肾性甲旁亢患者原代培养的甲状旁腺细胞PTH分泌的变化
作者：王宁宁 王笑云 陆福明 薛军 胡建明 覃又文 刘翠萍
单位：王宁宁(研究生)；王笑云(南京医科大学第一附属医院肾科 南京，210029)；陆福明(上海华山医院肾科)；薛军(上海华山医院肾科)；胡建明(南京医科大学第一附属医院肾科 南京，210029)；覃又文(南京医科大学第一附属医院内分泌研究室)；刘翠萍(南京医科大学第一附属医院内分泌研究室)
关键词：细胞培养；甲状旁腺激素；肾性甲状旁腺功能亢进
肾脏病与透折肾移植杂志000225 随着透析事业的发展，慢性肾功能衰竭患者的存活率和生存时间明显提高，而继发性甲状旁腺功能亢进(secondary hyperparathyroidism SHPT)作为慢性肾衰的长期并发症，其发病率也逐渐增高，常严重影响患者的生活质量，甚至导致其死亡[1]。由于甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)过度分泌而引起的内环境紊乱是肾性甲状旁腺功能亢进(uremic hyperparathyroidism)发生、发展的中心环节。研究此类患者培养的甲状旁腺细胞分泌PTH的变化，可帮助我们更深入地了解肾性甲旁亢的发病机制，并为其治疗研究提供科学的依据。但限于取材困难等原因，国内尚无单位开展此方面的探索，国际上也只有少数实验室进行甲状旁腺的细胞培养。本实验中，我们在国内首次成功培养了肾性甲旁亢患者的甲状旁腺细胞，并观察其PTH分泌的变化，为进一步开展肾性甲旁亢的研究奠定了基础。
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1 材料和方法
1.1 组织来源 甲状旁腺组织取自接受甲状旁腺全切加前臂移植术[2]的肾性甲旁亢患者，女性，51岁。尿毒症血透6年，血清全段PTH(intact PTH，iPTH)为2000 ng/L(正常，10～70 ng/L)，碱性磷酸酶(ALP)300 U/L(正常 52～90 U/L)，血Ca 3.0 mmol/L，已排除铝中毒骨病，结合甲状旁腺放射性核素断层扫描(ECT)及B超检查确诊为“慢性肾衰继发性甲状旁腺功能亢进”。手术切除的甲状旁腺分别为0.8g，6.4g及8.6g，组织内部见较多出血、坏死及钙化。术中冰冻切片的病理结果为“甲状旁腺增生及腺瘤”。
1.2 甲状旁腺组织的细胞培养 参考LeBoff的实验方法[3]。
手术获得的甲状旁腺组织立即放入4℃的Eagle液中，尽快培养。剪去结缔组织和脂肪组织，去除坏死及钙化的部分，挤压出组织间隙的红细胞。剪成1～2 mm3大小的碎片后，用含0.2%胶原酶Ⅰ的消化液37℃水浴消化约1 h，每隔10 min摇动一次。2000 r/min离心5 min，弃上清，用吸管反复吹打沉淀，促使细胞进一步分散，制成细胞悬液后经200 μm网筛过滤，再次离心，重复3次以去除成纤维细胞、脂肪细胞、红细胞等。将细胞制成悬液，台盼兰染色计数，细胞成活率>90%，其中30%～40%是单个甲状旁腺细胞，余为2～10个细胞组成的细胞小簇。
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细胞培养液用DMEM-HF12，含15%灭活小牛血清、15 mmol/L Hepes、青、链霉素、5 mg/L胰岛素，pH7.4，经测定钙离子浓度为1.05mmol/L，镁离子浓度为0.70 mmol/L。将细胞悬液加入24孔培养板中，细胞浓度为2.5×105个/cm2，置37℃ 5%CO2培养箱孵育，每48 h换液一次。分别于培养30、60、90、120、150和180min及24、48、72、96、120h收集上清液，每个时相的标本均取自3个不同的培养孔。上清液保存在-20℃，待测iPTH。
1.3 培养液上清iPTH的测定 用125I放免法检测，复孔测定。药盒购自BioSource Europe S.A.公司，按其说明书严格操作。
吸取300 μl稀释的上清液、标准及质控加入相应的包被管。每管加100 μl温育缓冲液，室温下振荡1 h。弃去所有试管的液体，洗涤液洗2次。每管加100 μl标记液，室温下振荡1 h。弃去所有试管的液体，洗涤液洗2次。γ计数器计数。
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1.4 统计方法 所有数据用均数±标准差(
±s)表示，用回归分析两组资料间的相互关系，P<0.05认为有统计学差异。
2 结 果
2.1 细胞的形态特点 在培养初期，甲状旁腺细胞有较明显的聚集性，24h后开始贴壁，4～5天长成单层。细胞直径约为10～20 μm，呈多角形或星形，核圆，居中，呈现上皮细胞的形态特征，胞浆内常可见分泌颗粒(见图1)。
图1 培养的甲状旁腺细胞(×400倍)
2.2 细胞iPTH的分泌 在培养后的3h，甲状旁腺细胞iPTH的分泌量逐渐增加，并与培养的时间呈显著正相关(r＝0.97，P<0.01)，见图2。
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图2 培养3小时内甲状旁腺细胞iPTH分泌的变化
在培养3 h以内，随着时间的推移，单位时间内iPTH的分泌量逐渐下降，见图3。
在培养48 h内，甲状旁腺细胞iPTH的分泌仍呈上升趋势，但上升幅度减慢，见图4。
图3 不同时间段内iPTH分泌量的变化
图4 48小时内甲状旁腺细胞iPTH的分泌
3 讨 论
正常情况下，细胞外Ca2+浓度是调节PTH分泌的主要因素。慢性肾衰继发甲旁亢时，甲状旁腺细胞过度分泌PTH，但PTH的分泌量仍与胞外Ca2+浓度有关[4]。一般认为，当胞外Ca2+浓度为1 mmol/L时，甲状旁腺细胞自身的性质最稳定，因此本研究选择DMEM-HF12作为营养液，其钙离子终浓度为1.05 mmol/L。另外，Mg2+浓度也是影响PTH分泌的重要因素，其效力约为Ca2+的一半，本实验中Mg2+的终浓度为0.70 mmol/L。
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实验结果表明，消化后的甲状旁腺细胞能立即分泌PTH，在培养的前3 h内，PTH呈线性分泌，说明细胞保持良好的活性；但分泌的速度随时间的延长有所下降，考虑可能与下列因素有关：①随着胞外PTH浓度的增高，甲状旁腺细胞通过自身的调节作用，分泌的PTH量逐渐减少，以保持胞内外PTH浓度的平衡，②随着培养时间的延长，甲状旁腺细胞自身的性质逐渐发生改变。
本研究还显示，在培养48 h以内，PTH的分泌量仍呈上升趋势，可达10 ng/105细胞。由于甲状旁腺细胞有明显的聚集性，本实验中有较多的细胞没有贴壁，换液后导致未贴壁的细胞大量丢失。我们还发现，在培养48 h后到第二次换液之间，培养液上清中PTH的测定值随时间的延长逐渐下降，由于此阶段培养孔中细胞的数目会逐渐增加，因此提示甲状旁腺细胞的活性可能开始下降。另外，Mithal等[5]在研究培养的牛甲状旁腺细胞时也发现，随着时间的延长，甲状旁腺细胞对胞外Ca2+的反应性降低，他认为这与细胞的钙敏感受体(calcium sensing receptor)表达下降有关。而钙敏感受体是影响PTH分泌及甲状旁腺细胞活性的重要因素[6]。
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综上所述，用本实验方法能成功地培养出人甲状旁腺细胞，在培养初期细胞保持良好的活性，但数天后PTH的分泌能力开始下降。因此，如果以甲状旁腺细胞作为研究对象，为了保证实验结果的可靠性，最好选用培养早期的细胞。
本课题为江苏省科委中日友好国际合作资助项目(基金编号：182DE9902)
参考文献
1，王笑云，王宁宁.慢性肾衰继发性甲旁亢的诊治.医师进修杂志，1999，22(9)：7
2，王笑云，吴宏飞，胡建明等.甲状旁腺全切加前臂移植术治疗继发性甲状旁腺功能亢进.中华医学杂志，1997，77(11)：873
3，LeBoff MS，Shoback D，Brown EM et al.Regulation of parathyroid hormone release and cytosolic calcium by extracellular calcium in dispersed and cultured bovine and pathological human parathyroid cells.J Clin Invest，1985，75：49
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4，Brown EM.Physiology and pathophysiology of the extracellular calcium-sensing receptor.Am J Med，1999，106：238
5，Mithal A，Kifor O，Kifor I et al.The reduced responsiveness of cultured bovine parathyroid cells to extracellular Ca2+ is associated with marked reduction in the expression of extracellular Ca2+sensing receptor messenger ribonucleic acid and protein.Endocrinology，1995，136：3087
6，王宁宁.甲状旁腺钙受体与肾性甲旁亢关系的研究进展.国外医学内分泌学分册，2000，20(1)：26
(2000-02-12收稿，2000-03-06修回), http://www.100md.com
单位：王宁宁(研究生)；王笑云(南京医科大学第一附属医院肾科 南京，210029)；陆福明(上海华山医院肾科)；薛军(上海华山医院肾科)；胡建明(南京医科大学第一附属医院肾科 南京，210029)；覃又文(南京医科大学第一附属医院内分泌研究室)；刘翠萍(南京医科大学第一附属医院内分泌研究室)
关键词：细胞培养；甲状旁腺激素；肾性甲状旁腺功能亢进
肾脏病与透折肾移植杂志000225 随着透析事业的发展，慢性肾功能衰竭患者的存活率和生存时间明显提高，而继发性甲状旁腺功能亢进(secondary hyperparathyroidism SHPT)作为慢性肾衰的长期并发症，其发病率也逐渐增高，常严重影响患者的生活质量，甚至导致其死亡[1]。由于甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)过度分泌而引起的内环境紊乱是肾性甲状旁腺功能亢进(uremic hyperparathyroidism)发生、发展的中心环节。研究此类患者培养的甲状旁腺细胞分泌PTH的变化，可帮助我们更深入地了解肾性甲旁亢的发病机制，并为其治疗研究提供科学的依据。但限于取材困难等原因，国内尚无单位开展此方面的探索，国际上也只有少数实验室进行甲状旁腺的细胞培养。本实验中，我们在国内首次成功培养了肾性甲旁亢患者的甲状旁腺细胞，并观察其PTH分泌的变化，为进一步开展肾性甲旁亢的研究奠定了基础。
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1 材料和方法
1.1 组织来源 甲状旁腺组织取自接受甲状旁腺全切加前臂移植术[2]的肾性甲旁亢患者，女性，51岁。尿毒症血透6年，血清全段PTH(intact PTH，iPTH)为2000 ng/L(正常，10～70 ng/L)，碱性磷酸酶(ALP)300 U/L(正常 52～90 U/L)，血Ca 3.0 mmol/L，已排除铝中毒骨病，结合甲状旁腺放射性核素断层扫描(ECT)及B超检查确诊为“慢性肾衰继发性甲状旁腺功能亢进”。手术切除的甲状旁腺分别为0.8g，6.4g及8.6g，组织内部见较多出血、坏死及钙化。术中冰冻切片的病理结果为“甲状旁腺增生及腺瘤”。
1.2 甲状旁腺组织的细胞培养 参考LeBoff的实验方法[3]。
手术获得的甲状旁腺组织立即放入4℃的Eagle液中，尽快培养。剪去结缔组织和脂肪组织，去除坏死及钙化的部分，挤压出组织间隙的红细胞。剪成1～2 mm3大小的碎片后，用含0.2%胶原酶Ⅰ的消化液37℃水浴消化约1 h，每隔10 min摇动一次。2000 r/min离心5 min，弃上清，用吸管反复吹打沉淀，促使细胞进一步分散，制成细胞悬液后经200 μm网筛过滤，再次离心，重复3次以去除成纤维细胞、脂肪细胞、红细胞等。将细胞制成悬液，台盼兰染色计数，细胞成活率>90%，其中30%～40%是单个甲状旁腺细胞，余为2～10个细胞组成的细胞小簇。
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细胞培养液用DMEM-HF12，含15%灭活小牛血清、15 mmol/L Hepes、青、链霉素、5 mg/L胰岛素，pH7.4，经测定钙离子浓度为1.05mmol/L，镁离子浓度为0.70 mmol/L。将细胞悬液加入24孔培养板中，细胞浓度为2.5×105个/cm2，置37℃ 5%CO2培养箱孵育，每48 h换液一次。分别于培养30、60、90、120、150和180min及24、48、72、96、120h收集上清液，每个时相的标本均取自3个不同的培养孔。上清液保存在-20℃，待测iPTH。
1.3 培养液上清iPTH的测定 用125I放免法检测，复孔测定。药盒购自BioSource Europe S.A.公司，按其说明书严格操作。
吸取300 μl稀释的上清液、标准及质控加入相应的包被管。每管加100 μl温育缓冲液，室温下振荡1 h。弃去所有试管的液体，洗涤液洗2次。每管加100 μl标记液，室温下振荡1 h。弃去所有试管的液体，洗涤液洗2次。γ计数器计数。
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1.4 统计方法 所有数据用均数±标准差(
±s)表示，用回归分析两组资料间的相互关系，P<0.05认为有统计学差异。2 结 果
2.1 细胞的形态特点 在培养初期，甲状旁腺细胞有较明显的聚集性，24h后开始贴壁，4～5天长成单层。细胞直径约为10～20 μm，呈多角形或星形，核圆，居中，呈现上皮细胞的形态特征，胞浆内常可见分泌颗粒(见图1)。
图1 培养的甲状旁腺细胞(×400倍)
2.2 细胞iPTH的分泌 在培养后的3h，甲状旁腺细胞iPTH的分泌量逐渐增加，并与培养的时间呈显著正相关(r＝0.97，P<0.01)，见图2。
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图2 培养3小时内甲状旁腺细胞iPTH分泌的变化
在培养3 h以内，随着时间的推移，单位时间内iPTH的分泌量逐渐下降，见图3。
在培养48 h内，甲状旁腺细胞iPTH的分泌仍呈上升趋势，但上升幅度减慢，见图4。
图3 不同时间段内iPTH分泌量的变化
图4 48小时内甲状旁腺细胞iPTH的分泌
3 讨 论
正常情况下，细胞外Ca2+浓度是调节PTH分泌的主要因素。慢性肾衰继发甲旁亢时，甲状旁腺细胞过度分泌PTH，但PTH的分泌量仍与胞外Ca2+浓度有关[4]。一般认为，当胞外Ca2+浓度为1 mmol/L时，甲状旁腺细胞自身的性质最稳定，因此本研究选择DMEM-HF12作为营养液，其钙离子终浓度为1.05 mmol/L。另外，Mg2+浓度也是影响PTH分泌的重要因素，其效力约为Ca2+的一半，本实验中Mg2+的终浓度为0.70 mmol/L。
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实验结果表明，消化后的甲状旁腺细胞能立即分泌PTH，在培养的前3 h内，PTH呈线性分泌，说明细胞保持良好的活性；但分泌的速度随时间的延长有所下降，考虑可能与下列因素有关：①随着胞外PTH浓度的增高，甲状旁腺细胞通过自身的调节作用，分泌的PTH量逐渐减少，以保持胞内外PTH浓度的平衡，②随着培养时间的延长，甲状旁腺细胞自身的性质逐渐发生改变。
本研究还显示，在培养48 h以内，PTH的分泌量仍呈上升趋势，可达10 ng/105细胞。由于甲状旁腺细胞有明显的聚集性，本实验中有较多的细胞没有贴壁，换液后导致未贴壁的细胞大量丢失。我们还发现，在培养48 h后到第二次换液之间，培养液上清中PTH的测定值随时间的延长逐渐下降，由于此阶段培养孔中细胞的数目会逐渐增加，因此提示甲状旁腺细胞的活性可能开始下降。另外，Mithal等[5]在研究培养的牛甲状旁腺细胞时也发现，随着时间的延长，甲状旁腺细胞对胞外Ca2+的反应性降低，他认为这与细胞的钙敏感受体(calcium sensing receptor)表达下降有关。而钙敏感受体是影响PTH分泌及甲状旁腺细胞活性的重要因素[6]。
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综上所述，用本实验方法能成功地培养出人甲状旁腺细胞，在培养初期细胞保持良好的活性，但数天后PTH的分泌能力开始下降。因此，如果以甲状旁腺细胞作为研究对象，为了保证实验结果的可靠性，最好选用培养早期的细胞。
本课题为江苏省科委中日友好国际合作资助项目(基金编号：182DE9902)
参考文献
1，王笑云，王宁宁.慢性肾衰继发性甲旁亢的诊治.医师进修杂志，1999，22(9)：7
2，王笑云，吴宏飞，胡建明等.甲状旁腺全切加前臂移植术治疗继发性甲状旁腺功能亢进.中华医学杂志，1997，77(11)：873
3，LeBoff MS，Shoback D，Brown EM et al.Regulation of parathyroid hormone release and cytosolic calcium by extracellular calcium in dispersed and cultured bovine and pathological human parathyroid cells.J Clin Invest，1985，75：49
, http://www.100md.com
4，Brown EM.Physiology and pathophysiology of the extracellular calcium-sensing receptor.Am J Med，1999，106：238
5，Mithal A，Kifor O，Kifor I et al.The reduced responsiveness of cultured bovine parathyroid cells to extracellular Ca2+ is associated with marked reduction in the expression of extracellular Ca2+sensing receptor messenger ribonucleic acid and protein.Endocrinology，1995，136：3087
6，王宁宁.甲状旁腺钙受体与肾性甲旁亢关系的研究进展.国外医学内分泌学分册，2000，20(1)：26
(2000-02-12收稿，2000-03-06修回), http://www.100md.com