肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的制备及鉴定
作者：潘劲草 黄志成 余文炳 李学梅
单位：杭州市卫生防疫站(杭州，310006)
关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7；脂多糖；抗原
中国人兽共患病杂志990319 摘 要 目的 提取纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7脂多糖(LPS)抗原并对其鉴定，以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值。方法 应用热酚水法提取EHEC O157∶H7 S型933株LPS抗原，并经超速离心纯化。提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和鲎试剂凝集活性。LPS抗原致敏醛化鸡血球，IHA法检测EHEC O157∶H7及其它肠道病原菌的抗血清。对凝集阳性的抗血清，经菌体抗原吸收、O157 LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验，确定抗血清与LPS的反应位置。结果 纯化后的O157 LPS抗原含多糖，具鲎试剂凝集活性，未检出核酸，蛋白含量<0.5%。O157 LPS IHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应，而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应，交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清。EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清与O157 LPS反应位置为多糖部分，而EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分。结论 热酚水法提取的EHEC O157 LPS抗原纯度高、特异性强，可望应用于抗O157抗体的检测。O157 LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性。
, 百拇医药
THE PREPARATION OF LIPOPOLYSACCHARIDE ANTIGEN OF
ENTEROHEMORRHAGIC ESCHERICHIA COLI O157∶H7 AND ITS IDENTIFICATION
Pan Jincao Huang Zhicheng Yu Wenbing Li Xuemei
(Hangzhou sanitary and anti-epidemic station,Hangzhou,310006)
ABSTRACT Aim The lipopolysaccharide(LPS) antigen of enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC) O157∶H7 was prepared and identified to estimate the value of its application in detecting for anti-EHEC O157 antibody.Methods The LPS antigen was prepared from EHEC O157∶H7 strain 933 with hot phenol water method and purified by ultracentrifugation.The contents of polysaccharide,nucleic acid and protein in the extract and its activity of agglutinating limulus amoebcyte lysate were detected.The antigen was used to detect EHEC O157∶H7 and other enteric pathogenic bacteria antisera by IHA.The reaction positions between LPS and the antisera having positive agglutinating reaction were identified by bacteria somatic antigen absorption test,O157 LPS antigen and polysaccharide antigen inhibition test.Results The O157 LPS antigen contains polysaccharide and has activity of agglutinating limulus amoebcyte lysate,in which nucleic acid has not been detected out and protein content is less than 0.5%(w/w).Anti-O157 polyclone and monoclone antibodies both react intensely to the O157 LPS antigen.There are no cross-reaction between the antigen and most antisera of other enteric bacteria,while cross-reactions are just found between the antigen and antisera of Salmonela O30,EIEC O144∶K?,ESISC Ⅳ.EHEC O157 and Salmonela O30 antisera react to polysaccharide of O157 LPS.EIEC O144∶K? and ESIECⅣ antisera react to lipid A of O157 LPS.Conclusion The O157 LPS antigen has high purity and reaction specificity.It could be used to detect anti-O157 antibody and reaction specificity may be raised further if lipid A is excluded from O157 LPS.
, 百拇医药
KEY WORDS EHEC O157∶H7 LPS antigen
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7菌的特异性O抗原位于其细胞壁外膜脂多糖(Lipoploysaccharide,LPS)的多糖侧链上。该菌感染患者，可诱导机体产生特异性抗O157抗体〔1，2〕。国外已有应用LPS抗原检测抗O157抗体以诊断EHEC O157感染的报告〔3〕。国内尚未见此方面工作的报道。本文提取纯化了EHEC O157∶H7的LPS抗原，并对其进行了初步鉴定，以探讨其用于抗O157抗体检测的价值。
1 材料与方法
1.1 菌株 EHEC O157∶H7 S型933株购自中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。
, http://www.100md.com 1.2 O157 LPS的制备
1.2.1 菌粉制备 细菌于普通营养琼脂37℃培养24h后，生理盐水洗下，按常规制成丙酮菌粉。
1.2.2 O157 LPS粗制 热酚水法提取LPS〔4〕，步骤如下：菌液加等量90%苯酚溶液于68℃水浴中搅拌30min，冷却后5 000r/min离心45min，取水相。余下部分再加等量水，按上法重复提2次，离心后取水相。水相溶液装于透析袋中，流水透析24h去酚，再蒸馏水透析48h，每天换水5次。浓缩后加6倍量无水乙醇，置4℃ 20min,5 000r/min离心15min，沉淀即为粗制LPS。
1.2.3 O157 LPS纯化 适量蒸馏水溶解提取的LPS，100 000×g超速离心4h，去上清，沉淀再加蒸馏水悬浮，再离心1次，沉淀即为LPS纯化品。
1.2.4 O157 LPS的水解去脂 LPS溶于醋酸溶液，100℃水解30min,1 000r/min离心10min沉淀类脂，取上清置透析袋4℃透析去酸后，即为去脂质多糖抗原。
, 百拇医药
1.3 O157 LPS鉴定
1.3.1 LPS多糖含量测定 蒽酮硫酸法测定，以葡聚糖制作浓度标准曲线。
1.3.2 LPS核酸含量检测 紫外光谱吸收法检测。
1.3.3 LPS蛋白含量测定 考马斯亮蓝染色法测定，以BSA制作浓度标准曲线。
1.3.4 LPS鲎试剂凝集活性测定 采用试管法。鲎试剂为湛江中美生物有限公司产品，灵敏度为0.5EU/ml，批号960726；细菌内毒素工作标准品为中国药品生物制品检定所，批号9703。取0.1ml鲎试剂加等量不同稀释度的LPS,37℃水浴1h，试管倒置180°凝胶不变形为阳性。同时以无热原水和内毒素工作标准品分别作阴性和阳性对照。
1.3.5 O157 LPS间接血凝试验(IHA)检测肠道病原菌抗血清 O157 LPS抗原以最适量致敏醛化鸡血球，IHA法按常规〔5〕，致敏血球工作浓度为1%，血凝反应板为90°V型板。EHEC O157、EHEC H7、EIEC OK多价Ⅰ—Ⅱ及单价抗血清为中国药品生物制品检定所产品；EPEC、ETEC、EIEC的OK多价和单价血清及沙门氏菌O30和O30(2)为卫生部成都生物制品研究所产品；ESIEC Ⅰ—Ⅵ群血清为中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所产品；沙门氏菌A-F多价、志贺氏菌各种多价及单价血清为卫生部兰州生物制品研究所产品；霍乱弧菌O1群多价和O139血清为浙江省卫生防疫站产品。多价血清如凝集，再做相应单价血清。凝集血清再与未致敏醛化血球反应，以排除非特异性反应。
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1.3.6 O157 LPS血清反应位置确定 O157 LPS IHA凝集阳性血清作O157菌体抗原吸收、O157 LPS抗原抑制及去脂质多糖抗原抑制试验，并设盐水处理对照；以比盐水处理对照低二个滴度以上，判为具吸收或抑制作用。同时凝集血清对EHEC O157 933株培养菌落作玻片凝集试验。
2 结果
2.1 O157 LPS产率 10g 933株菌粉获LPS 45.2mg，产率为0.45%(w/w)。
2.2 O157 LPS多糖含量 蒽酮硫酸法测定多糖含量为20%(w/w)。
2.3 O157 LPS核酸含量 未经超速离心纯化的粗制LPS于260nm处有一高吸收峰，经超速离心后的纯化LPS于260nm处未见吸收峰。
2.4 O157 LPS蛋白含量 考马斯亮蓝染色法测定，蛋白含量<0.5%(w/w)。
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2.5 鲎试剂凝集活性 鲎试验阳性的最低LPS浓度为2.5ng/ml。
2.6 O157 LPS IHA检测肠道病原菌抗血清 结果见表1。凝集阳性血清均不凝集未致敏醛化鸡血球。
表1 O157 LPS IHA检测肠道病原菌抗血清的结果
Table 1 The results of detecting antisera of enteric bacteria by O157 LPS IHA 抗血清
antisera
凝集效价
agglutinating
value
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抗血清
antisera
凝集效价
agglutinating
value
霍乱弧菌O1多价+O139
<1∶2
EPEC OK多价1
<1∶2
沙门氏菌A-F多价
<1∶2
EPEC OK多价2
, 百拇医药
<1∶2
沙门氏菌O30
1∶256
EPEC OK多价3
<1∶2
沙门氏菌O30(2)
<1∶2
ETEC OK多价4
<1∶2
志贺氏菌4种多价
<1∶2
ETEC OK多价5
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<1∶2
痢疾志贺氏3-7型多价
<1∶2
EIEC OK多价6
<1∶2
痢疾志贺氏8-12型多价
<1∶2
EIEC OK多价7
<1∶2
鲍氏志贺氏1-6型多价
<1∶2
EIEC OK多价Ⅰ
, 百拇医药
<1∶2
鲍氏志贺氏7-11型多价
<1∶2
EIEC OK多价Ⅱ
1∶64
鲍氏志贺氏12-15型多价
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO136∶K78
<1∶2
ESIEC Ⅰ
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO143∶K?
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<1∶2
ESIEC Ⅱ
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO144:K?
1∶128
ESIEC Ⅲ
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO152:K?
<1∶2
ESIEC Ⅳ
1∶64
EIEC OK多价ⅡO164∶K?
, 百拇医药
<1∶2
ESIEC Ⅴ
<1∶2
EHEC O157(多抗)
1∶512
ESIEC Ⅵ
1∶4
EHEC O157(单抗)
1∶256
EHEC H7
<1∶2
2.7 O157 LPS血清反应位置确定 O157 LPS IHA凝集血清的O157菌体抗原吸收及O157 LPS抑制和去脂质多糖抗原抑制试验结果见表2。EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清玻片凝集933株阳性，O144∶K?及ESIEC Ⅳ抗血清玻片凝集阴性。表2 O157菌体抗原吸收、O157 LPS和去脂质多糖抗原抑制试验结果
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Table 2 The results of O157 bacteria somatic antigen absorption test,O157 LPS antigen and polysaccharide antigen suppression test 抗血清
antisera
血凝效价
agglutinating value
菌体抗原吸收
bacteria somatic
antigen
absorption
O157 LPS抑制
, 百拇医药
O157 LPS
antigen
suppression
去脂质多糖
抗原抑制
polysaccharide
antige suppression
NS处理
对照
NS control
O157(多克隆)
1∶64
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1∶64
1∶64
1∶512
沙门氏菌O30
1∶16
1∶4
1∶64
1∶256
EIEC O144∶K?
1∶128
1∶4
1∶128
1∶128
, 百拇医药
ESIECⅣ
1∶32
<1∶8
1∶32
1∶64
3 讨论
热酚水法是目前用于革兰氏阴性菌S型LPS提取的最常用方法。S型LPS是由脂质A、核心寡聚糖及特异多糖侧链组成，该分子为一两性分子，脂质A疏水，而多糖侧链具亲水性，故LPS和其它可溶于水的核酸、多糖等溶于水相，而大部分蛋白质则溶于酚相而被除去。随后超速离心可使LPS沉淀，与溶液中的核酸和多糖分开，从而得到较为纯净的LPS。本文应用此法提纯的EHEC O157 S型933株提取物含多糖，具鲎试剂凝集活性，为典型的革兰氏阴性菌LPS，紫外光谱吸收法未检出核酸，蛋白含量<0.5%，纯度较高。
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LPS的特异多糖侧链的糖残基种类和排列决定菌株O抗原的特异性。EHEC O157∶H7的O抗原即位于其LPS的多糖侧链上。O157 LPS IHA检测多种肠道病原菌抗血清，结果表明(表1)，O157 LPS 与抗O157血清反应强烈，而与绝大多数其它肠道病原菌抗血清无交叉反应，仅与沙门氏菌O30、ESIECⅣ、EIEC O144∶K?抗血清有较强反应，与ESIECⅥ抗血清反应较弱。有资料表明〔6〕，EHEC O157与沙门氏菌O30抗原交叉，本文结果与此相符。EIEC OK多价6含O144∶K+抗血清，然而该OK多价6和其O144∶K+单价抗血清均未见与O157 LPS反应，表明二家单位生产的EIEC O144抗血清存在一定的差异。
玻片凝集试验表明，并非所有与O157 LPS反应的血清能使O157菌株凝集，提示LPS的提取可能使原先不在菌体表面表达的某些抗原决定簇得以暴露。为此我们通过弱酸水解，破坏LPS中多糖与脂质A间的糖苷链，离心除去不溶于水的脂质A，获取去脂质多糖抗原，并用该抗原与O157 LPS抗原同时进行凝集抑制试验以及用菌体抗原做吸收试验。结果表明(表2)，菌体抗原吸收、去脂质多糖抗原及LPS抗原抑制均可使EHEC O157、沙门氏菌O30抗血清凝集效价降低，提示此二种抗血清含与O157 LPS多糖部分反应的抗体；而对ESIECⅣ及EIEC O144∶K?抗血清仅LPS具抑制作用，菌体抗原吸收和去脂质多糖抗原抑制则未能使其凝集效价降低，提示ESIECⅣ和EIEC O144∶K?抗血清与O157 LPS 反应位置为脂质A部分。此结果亦解释，二家单位EIEC O144抗血清对O157 LPS反应的不同是由于EIEC OK多价Ⅱ及其单价O144∶K?抗血清中未除去抗脂质A抗体所致。
, 百拇医药
本文结果表明，O157 LPS抗原可与特异性抗O157抗体发生反应，与其它肠道病原菌交叉反应较少，有望应有于IHA、ELISA等用以检测抗O157抗体。如使用去脂质多糖抗原，则可进一步提高反应特异性。
4 参考文献
1.Bitzan M,et al.High incidence of serum antibodies to Escherichia coli O157 lipopolysaccharide in children with haemolytic uraemic syndrome.J Pediatr,1991,119:380.
2.Chart H,et al.Serological identification of Escherichia coli O157∶H7 infection in haemolytic uraemic syndrome.Lancet,1991,337:138.
, 百拇医药
3.Bitzan M and Karch H.Indirect hemagglutination assay for diagnosis of Escherichia coli O157 infection in patients with hemolytic uremic syndrome.J Clin Microbiol,1992,30:1174-1178.
4.焦炳华主编.分子内毒素学.上海：上海科学技术文献出版社,1995.352.
5.韩澄源编著.间接血凝技术.北京：科学技术出版社,1979.89.
6.中国预防医学院流行病学微生物学研究所,O157∶H7大肠杆菌检验技术学习班讲义.北京,1996.25.
收稿日期：1998年6月25日 修回日期：1998年10月15日, 百拇医药
单位：杭州市卫生防疫站(杭州，310006)
关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7；脂多糖；抗原
中国人兽共患病杂志990319 摘 要 目的 提取纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7脂多糖(LPS)抗原并对其鉴定，以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值。方法 应用热酚水法提取EHEC O157∶H7 S型933株LPS抗原，并经超速离心纯化。提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和鲎试剂凝集活性。LPS抗原致敏醛化鸡血球，IHA法检测EHEC O157∶H7及其它肠道病原菌的抗血清。对凝集阳性的抗血清，经菌体抗原吸收、O157 LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验，确定抗血清与LPS的反应位置。结果 纯化后的O157 LPS抗原含多糖，具鲎试剂凝集活性，未检出核酸，蛋白含量<0.5%。O157 LPS IHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应，而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应，交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清。EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清与O157 LPS反应位置为多糖部分，而EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分。结论 热酚水法提取的EHEC O157 LPS抗原纯度高、特异性强，可望应用于抗O157抗体的检测。O157 LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性。
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THE PREPARATION OF LIPOPOLYSACCHARIDE ANTIGEN OF
ENTEROHEMORRHAGIC ESCHERICHIA COLI O157∶H7 AND ITS IDENTIFICATION
Pan Jincao Huang Zhicheng Yu Wenbing Li Xuemei
(Hangzhou sanitary and anti-epidemic station,Hangzhou,310006)
ABSTRACT Aim The lipopolysaccharide(LPS) antigen of enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC) O157∶H7 was prepared and identified to estimate the value of its application in detecting for anti-EHEC O157 antibody.Methods The LPS antigen was prepared from EHEC O157∶H7 strain 933 with hot phenol water method and purified by ultracentrifugation.The contents of polysaccharide,nucleic acid and protein in the extract and its activity of agglutinating limulus amoebcyte lysate were detected.The antigen was used to detect EHEC O157∶H7 and other enteric pathogenic bacteria antisera by IHA.The reaction positions between LPS and the antisera having positive agglutinating reaction were identified by bacteria somatic antigen absorption test,O157 LPS antigen and polysaccharide antigen inhibition test.Results The O157 LPS antigen contains polysaccharide and has activity of agglutinating limulus amoebcyte lysate,in which nucleic acid has not been detected out and protein content is less than 0.5%(w/w).Anti-O157 polyclone and monoclone antibodies both react intensely to the O157 LPS antigen.There are no cross-reaction between the antigen and most antisera of other enteric bacteria,while cross-reactions are just found between the antigen and antisera of Salmonela O30,EIEC O144∶K?,ESISC Ⅳ.EHEC O157 and Salmonela O30 antisera react to polysaccharide of O157 LPS.EIEC O144∶K? and ESIECⅣ antisera react to lipid A of O157 LPS.Conclusion The O157 LPS antigen has high purity and reaction specificity.It could be used to detect anti-O157 antibody and reaction specificity may be raised further if lipid A is excluded from O157 LPS.
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KEY WORDS EHEC O157∶H7 LPS antigen
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7菌的特异性O抗原位于其细胞壁外膜脂多糖(Lipoploysaccharide,LPS)的多糖侧链上。该菌感染患者，可诱导机体产生特异性抗O157抗体〔1，2〕。国外已有应用LPS抗原检测抗O157抗体以诊断EHEC O157感染的报告〔3〕。国内尚未见此方面工作的报道。本文提取纯化了EHEC O157∶H7的LPS抗原，并对其进行了初步鉴定，以探讨其用于抗O157抗体检测的价值。
1 材料与方法
1.1 菌株 EHEC O157∶H7 S型933株购自中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。
, http://www.100md.com 1.2 O157 LPS的制备
1.2.1 菌粉制备 细菌于普通营养琼脂37℃培养24h后，生理盐水洗下，按常规制成丙酮菌粉。
1.2.2 O157 LPS粗制 热酚水法提取LPS〔4〕，步骤如下：菌液加等量90%苯酚溶液于68℃水浴中搅拌30min，冷却后5 000r/min离心45min，取水相。余下部分再加等量水，按上法重复提2次，离心后取水相。水相溶液装于透析袋中，流水透析24h去酚，再蒸馏水透析48h，每天换水5次。浓缩后加6倍量无水乙醇，置4℃ 20min,5 000r/min离心15min，沉淀即为粗制LPS。
1.2.3 O157 LPS纯化 适量蒸馏水溶解提取的LPS，100 000×g超速离心4h，去上清，沉淀再加蒸馏水悬浮，再离心1次，沉淀即为LPS纯化品。
1.2.4 O157 LPS的水解去脂 LPS溶于醋酸溶液，100℃水解30min,1 000r/min离心10min沉淀类脂，取上清置透析袋4℃透析去酸后，即为去脂质多糖抗原。
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1.3 O157 LPS鉴定
1.3.1 LPS多糖含量测定 蒽酮硫酸法测定，以葡聚糖制作浓度标准曲线。
1.3.2 LPS核酸含量检测 紫外光谱吸收法检测。
1.3.3 LPS蛋白含量测定 考马斯亮蓝染色法测定，以BSA制作浓度标准曲线。
1.3.4 LPS鲎试剂凝集活性测定 采用试管法。鲎试剂为湛江中美生物有限公司产品，灵敏度为0.5EU/ml，批号960726；细菌内毒素工作标准品为中国药品生物制品检定所，批号9703。取0.1ml鲎试剂加等量不同稀释度的LPS,37℃水浴1h，试管倒置180°凝胶不变形为阳性。同时以无热原水和内毒素工作标准品分别作阴性和阳性对照。
1.3.5 O157 LPS间接血凝试验(IHA)检测肠道病原菌抗血清 O157 LPS抗原以最适量致敏醛化鸡血球，IHA法按常规〔5〕，致敏血球工作浓度为1%，血凝反应板为90°V型板。EHEC O157、EHEC H7、EIEC OK多价Ⅰ—Ⅱ及单价抗血清为中国药品生物制品检定所产品；EPEC、ETEC、EIEC的OK多价和单价血清及沙门氏菌O30和O30(2)为卫生部成都生物制品研究所产品；ESIEC Ⅰ—Ⅵ群血清为中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所产品；沙门氏菌A-F多价、志贺氏菌各种多价及单价血清为卫生部兰州生物制品研究所产品；霍乱弧菌O1群多价和O139血清为浙江省卫生防疫站产品。多价血清如凝集，再做相应单价血清。凝集血清再与未致敏醛化血球反应，以排除非特异性反应。
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1.3.6 O157 LPS血清反应位置确定 O157 LPS IHA凝集阳性血清作O157菌体抗原吸收、O157 LPS抗原抑制及去脂质多糖抗原抑制试验，并设盐水处理对照；以比盐水处理对照低二个滴度以上，判为具吸收或抑制作用。同时凝集血清对EHEC O157 933株培养菌落作玻片凝集试验。
2 结果
2.1 O157 LPS产率 10g 933株菌粉获LPS 45.2mg，产率为0.45%(w/w)。
2.2 O157 LPS多糖含量 蒽酮硫酸法测定多糖含量为20%(w/w)。
2.3 O157 LPS核酸含量 未经超速离心纯化的粗制LPS于260nm处有一高吸收峰，经超速离心后的纯化LPS于260nm处未见吸收峰。
2.4 O157 LPS蛋白含量 考马斯亮蓝染色法测定，蛋白含量<0.5%(w/w)。
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2.5 鲎试剂凝集活性 鲎试验阳性的最低LPS浓度为2.5ng/ml。
2.6 O157 LPS IHA检测肠道病原菌抗血清 结果见表1。凝集阳性血清均不凝集未致敏醛化鸡血球。
表1 O157 LPS IHA检测肠道病原菌抗血清的结果
Table 1 The results of detecting antisera of enteric bacteria by O157 LPS IHA 抗血清
antisera
凝集效价
agglutinating
value
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抗血清
antisera
凝集效价
agglutinating
value
霍乱弧菌O1多价+O139
<1∶2
EPEC OK多价1
<1∶2
沙门氏菌A-F多价
<1∶2
EPEC OK多价2
, 百拇医药
<1∶2
沙门氏菌O30
1∶256
EPEC OK多价3
<1∶2
沙门氏菌O30(2)
<1∶2
ETEC OK多价4
<1∶2
志贺氏菌4种多价
<1∶2
ETEC OK多价5
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<1∶2
痢疾志贺氏3-7型多价
<1∶2
EIEC OK多价6
<1∶2
痢疾志贺氏8-12型多价
<1∶2
EIEC OK多价7
<1∶2
鲍氏志贺氏1-6型多价
<1∶2
EIEC OK多价Ⅰ
, 百拇医药
<1∶2
鲍氏志贺氏7-11型多价
<1∶2
EIEC OK多价Ⅱ
1∶64
鲍氏志贺氏12-15型多价
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO136∶K78
<1∶2
ESIEC Ⅰ
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO143∶K?
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ESIEC Ⅱ
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO144:K?
1∶128
ESIEC Ⅲ
<1∶2
EIEC OK多价ⅡO152:K?
<1∶2
ESIEC Ⅳ
1∶64
EIEC OK多价ⅡO164∶K?
, 百拇医药
<1∶2
ESIEC Ⅴ
<1∶2
EHEC O157(多抗)
1∶512
ESIEC Ⅵ
1∶4
EHEC O157(单抗)
1∶256
EHEC H7
<1∶2
2.7 O157 LPS血清反应位置确定 O157 LPS IHA凝集血清的O157菌体抗原吸收及O157 LPS抑制和去脂质多糖抗原抑制试验结果见表2。EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清玻片凝集933株阳性，O144∶K?及ESIEC Ⅳ抗血清玻片凝集阴性。表2 O157菌体抗原吸收、O157 LPS和去脂质多糖抗原抑制试验结果
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Table 2 The results of O157 bacteria somatic antigen absorption test,O157 LPS antigen and polysaccharide antigen suppression test 抗血清
antisera
血凝效价
agglutinating value
菌体抗原吸收
bacteria somatic
antigen
absorption
O157 LPS抑制
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O157 LPS
antigen
suppression
去脂质多糖
抗原抑制
polysaccharide
antige suppression
NS处理
对照
NS control
O157(多克隆)
1∶64
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1∶64
1∶64
1∶512
沙门氏菌O30
1∶16
1∶4
1∶64
1∶256
EIEC O144∶K?
1∶128
1∶4
1∶128
1∶128
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ESIECⅣ
1∶32
<1∶8
1∶32
1∶64
3 讨论
热酚水法是目前用于革兰氏阴性菌S型LPS提取的最常用方法。S型LPS是由脂质A、核心寡聚糖及特异多糖侧链组成，该分子为一两性分子，脂质A疏水，而多糖侧链具亲水性，故LPS和其它可溶于水的核酸、多糖等溶于水相，而大部分蛋白质则溶于酚相而被除去。随后超速离心可使LPS沉淀，与溶液中的核酸和多糖分开，从而得到较为纯净的LPS。本文应用此法提纯的EHEC O157 S型933株提取物含多糖，具鲎试剂凝集活性，为典型的革兰氏阴性菌LPS，紫外光谱吸收法未检出核酸，蛋白含量<0.5%，纯度较高。
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LPS的特异多糖侧链的糖残基种类和排列决定菌株O抗原的特异性。EHEC O157∶H7的O抗原即位于其LPS的多糖侧链上。O157 LPS IHA检测多种肠道病原菌抗血清，结果表明(表1)，O157 LPS 与抗O157血清反应强烈，而与绝大多数其它肠道病原菌抗血清无交叉反应，仅与沙门氏菌O30、ESIECⅣ、EIEC O144∶K?抗血清有较强反应，与ESIECⅥ抗血清反应较弱。有资料表明〔6〕，EHEC O157与沙门氏菌O30抗原交叉，本文结果与此相符。EIEC OK多价6含O144∶K+抗血清，然而该OK多价6和其O144∶K+单价抗血清均未见与O157 LPS反应，表明二家单位生产的EIEC O144抗血清存在一定的差异。
玻片凝集试验表明，并非所有与O157 LPS反应的血清能使O157菌株凝集，提示LPS的提取可能使原先不在菌体表面表达的某些抗原决定簇得以暴露。为此我们通过弱酸水解，破坏LPS中多糖与脂质A间的糖苷链，离心除去不溶于水的脂质A，获取去脂质多糖抗原，并用该抗原与O157 LPS抗原同时进行凝集抑制试验以及用菌体抗原做吸收试验。结果表明(表2)，菌体抗原吸收、去脂质多糖抗原及LPS抗原抑制均可使EHEC O157、沙门氏菌O30抗血清凝集效价降低，提示此二种抗血清含与O157 LPS多糖部分反应的抗体；而对ESIECⅣ及EIEC O144∶K?抗血清仅LPS具抑制作用，菌体抗原吸收和去脂质多糖抗原抑制则未能使其凝集效价降低，提示ESIECⅣ和EIEC O144∶K?抗血清与O157 LPS 反应位置为脂质A部分。此结果亦解释，二家单位EIEC O144抗血清对O157 LPS反应的不同是由于EIEC OK多价Ⅱ及其单价O144∶K?抗血清中未除去抗脂质A抗体所致。
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本文结果表明，O157 LPS抗原可与特异性抗O157抗体发生反应，与其它肠道病原菌交叉反应较少，有望应有于IHA、ELISA等用以检测抗O157抗体。如使用去脂质多糖抗原，则可进一步提高反应特异性。
4 参考文献
1.Bitzan M,et al.High incidence of serum antibodies to Escherichia coli O157 lipopolysaccharide in children with haemolytic uraemic syndrome.J Pediatr,1991,119:380.
2.Chart H,et al.Serological identification of Escherichia coli O157∶H7 infection in haemolytic uraemic syndrome.Lancet,1991,337:138.
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3.Bitzan M and Karch H.Indirect hemagglutination assay for diagnosis of Escherichia coli O157 infection in patients with hemolytic uremic syndrome.J Clin Microbiol,1992,30:1174-1178.
4.焦炳华主编.分子内毒素学.上海：上海科学技术文献出版社,1995.352.
5.韩澄源编著.间接血凝技术.北京：科学技术出版社,1979.89.
6.中国预防医学院流行病学微生物学研究所,O157∶H7大肠杆菌检验技术学习班讲义.北京,1996.25.
收稿日期：1998年6月25日 修回日期：1998年10月15日, 百拇医药