PCNA基因反义RNA 表达质粒的构建及对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应
作者：戴 林 张学庸① 惠宏襄① 王成济① 胡家露①
单位：116021 大连 解放军第210医院
关键词：增殖细胞核抗原；胃肿瘤；寡核苷酸类，反义；基因疗法；小鼠，裸
摘 要 为观察PCNA基因反义RNA表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应 摘 要 为观察PCNA基因反义RNA表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应，用DNA重组法将人PCNA基因反向克隆到真核细胞表达质粒pDOR-neo中，构建成PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA，用Lipofect AMINTM介导转染人胃癌细胞系SGC-7901，并接种于裸鼠背部皮下。经G418筛选获得的转染细胞系SGC/PCNA与亲本细胞相比，其生长速度减慢，RNA、蛋白质生物合成受到抑制，S期、G2/M期DNA含量降低，移植瘤生长速度减慢，瘤体平均直径(0.54±0.13)cm，明显小于对照组(1.51±0.11)cm。结果表明，PCNA基因反义RNA表达质粒对胃癌裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类号 R735.2
CONSTRUCTION OF PCNA ANTISENSE RNA EXPRESSION VECTOR AND ITS ANTITUMOR EFFECT ON HUMAN GASTRIC CANCER XENOGRAFTS IN NUDE MICE
Dai Lin, Zhang Xueyong, Hui Hongxiang et al.
The 210th Hospital of PLA, Dalian 116021
Abstract To observe the effect of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) antisense RNA on human gastric cancer xenografts in immuno-compromized Balb/c mice and their antitumor roles, an eukaryotic expression vector pDR-PCNA was successfully constructed with DNA recombinant by inserting the human PCNA gene into an eukaryotic expression pDOR-neo in reverse direction. The human gastric cancer cell line SGC-7901 was tansfected with pDR-PCNA by lipofect AMINETM, which was inoculated into the bake of mude mice. After G418 selection, the growth rate of cells, the biosyntheses of proteins and RNA and the DNA contents of transfectants in S-phase and G2/M-phase were significantly suppressed in comparison with that of the parental cell line. The tumor formation time and growth rate of transplantable tumor in nude mice inoculated with SGC/PCNA greatly reduced in comparison with that in nude mice inoculated with SGC-7901, or SGC/neo. The average diameter (0.54±0.13)cm of transplantable tumor in nude mice inoculated with SGC/PCNA was markedly smaller than that of controls (1.51±0.11)cm. The results demonstrated that PCNA antisense RNA could markedly suppress the growth of human grastric cancer transplantalbe tumor in nude mice.
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Key words proliferating cell nuclear antigen; stomach neoplasms; oligonucleotide, antisense; gene therapy; mice, nude
增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助因子，在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。研究表明，PCNA在许多肿瘤组织都有高表达，并与肿瘤的发生、转移关系密切。为研究PCNA基因与胃癌的关系，探索胃癌基因治疗的途径，本研究在构建了人PCNA基因反义RNA真核表达质粒并对胃癌细胞系转染的基础上，进一步观察对人胃癌裸鼠移植瘤的抑瘤效应。
1 材料与方法
1.1 质粒及主要试剂 人pT7hPCNA质粒及真核表达质粒pDOR-neo的来源见文献〔1〕，Lipofect AMINETM脂质体药盒购自Gibco公司，G418购自Sigma公司，[α-32P]UTP、[α-32P]dATP购自北京福瑞公司，内切酶、连接酶购自华美生物技术公司。
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1.2 质粒制备 DNA片段回收、DNA连接、细菌转化及基因鉴定参照文献〔2〕进行。
1.3 DNA转染 用Lipofect AMINETM介导将空载体pDOR-neo及重组载体pDR-PCNA转染至人胃癌细胞SGC-7901，分别命名为SGC/neo和SGC/PCNA，并以SGC-7901作为阴性对照。转染72h后，用G418(400mg/L)筛选3周，挑取单一抗性细胞在G418(100mg/L)下常规培养扩增。
1.4 细胞生长曲线 在24孔培养板中，分别于每孔接种细胞3×104个/ml，每日取各种克隆细胞株3孔消化计数，连续5天，绘制生长曲线。
1.5 核酸分子杂交分析 ①用缺口平移法以[α-32P]dATP标记c-myc、H-ras基因探针，提取SGC-7901和转染72 h后的SGC/PCNA细胞基因组DNA，常规行DNA斑点杂交；②将PCNA基因头尾端克隆至pEG3Z载体HindⅢ和BamHI位点间，分别利用SP6、T7启动子体外转录盒(Riboprobe Kit,美国Promega公司)及[α-32P]UTP标记出正义和反义PCNA RNA单链探针。提取SGC-7901和SGC/PCNA细胞RNA，按常规行RNA斑点杂交。
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1.6 细胞周期测定 3组细胞各取1×106对数生长期单细胞悬液，0.01 mol/L pH 7.4PBS洗涤，70%乙醇固定，PI(Propidium iodide)染色，Partec-CAⅡ型流式细胞仪(FCM)检测细胞DNA含量。
1.7 FMC测定细胞内PCNA含量及癌基因蛋白表达 将3组细胞各分为数管，每管取5×106细胞洗涤，1%副醛固定，离心，封闭后，再分别加入第一抗体(PCNA、p53、H-ras和c-myc)，室温孵育、洗涤后加入FITC-羊抗小鼠IgG(1∶100)，悬浮于200μl PBS液中，过300目筛网，FCM检测。替代对照用正常小鼠IgG。
1.8 裸鼠体内致瘤性观察 将4周龄BALB/c裸小鼠分为3组(SGC/PCNA、SGC/neo和SGC-7901)，每组8只，分别以1×103细胞接种于小鼠背部皮下，观察肿瘤结节出现时间、生长速度、肿瘤大小(用结节直径平均值表示)及小鼠存活期。
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2 结 果
2.1 PCNA反义RNA表达质粒的构建及鉴定 构建过程及鉴定见文献〔4〕。将含有人PCNA的重组质粒命名为pDR-PCNA。
2.2 细胞生长曲线SGC/PCNA细胞生长速度与亲本细胞SGC-7901相比明显减慢，在培养第5天，细胞生长抑制达59%(图1)。
图1 细胞生长曲线
2.3 细胞内mRNA水平变化 PCNA正义RNA探针检测到SGC/PCNA有较强的杂交信号，而SGC-7901无杂交信号产生。表明pDR-PCNA已整合至细胞染色体中。PCNA反义RNA探针检测到SGC-7901有强杂交信号，而SGC/PCNA杂交信号较SGC-7901明显减弱。经对杂交斑点薄层扫描(CX-9000薄层扫描仪，日本岛津)，SGC/PCNA细胞PCNA mRNA被抑制47.5%。
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2.4 转染细胞ras和c-myc基因表达的变化 ras和c-myc DNA探针检测到SGC/PCNA细胞中ras和c-myc基因表达降低(图2)。对杂交斑点图像扫描显示，SGC/PCNA细胞较SGC-7901细胞ras和c-myc基因表达分别下调52.5%和65.1%。
2.5 转染细胞周期分布 FCM分析显示，SGC/PCNA细胞与SGC-7901 相比，G1期细胞增加20.5%，S期和G2/M期分别减少29.8%和21.2%，SGC/neo与SGC-7901细胞相比无明显变化。
图2 SGC-7901和SGC/PCNA细胞
ras、c-myc基因斑点杂交
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A：ras基因斑点杂交； B：c-myc基因斑点杂交；
1：SGC/PCNA细胞； 2：SGC-7901细胞
2.6 FCM测定细胞内PCNA、p53、ras和c-myc抗原含量 ①当替代对照细胞荧光强度为1.9%时，SGC-7901细胞PCNA荧光强度为90%，SGC/neo细胞为82%，而SGC/PCNA细胞为21.6%，表明SGC/PCNA细胞PCNA抗原表达被抑制60%以上。②SGC/PCNA细胞p53、ras和c-myc抗原含量较SGC-7901分别降低13.5%、35.0%和30.0%，SGC/neo无明显变化(图3)。
, 百拇医药 图3 SGC-7901、SGC/neo和SGC/PCNA细胞癌
基因蛋白表达
2.7 转染细胞裸鼠体内的致瘤性 SGC-7901及SGC/neo组在接种第9天全部长出肿瘤，结节出现的时间及生长速度相比差异无显著性意义(P>0.05)。而SGC/PCNA组在接种第19天陆续长出结节，且肿瘤生长缓慢，与SGC-7901组相比差异有显著性意义(P<0.01)。4周时，SGC/PCNA组肿瘤平均直径(0.54±0.13)cm与SGC-7901组(1.51±0.11)cm及SGC/neo组(1.49±0.13)cm相比差异有显著性意义(P均<0.01)。5周后SGC-7901组及SGC/neo组小鼠陆续死亡，至第8周全部死亡。SGC/PCNA组第10周死亡1只，剩余7只小鼠分别于9～16周死亡。
3 讨 论
肿瘤最基本的生物学特征之一是恶性增殖，其增殖过程又与肿瘤细胞浸润、转移及肿瘤复发和患者预后密切相关。因此，遏制肿瘤细胞恶性增殖是肿瘤治疗的基础。PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子不仅参与DNA的生物合成，而且是细胞增殖调控的重要因子。本研究选择PCNA作为胃癌基因治疗的靶位，用真核细胞载体表达的PCNA反义RNA封闭肿瘤细胞PCNA表达，以期控制癌细胞的增殖，达到治疗肿瘤的目的。
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反义核酸通过碱基配对特异性封闭mRNA翻译起始部和核糖体结合位点而使蛋白质翻译停顿，亦可作用于DNA转录时的解链区而抑制基因的转录。本实验中，当pDR-PCNA转染胃癌细胞后，反义探针检测到SGC/PCNA细胞内PCNA正义RNA水平降低47%；FMC测定SGC/PCNA细胞内PCNA抗原含量降低60%。表明所构建的PCNA反义RNA表达质粒能够使胃癌细胞在PCNA基因转录及蛋白质表达两个水平上受到阻碍，由此导致SGC/PCNA细胞生长速度减慢，G1期DNA含量增多，而S期、G2/M期含量降低。此外，还观察了SGC/PCNA细胞中H-ras、c-myc基因表达变化及用FMC测定了细胞内p21ras、突变型p53和c-myc蛋白含量变化。结果表明，在SGC/PCNA细胞中，这些癌基因及其蛋白表达都有不同程度的下调。H-ras基因的点突变和高表达与细胞增殖密切相关，在胃癌及多种肿瘤细胞癌变中起着重要作用〔3〕。c-myc基因在细胞增殖与分化平衡中起重要作用，细胞的恶性增殖常伴有c-myc基因表达失控。这2种癌基因及产物的下调表明PCNA反义RNA在阻断细胞PCNA基因表达的同时，还对其他癌基因表达具有调控作用。野生型p53在DNA损伤修复调控中作为PCNA的上游调节物，两者关系极为密切。突变型p53失去对细胞的正常调控作用，与癌发生有关。本研究中p53蛋白的下调亦与细胞增殖抑制有关。
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将SGC/PCNA细胞接种裸鼠观察到，该转染细胞的成瘤时间延长、瘤体生长缓慢、裸鼠生存期延长。表明用PCNA基因反义RNA阻断其特定的基因表达，可抑制SGC-7901胃癌细胞增殖、改变瘤细胞的恶性表型、抑制移植瘤的生长。这为进一步开展肿瘤基因治疗奠定了实验基础，提供了参考依据。
作者简介:戴 林，医学博士，副主任医师，消化内科副主任。1983年毕业于第四军医大学，主要从事消化内科临床、科研及教学工作，近年主要进行肿瘤基因治疗研究，发表论文20余篇。
①第四军医大学西京医院
参考文献
1 戴 林，张学庸，惠宏襄 等.反义人PCNA基因真核表达载体pDR-PCNA的构建及鉴定.第四军医大学学报，1995，16(5)：379
2 J萨姆布鲁克，EF佛里奇，T曼尼阿蒂斯(金冬雁，黎梦枫 译).分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1992
3 Deng GR.Correlation of mutation of oncogene c-Ha-ras at codon 12 with metastasis and survival of gastric cancer patients.Oncogene Res,1991,6:33
1998-07-20收稿
1998-12-08修回
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关键词：增殖细胞核抗原；胃肿瘤；寡核苷酸类，反义；基因疗法；小鼠，裸
摘 要 为观察PCNA基因反义RNA表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应 摘 要 为观察PCNA基因反义RNA表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应，用DNA重组法将人PCNA基因反向克隆到真核细胞表达质粒pDOR-neo中，构建成PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA，用Lipofect AMINTM介导转染人胃癌细胞系SGC-7901，并接种于裸鼠背部皮下。经G418筛选获得的转染细胞系SGC/PCNA与亲本细胞相比，其生长速度减慢，RNA、蛋白质生物合成受到抑制，S期、G2/M期DNA含量降低，移植瘤生长速度减慢，瘤体平均直径(0.54±0.13)cm，明显小于对照组(1.51±0.11)cm。结果表明，PCNA基因反义RNA表达质粒对胃癌裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用。
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中国图书资料分类号 R735.2
CONSTRUCTION OF PCNA ANTISENSE RNA EXPRESSION VECTOR AND ITS ANTITUMOR EFFECT ON HUMAN GASTRIC CANCER XENOGRAFTS IN NUDE MICE
Dai Lin, Zhang Xueyong, Hui Hongxiang et al.
The 210th Hospital of PLA, Dalian 116021
Abstract To observe the effect of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) antisense RNA on human gastric cancer xenografts in immuno-compromized Balb/c mice and their antitumor roles, an eukaryotic expression vector pDR-PCNA was successfully constructed with DNA recombinant by inserting the human PCNA gene into an eukaryotic expression pDOR-neo in reverse direction. The human gastric cancer cell line SGC-7901 was tansfected with pDR-PCNA by lipofect AMINETM, which was inoculated into the bake of mude mice. After G418 selection, the growth rate of cells, the biosyntheses of proteins and RNA and the DNA contents of transfectants in S-phase and G2/M-phase were significantly suppressed in comparison with that of the parental cell line. The tumor formation time and growth rate of transplantable tumor in nude mice inoculated with SGC/PCNA greatly reduced in comparison with that in nude mice inoculated with SGC-7901, or SGC/neo. The average diameter (0.54±0.13)cm of transplantable tumor in nude mice inoculated with SGC/PCNA was markedly smaller than that of controls (1.51±0.11)cm. The results demonstrated that PCNA antisense RNA could markedly suppress the growth of human grastric cancer transplantalbe tumor in nude mice.
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Key words proliferating cell nuclear antigen; stomach neoplasms; oligonucleotide, antisense; gene therapy; mice, nude
增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助因子，在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。研究表明，PCNA在许多肿瘤组织都有高表达，并与肿瘤的发生、转移关系密切。为研究PCNA基因与胃癌的关系，探索胃癌基因治疗的途径，本研究在构建了人PCNA基因反义RNA真核表达质粒并对胃癌细胞系转染的基础上，进一步观察对人胃癌裸鼠移植瘤的抑瘤效应。
1 材料与方法
1.1 质粒及主要试剂 人pT7hPCNA质粒及真核表达质粒pDOR-neo的来源见文献〔1〕，Lipofect AMINETM脂质体药盒购自Gibco公司，G418购自Sigma公司，[α-32P]UTP、[α-32P]dATP购自北京福瑞公司，内切酶、连接酶购自华美生物技术公司。
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1.2 质粒制备 DNA片段回收、DNA连接、细菌转化及基因鉴定参照文献〔2〕进行。
1.3 DNA转染 用Lipofect AMINETM介导将空载体pDOR-neo及重组载体pDR-PCNA转染至人胃癌细胞SGC-7901，分别命名为SGC/neo和SGC/PCNA，并以SGC-7901作为阴性对照。转染72h后，用G418(400mg/L)筛选3周，挑取单一抗性细胞在G418(100mg/L)下常规培养扩增。
1.4 细胞生长曲线 在24孔培养板中，分别于每孔接种细胞3×104个/ml，每日取各种克隆细胞株3孔消化计数，连续5天，绘制生长曲线。
1.5 核酸分子杂交分析 ①用缺口平移法以[α-32P]dATP标记c-myc、H-ras基因探针，提取SGC-7901和转染72 h后的SGC/PCNA细胞基因组DNA，常规行DNA斑点杂交；②将PCNA基因头尾端克隆至pEG3Z载体HindⅢ和BamHI位点间，分别利用SP6、T7启动子体外转录盒(Riboprobe Kit,美国Promega公司)及[α-32P]UTP标记出正义和反义PCNA RNA单链探针。提取SGC-7901和SGC/PCNA细胞RNA，按常规行RNA斑点杂交。
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1.6 细胞周期测定 3组细胞各取1×106对数生长期单细胞悬液，0.01 mol/L pH 7.4PBS洗涤，70%乙醇固定，PI(Propidium iodide)染色，Partec-CAⅡ型流式细胞仪(FCM)检测细胞DNA含量。
1.7 FMC测定细胞内PCNA含量及癌基因蛋白表达 将3组细胞各分为数管，每管取5×106细胞洗涤，1%副醛固定，离心，封闭后，再分别加入第一抗体(PCNA、p53、H-ras和c-myc)，室温孵育、洗涤后加入FITC-羊抗小鼠IgG(1∶100)，悬浮于200μl PBS液中，过300目筛网，FCM检测。替代对照用正常小鼠IgG。
1.8 裸鼠体内致瘤性观察 将4周龄BALB/c裸小鼠分为3组(SGC/PCNA、SGC/neo和SGC-7901)，每组8只，分别以1×103细胞接种于小鼠背部皮下，观察肿瘤结节出现时间、生长速度、肿瘤大小(用结节直径平均值表示)及小鼠存活期。
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2 结 果
2.1 PCNA反义RNA表达质粒的构建及鉴定 构建过程及鉴定见文献〔4〕。将含有人PCNA的重组质粒命名为pDR-PCNA。
2.2 细胞生长曲线SGC/PCNA细胞生长速度与亲本细胞SGC-7901相比明显减慢，在培养第5天，细胞生长抑制达59%(图1)。
图1 细胞生长曲线
2.3 细胞内mRNA水平变化 PCNA正义RNA探针检测到SGC/PCNA有较强的杂交信号，而SGC-7901无杂交信号产生。表明pDR-PCNA已整合至细胞染色体中。PCNA反义RNA探针检测到SGC-7901有强杂交信号，而SGC/PCNA杂交信号较SGC-7901明显减弱。经对杂交斑点薄层扫描(CX-9000薄层扫描仪，日本岛津)，SGC/PCNA细胞PCNA mRNA被抑制47.5%。
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2.4 转染细胞ras和c-myc基因表达的变化 ras和c-myc DNA探针检测到SGC/PCNA细胞中ras和c-myc基因表达降低(图2)。对杂交斑点图像扫描显示，SGC/PCNA细胞较SGC-7901细胞ras和c-myc基因表达分别下调52.5%和65.1%。
2.5 转染细胞周期分布 FCM分析显示，SGC/PCNA细胞与SGC-7901 相比，G1期细胞增加20.5%，S期和G2/M期分别减少29.8%和21.2%，SGC/neo与SGC-7901细胞相比无明显变化。
图2 SGC-7901和SGC/PCNA细胞
ras、c-myc基因斑点杂交
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A：ras基因斑点杂交； B：c-myc基因斑点杂交；
1：SGC/PCNA细胞； 2：SGC-7901细胞
2.6 FCM测定细胞内PCNA、p53、ras和c-myc抗原含量 ①当替代对照细胞荧光强度为1.9%时，SGC-7901细胞PCNA荧光强度为90%，SGC/neo细胞为82%，而SGC/PCNA细胞为21.6%，表明SGC/PCNA细胞PCNA抗原表达被抑制60%以上。②SGC/PCNA细胞p53、ras和c-myc抗原含量较SGC-7901分别降低13.5%、35.0%和30.0%，SGC/neo无明显变化(图3)。
, 百拇医药 图3 SGC-7901、SGC/neo和SGC/PCNA细胞癌
基因蛋白表达
2.7 转染细胞裸鼠体内的致瘤性 SGC-7901及SGC/neo组在接种第9天全部长出肿瘤，结节出现的时间及生长速度相比差异无显著性意义(P>0.05)。而SGC/PCNA组在接种第19天陆续长出结节，且肿瘤生长缓慢，与SGC-7901组相比差异有显著性意义(P<0.01)。4周时，SGC/PCNA组肿瘤平均直径(0.54±0.13)cm与SGC-7901组(1.51±0.11)cm及SGC/neo组(1.49±0.13)cm相比差异有显著性意义(P均<0.01)。5周后SGC-7901组及SGC/neo组小鼠陆续死亡，至第8周全部死亡。SGC/PCNA组第10周死亡1只，剩余7只小鼠分别于9～16周死亡。
3 讨 论
肿瘤最基本的生物学特征之一是恶性增殖，其增殖过程又与肿瘤细胞浸润、转移及肿瘤复发和患者预后密切相关。因此，遏制肿瘤细胞恶性增殖是肿瘤治疗的基础。PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子不仅参与DNA的生物合成，而且是细胞增殖调控的重要因子。本研究选择PCNA作为胃癌基因治疗的靶位，用真核细胞载体表达的PCNA反义RNA封闭肿瘤细胞PCNA表达，以期控制癌细胞的增殖，达到治疗肿瘤的目的。
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反义核酸通过碱基配对特异性封闭mRNA翻译起始部和核糖体结合位点而使蛋白质翻译停顿，亦可作用于DNA转录时的解链区而抑制基因的转录。本实验中，当pDR-PCNA转染胃癌细胞后，反义探针检测到SGC/PCNA细胞内PCNA正义RNA水平降低47%；FMC测定SGC/PCNA细胞内PCNA抗原含量降低60%。表明所构建的PCNA反义RNA表达质粒能够使胃癌细胞在PCNA基因转录及蛋白质表达两个水平上受到阻碍，由此导致SGC/PCNA细胞生长速度减慢，G1期DNA含量增多，而S期、G2/M期含量降低。此外，还观察了SGC/PCNA细胞中H-ras、c-myc基因表达变化及用FMC测定了细胞内p21ras、突变型p53和c-myc蛋白含量变化。结果表明，在SGC/PCNA细胞中，这些癌基因及其蛋白表达都有不同程度的下调。H-ras基因的点突变和高表达与细胞增殖密切相关，在胃癌及多种肿瘤细胞癌变中起着重要作用〔3〕。c-myc基因在细胞增殖与分化平衡中起重要作用，细胞的恶性增殖常伴有c-myc基因表达失控。这2种癌基因及产物的下调表明PCNA反义RNA在阻断细胞PCNA基因表达的同时，还对其他癌基因表达具有调控作用。野生型p53在DNA损伤修复调控中作为PCNA的上游调节物，两者关系极为密切。突变型p53失去对细胞的正常调控作用，与癌发生有关。本研究中p53蛋白的下调亦与细胞增殖抑制有关。
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将SGC/PCNA细胞接种裸鼠观察到，该转染细胞的成瘤时间延长、瘤体生长缓慢、裸鼠生存期延长。表明用PCNA基因反义RNA阻断其特定的基因表达，可抑制SGC-7901胃癌细胞增殖、改变瘤细胞的恶性表型、抑制移植瘤的生长。这为进一步开展肿瘤基因治疗奠定了实验基础，提供了参考依据。
作者简介:戴 林，医学博士，副主任医师，消化内科副主任。1983年毕业于第四军医大学，主要从事消化内科临床、科研及教学工作，近年主要进行肿瘤基因治疗研究，发表论文20余篇。
①第四军医大学西京医院
参考文献
1 戴 林，张学庸，惠宏襄 等.反义人PCNA基因真核表达载体pDR-PCNA的构建及鉴定.第四军医大学学报，1995，16(5)：379
2 J萨姆布鲁克，EF佛里奇，T曼尼阿蒂斯(金冬雁，黎梦枫 译).分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1992
3 Deng GR.Correlation of mutation of oncogene c-Ha-ras at codon 12 with metastasis and survival of gastric cancer patients.Oncogene Res,1991,6:33
1998-07-20收稿
1998-12-08修回
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