurkat细胞间的粘附作用(2369 cpm)明显高于静止内皮细胞与活化Jurkat细胞的粘附作用(1073 cpm1，P∨0.01)，且PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L) 预作用活化内皮细胞后可部分阻断其与Jurkat细胞的粘附，阻断率为21.4%(P∨0.01，图5)。 TPA(50 μg/L)预作用36 h的活化Jurkat细胞和静止Jurkat细胞分别加入活化内皮细胞中，结果发现TPA活化Jurkat细胞与内皮细胞的粘附作用(2369 cpm)明显高于静止Jurkat细胞与内皮细胞的粘附作用(323 cpm， P∨0.01)，且PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L)预作用活化Jurkat细胞后可明显阻断其与内皮细胞的粘附，阻断率为55.9%(P∨0.01，图5)。
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图4 应用PTPCR方法从HUVEC扩增PTA1cDNA
Fig 4 Amplification of PTA1 cDNA from HUVEC by RTPCR
1:分子质量marker;2:TPA活化Jurkat细胞；3:TNFα刺激HUVEC (2h)；4:TNFα刺激HUVEC (6h)；5:TNFα刺激HUVEC (4h)； 6:静止HUVEC；7.RTPCR marker.
图5 内皮细胞与Jurkat细胞的粘附阻断实验结果
Fig 5 Adhesion blocking experiment of HUVECs with Jurkat cells
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AE(活化En),AJ(活化Jurkat),RE(静止En), RJ(静止Jurkat).
3 讨 论
内皮细胞是机体内一类功能十分重要的细胞，不同细胞因子作用于内皮细胞后可产生不同的生理和病理反应，这些细胞因子据其对内皮细胞作用的不同可分为3类：第1类为TNF-α，LPS，IL-1β等炎症作用因子，它们作用于内皮细胞后可使其表达CD31等分子，同时上调ICAM-1，VCAM-1和CD62E等分子的表达，促进前列腺素、血小板激活因子的产生，参与淋巴细胞与内皮细胞间的粘附，从而导致内皮细胞发生炎症反应和血栓形成；第2类为IFN-γ，它主要诱导内皮细胞表达MHCII类抗原，参与内皮细胞的抗原提呈；第3类包括CSF，FGF，TGF-β，EGF，MIP和IL8等分子，它们主要参与内皮细胞的增生和移动，促进血管形成，与肿瘤的浸润和转移密切相关[1113]。
PTA1是67kDa的糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，胞膜外区含有2个免疫球蛋白V样结构域，表达于活化T淋巴细胞、NK细胞、巨核细胞和血小板表面。PTA1在TNF-α和LPS刺激后的活化内皮细胞表面表达，显示其与CD31，ICAM-1，VCAM-1和CD62E等分子相类似的表达调变规律，提示它很可能是一种与炎症反应有关的可诱导性粘附分子。我们的实验结果显示PTA1分子在TNF-α刺激6h，LPS刺激48h后表达到达高峰。由于LPS通过与内皮细胞表面CD14和LPB结合后介导细胞激活导致其产生TNF-α ，LPS刺激内皮细胞2d后TNF-α表达到达高峰[14]，猜测LPS刺激EC表达PTA1很可能缘于其刺激EC产生TNFα后进一步作用的结果。
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我们用PTA1/Ig融合蛋白预作用于活化内皮细胞或活化Jurkat细胞后均可部分阻断内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附作用，很可能是PTA1/Ig融合蛋白与这两种细胞表面的PTA1配体相互作用后阻断了PTA1分子与其配体间的粘附作用。目前已发现许多分子对，如ICAM-1/LFA1和CD2/LFA-3等，它们在相互作用的两种细胞表面均有表达，互为配体和受体，通过彼此间的相互作用发挥其生物学功能[15]。鉴于目前已证实PTA1及其配体在TPA活化的Jurkat细胞表面均有表达，PTA1在TNF-α和LPS刺激后的内皮细胞表面诱导性表达，那么PTA1及其配体是否也如ICAM-1/LFA-1和CD2/LFA-3一样同时存在于相互作用的两种细胞表面并通过彼此间的相互作用发挥其生物学功能值得进一步探讨。由于PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L)预作用活化Jurkat细胞后可明显阻断其与内皮细胞的粘附，阻断率为55.9%，明显高于PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L) 预作用活化内皮细胞后对二者的粘附阻断作用(阻断率为21.4%)，因此在内皮细胞和Jurkat细胞的粘附过程中以Jurkat细胞表面的PTA1配体与内皮细胞表面的PTA1分子相互作用为主。
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新近，Shibuya等[9]发现DNAM-1(PTA1)分子参与CTL和NK细胞杀伤过程中的粘附，并用免疫共沉淀方法进一步证实PTA1分子在NK细胞表面与LFA-1分子紧密结合。那么，在内皮细胞和Jurkat细胞的粘附过程中PTA1分子是否也通过LFA-1或其它integrin分子发挥其作用呢？这一点需要进一步的实验加以证实。
基金项目 ：国家自然科学基金资助，No.39770697
作者简介 ：陈丽华，女，28岁，博士生
西安市长乐西路17号 . Tel.( 029) 3374531
参考文献:
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收稿日期：1999-09-23
修回日期：1999-11-14, 百拇医药
单位：陈丽华 金伯泉 贾卫 谢鑫 刘雪松 欧阳为明(第四军医大学免疫学教研室，陕西西安710033)
关键词：PTA1；内皮细胞；Jurkat细胞；粘附
细胞与分子免疫学杂志000107
摘要：目的观察PTA1分子在活化人内皮细胞的表达、调变及其所参与的粘附功能。方法用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察PTA1在内皮细胞的表达和分布；用RTPCR方法检测内皮细胞中PTA1mRNA的表达；用Na251CrO4标记静止和TPA活化Jurkat细胞，采用4h粘附实验观察不同条件下内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附以及PTA1/Ig融合蛋白的粘附阻断作用。结果①静止内皮细胞表达很弱的PTA1分子，TNFα、LPS可显著上调PTA1在内皮细胞的表达，TNFα刺激8h、LPS刺激2d后PTA1分子在内皮细胞的表达达到高峰。用RTPCR方法在TNFα刺激6h后的内皮细胞中可检测到较高水平的PTA1mRNA，但静止内皮细胞中只能检测到极微弱的PTA1mRNA。②TNFα活化内皮细胞与Jurkat细胞的粘附作用明显高于静止内皮细胞与Jurkat细胞的粘附作用，TPA活化Jurkat细胞与内皮细胞间的粘附作用明显高于静止Jurkat细胞与内皮细胞间的粘附作用，且这两种粘附作用均可部分被PTA1/Ig融合蛋白所阻断。结论TNFα和LPS刺激后的活化内皮细胞可表达较高水平的PTA1mRNA和PTA1蛋白，且此PTA1分子可直接参与活化内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附，表明PTA1是内皮细胞上一种新的可诱导性粘附分子。
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中图号：Q343.6 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0023-26
Expression，Modulation and adhesive function of a novel inducible adhesion molecule PTA1 on human endothelial cells
CHEN Li-hua， JIN Bo-quan, JIA Wei， XIE Xin, LIU Xue-shong， OU-YANG Wei-ming
Department of Immunology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033， Shaanxi Province, China
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Abstract: Aim To investigate the expression and regulation of inducible PTA1 on the human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) and ECV304 cells and its adhesive role in the adhesion between endothelial cells and Jurkat cells. Methods Indirect fluorescent staining, FCM analysis and RT-PCR were employed to detect the expression and regulation of PTA1 at the levels of PTA1 protein and PTA1mRNA. Na251CrO4 labeled resting or TPA activated Jurkat cells were added into HUVEC in the presence or absence of PTA1/Ig fusion protein to examine the adhesion effect. Results ① The expressions of PTA1 molecule and PTA1mRNA were very weak on resting HUVEC and ECV304 cells, whereas high level expression could be observed when these cells were stimulated by TNF-α or LPS. After 8h stimulation with TNF-α or 48h stimulation with LPS the expression of PTA1 protein reached its peak. ② The adhesion between TNF-α activated HUVEC and Jurkat cells was much higher than that between resting HUVEC and Jurkat cells. Similarly the adhesion between TPA-activated Jurkat cells and HUVEC was higher than that between resting Jurkat cells and HUVEC. The binding activities between endothelial cells and Jurkat cells either in resting or in activated status could partly be blocked by the addition of PTA1/Ig fusion protein. Conclusion TNF-α or LPS activated HUVEC and ECV304 cells can express high level PTA1 protein and PTA1mRNA,and PTA1 is involved in the adhesion between endothelial and Jurkat cells,suggesting that PTA1 is a novel inducible adhesion molecule on human endothelial cells.
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Keywords: PTA1 endothelial cells Jurkat cells adhesion
淋巴细胞和内皮细胞间的粘附在淋巴细胞穿越血管壁游走至炎症部位的过程中具有十分重要的作用。目前已经发现一些十分重要的分子参与淋巴细胞和内皮细胞间的粘附，其中包括ICAM-1/LFA-1，CD62E/CD15，CD34/CD62L，CD31/CD31以及VCAM-1/VLA-4等[1,2]。血小板T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)是97年基因克隆的新分子，主要表达于血小板、活化T细胞和NK细胞表面，参与血小板的凝集、CTL的分化和NK细胞的杀伤等功能[3～7]。Shibuya等发现DNAM-1(PTA1)参与T淋巴细胞杀伤过程中的粘附[8]，并证明PTA1分子在发挥其粘附功能的过程中需LFA-1的参与[9]。新近我室在研究PTA1分子分布的过程中发现其在TNF-α和LPS活化的内皮细胞表面表达明显增强，鉴于活化Jurkat细胞表达PTA1分子及其配体，我们在证实PTA1在TNF-α和LPS刺激后的活化内皮细胞表面表达明显增强的基础上进一步观察了PTA1分子在内皮细胞和Jurkat细胞粘附过程中的作用。本结果对全面了解PTA1分子的生物学功能有着重要的意义。
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1 材料和方法
1.1 抗体和细胞系 抗PTA1mAb(IgG1，κ)杂交瘤细胞系LeoA1，由澳大利亚Newcastle大学Burns教授惠赠，本室制备腹水，经硫酸铵盐析后FPLC纯化。抗葡萄球菌肠毒素B(SEB)mAb(IgG1，κ)由本室自制。VIII因子单抗为Dako公司产品。FITC-羊抗鼠IgG购自Sigma公司。PTA1/Ig稳定转染CHO细胞由澳大利亚Newcastle大学Burns教授惠赠，细胞培养上清经LeoA1单克隆抗体亲合层析柱纯化，浓度为0.5 g/L。人IgG1对照抗体购自Sigma公司。人脐静脉内皮细胞按文献[10]制备单层培养。Jurkat细胞为本室冻存。人内皮细胞系ECV304购自ATCC公司。
1.2 仪器和试剂 流式细胞仪为Coulter公司产品。Na251CrO4购自英国Amersham公司。M199，HEPES，LPS和Trizol Reagent RNA提取试剂盒为GibcoBRL公司产品。内皮细胞生长因子和反转录试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。I型胶原酶和TPA为Sigma公司产品。 TNF-α由中国科学院上海生物工程研究中心陈常庆教授惠赠。小牛血清购自杭州四季青工程材料研究所。
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1.3 人脐静脉内皮细胞的体外培养和鉴定 按文献[10]操作。简言之，培养瓶内加入少量2 g/L明胶(覆盖瓶底)，置37℃，包被30 min。弃去瓶内明胶溶液，接种分离得到的人脐静脉内皮细胞，加200 mL/L FCS199培养基，内含内皮细胞生长因子和肝素。待内皮细胞长至近单层，用1 g/L胰酶-0.2 g/L EDTA消化培养内皮细胞，用上述培养基传代扩增。在加有盖玻片的24孔板包被明胶后接种胰酶消化的培养人脐静脉内皮细胞，待内皮细胞长至近单层时取出24孔板内的盖玻片，1∶1(v∶v)丙酮:甲醇固定5 min，PBS冲洗5 min，3次。加1∶100稀释的VIII因子单抗，4℃作用4 h。PBS洗涤后，加1∶250 FITC-羊抗鼠IgG，室温下作用1 h。PBS洗涤后荧光显微镜观察并照相。
1.4 间接免疫荧光染色和FCM分析 取TNF-α(106U /L)或LPS(10-3g/L)刺激不同时间点的细胞悬液，应用100 mL/L FCS199培养基调整对数生长期人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞浓度分别为1×109/L和5×109/L，各取50 μL细胞悬液加5 μL灭活兔血清封闭，再加入2 μL PTA1mAb(5g/L)或对照抗体SEB，混匀后4℃作用30 min。洗涤液洗涤2次，加入50 μL工作浓度的FITC-羊抗鼠IgG，混匀后4℃作用30 min。洗涤液洗涤2次，400 μL固定液固定后用Coulter EPICS ELITE EPS 型流式细胞仪分析。
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1.5 RT-PCR分析 引物设计依照人PTA1cDNA序列，针对PTA1分子胞膜外区及胞膜外区第2结构域设计上游引物p1和p2以及下游引物p3。引物序列如下：
P1： 5′ GC AAG CTT CAG AGA TGG ATT ATC CTA CT 3′
P2： 5′GC AAG CTT GGC AGA AGG TGA TAC AGG 3′
P3： 5′GC GGA TCC AGT CAA TCT CAT CAG GAA GG 3′
各引物在PTA1cDNA序列中的位置如图1所示。
图1 各引物在PTA1cDNA序列中的位置
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Fig1 Location of PTA1 primers
1.5.1 反转录 分别收集TNF-α(106 U/L)刺激2，4，6 h的活化HUVEC和TPA活化Jurkat细胞各2×106，用Trizol Reagent RNA kit提取细胞总RNA。在DEPC处理过的Eppendorf管中依次加入：细胞总RNA 5 μg，Oligo(dT)151μL(0.5 μg)，5×AMV buffer 4 μL，Rnasin 2 μL，10mmol/L dNTP 2 μL，AMV反转录酶3 μL(20U)，最后加DEPC水补足20 μL。42℃作用60 min，然后70℃10 min灭活反转录酶。
1.5.2 PCR 以反转录产物为模板，先以引物p1和p3进行第一轮扩增；再以第1轮PCR反应产物为模板，以引物p2和p3进行半巢式第2轮扩增，扩增产物行琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6 内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附阻断实验 在96孔平底培养板中，以HUVEC作为铺底细胞，1×104/孔。37℃，50 mL/L CO2培养24 h，使之紧密贴附。实验前6 h加入TNF-α(106 U/L)使之成为活化内皮细胞。 用3.7 ×106Bq 51Cr标记活化或未活化的Jurkat细胞，洗涤后将标记细胞加入上内皮细胞培养板中，1×105/孔，37℃，50 mL/L CO2培养4 h。用PBS轻柔洗去未粘附的Jurkat细胞，每孔加入含10 mL/L TritonX100的PBS 150 μL裂解细胞，取100 μL测定cpm值。在粘附阻断实验中，分别在内皮细胞和Jurkat细胞中预先加入PTA1/Ig融合蛋白或IgG对照，观察其在内皮细胞和Jurkat细胞粘附中的特异性阻断作用。
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2 结 果
2.1 人脐静脉内皮细胞的鉴定 VIII因子单抗间接免疫荧光染色结果显示所培养的细胞表达较高密度的VIII因子，阳性率为100%(图2)，证明所培养的细胞为人脐静脉内皮细胞。
图2 VIII因子间接免疫荧光染色结果
Fig 2 VIII factor positive staining of HUVEC
2.2 人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞的FCM分析 流式细胞仪分析显示，静止HUVEC和ECV304细胞仅有微弱的PTA1分子表达。TNF-α刺激4 h后PTA1有所表达，8 h时表达到达高峰，HUVEC和ECV304的阳性百分率分别为33.4%和57.9% ；LPS刺激24 h后PTA1有所表达，48 h时表达到达高峰，HUVEC和ECV304的阳性百分率分别为22.9%和40.1%(图3)。
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图3 HUVEC和ECV304在TNF-α,LPS刺激后不同时间点时PTA1的表达
Fig 3 PTA1 expression on TNF-α,LPSactivated HUVEC and ECV304
2.3 PTA1 mRNA在内皮细胞的表达和调变 RT-PCR结果显示，静止HUVEC和ECV304细胞未见有明显的PTA1mRNA表达，TPA活化Jurkat细胞及TNFα刺激2，4和6 h 的HUVEC在370bp处可见明显的扩增条带(图4)。
2.4 PTA1在内皮细胞和Jurkat细胞粘附中的作用 TNF-α(1×106U/L)预作用6 h的活化内皮细胞与静止内皮细胞中分别加入TPA活化Jurkat细胞，结果发现TNFα活化内皮细胞与TPA活化Jurkat细胞间的粘附作用(2369 cpm)明显高于静止内皮细胞与活化Jurkat细胞的粘附作用(1073 cpm1，P∨0.01)，且PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L) 预作用活化内皮细胞后可部分阻断其与Jurkat细胞的粘附，阻断率为21.4%(P∨0.01，图5)。 TPA(50 μg/L)预作用36 h的活化Jurkat细胞和静止Jurkat细胞分别加入活化内皮细胞中，结果发现TPA活化Jurkat细胞与内皮细胞的粘附作用(2369 cpm)明显高于静止Jurkat细胞与内皮细胞的粘附作用(323 cpm， P∨0.01)，且PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L)预作用活化Jurkat细胞后可明显阻断其与内皮细胞的粘附，阻断率为55.9%(P∨0.01，图5)。
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图4 应用PTPCR方法从HUVEC扩增PTA1cDNA
Fig 4 Amplification of PTA1 cDNA from HUVEC by RTPCR
1:分子质量marker;2:TPA活化Jurkat细胞；3:TNFα刺激HUVEC (2h)；4:TNFα刺激HUVEC (6h)；5:TNFα刺激HUVEC (4h)； 6:静止HUVEC；7.RTPCR marker.
图5 内皮细胞与Jurkat细胞的粘附阻断实验结果
Fig 5 Adhesion blocking experiment of HUVECs with Jurkat cells
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AE(活化En),AJ(活化Jurkat),RE(静止En), RJ(静止Jurkat).
3 讨 论
内皮细胞是机体内一类功能十分重要的细胞，不同细胞因子作用于内皮细胞后可产生不同的生理和病理反应，这些细胞因子据其对内皮细胞作用的不同可分为3类：第1类为TNF-α，LPS，IL-1β等炎症作用因子，它们作用于内皮细胞后可使其表达CD31等分子，同时上调ICAM-1，VCAM-1和CD62E等分子的表达，促进前列腺素、血小板激活因子的产生，参与淋巴细胞与内皮细胞间的粘附，从而导致内皮细胞发生炎症反应和血栓形成；第2类为IFN-γ，它主要诱导内皮细胞表达MHCII类抗原，参与内皮细胞的抗原提呈；第3类包括CSF，FGF，TGF-β，EGF，MIP和IL8等分子，它们主要参与内皮细胞的增生和移动，促进血管形成，与肿瘤的浸润和转移密切相关[1113]。
PTA1是67kDa的糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，胞膜外区含有2个免疫球蛋白V样结构域，表达于活化T淋巴细胞、NK细胞、巨核细胞和血小板表面。PTA1在TNF-α和LPS刺激后的活化内皮细胞表面表达，显示其与CD31，ICAM-1，VCAM-1和CD62E等分子相类似的表达调变规律，提示它很可能是一种与炎症反应有关的可诱导性粘附分子。我们的实验结果显示PTA1分子在TNF-α刺激6h，LPS刺激48h后表达到达高峰。由于LPS通过与内皮细胞表面CD14和LPB结合后介导细胞激活导致其产生TNF-α ，LPS刺激内皮细胞2d后TNF-α表达到达高峰[14]，猜测LPS刺激EC表达PTA1很可能缘于其刺激EC产生TNFα后进一步作用的结果。
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我们用PTA1/Ig融合蛋白预作用于活化内皮细胞或活化Jurkat细胞后均可部分阻断内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附作用，很可能是PTA1/Ig融合蛋白与这两种细胞表面的PTA1配体相互作用后阻断了PTA1分子与其配体间的粘附作用。目前已发现许多分子对，如ICAM-1/LFA1和CD2/LFA-3等，它们在相互作用的两种细胞表面均有表达，互为配体和受体，通过彼此间的相互作用发挥其生物学功能[15]。鉴于目前已证实PTA1及其配体在TPA活化的Jurkat细胞表面均有表达，PTA1在TNF-α和LPS刺激后的内皮细胞表面诱导性表达，那么PTA1及其配体是否也如ICAM-1/LFA-1和CD2/LFA-3一样同时存在于相互作用的两种细胞表面并通过彼此间的相互作用发挥其生物学功能值得进一步探讨。由于PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L)预作用活化Jurkat细胞后可明显阻断其与内皮细胞的粘附，阻断率为55.9%，明显高于PTA1/Ig融合蛋白(10 mg/L) 预作用活化内皮细胞后对二者的粘附阻断作用(阻断率为21.4%)，因此在内皮细胞和Jurkat细胞的粘附过程中以Jurkat细胞表面的PTA1配体与内皮细胞表面的PTA1分子相互作用为主。
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新近，Shibuya等[9]发现DNAM-1(PTA1)分子参与CTL和NK细胞杀伤过程中的粘附，并用免疫共沉淀方法进一步证实PTA1分子在NK细胞表面与LFA-1分子紧密结合。那么，在内皮细胞和Jurkat细胞的粘附过程中PTA1分子是否也通过LFA-1或其它integrin分子发挥其作用呢？这一点需要进一步的实验加以证实。
基金项目 ：国家自然科学基金资助，No.39770697
作者简介 ：陈丽华，女，28岁，博士生
西安市长乐西路17号 . Tel.( 029) 3374531
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收稿日期：1999-09-23
修回日期：1999-11-14, 百拇医药