PCR杂交梳在出血热肾病综合征早期诊断中的应用
作者：邹建龙 王明生 陈黎明
单位：湖南省津市市人民医院 津市 415400
关键词：出血热，流行性；聚合酶链反应；诊断
湖南医学000134【中图分类号】 R512.8 【文献标识码】 B 【文章编号】 1001-9421(2000)01-0065-02
目前国内外常用PCR技术对出血热肾病综合征(HFRS)病毒进行检测，该技术具有灵敏度高，特异性强，简便快速等优点[1]，但被检标本极微量的污染均可造成假阳性，影响结果的准确性[2]。而培养法及其它检测方法敏感性及特异性均低，且费时、费力。作者等1998～1999年采用PCR杂交梳技术对HFRS病毒进行检测，效果满意，现报道如下。
1 材料与方法
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1.1 材料 ①对照病毒株来源：HTNV-114由湖北医科大学病毒所提供。②临床标本来源：采集本院及330医院30例发病10 d以内的HFRS患者标本共40份，(其诊断符合1986年全国HFRS会议诊断标准)，其中血清30份，尿沉淀细胞10份。同时对30例患者全程随访，按各病期采集血清标本共118份。另采集同期发热性疾病(上呼吸道感染、泌尿道感染)血、尿标本各10份，采集正常人血清及尿液各5份作为对照。③试剂来源：PCR杂交梳试剂盒及电泳法PCR试剂盒均由上海复星实业股份有限公司提供。
1.2 方法 (1)标本RNA提取：所采标本立即用于RNA提取或短期冷藏(2～8 ℃)不超过48 h，与标本接触的仪器均经无菌处理，全过程严格无毒操作。血、尿标本RNA提取采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法快速抽提[3]。(2)RT-PCR：每人份取15 μl PCR杂交梳反应液，2 μl聚合酶和3 μl样品上清，混合，加入一滴石蜡油，标记后漩涡振荡20 s，8 000 r/min离心30 s。取阳性对照和阴性对照标本，按上述步骤操作。反应管放在扩增仪上42 ℃，保温60 min后立即进行扩增，按93 ℃→45 s→55 ℃ 45 s→72 ℃ 60 s顺序循环40次，最后72 ℃延时5 min。结束后取15 μl产物进行电泳，观察阳性条带，阴性、阳性对照判断结果。(3)反相杂交：①DNA变性：在扩增后的HFRS病毒反应管中分别加入20 μl DNA变性液，充分混匀，室温放置2 min。②杂交：在酶板条第1排孔中各加入40 μl杂交缓冲液A按顺序加入10 μl已变性DNA，混匀，按相应序号插入杂交膜，37 ℃培养箱保温，至微孔中杂交缓冲液A被杂交膜刚好吸干，约7～10 min。③洗膜：在酶板条第2排孔中各加入1滴杂交缓冲液B后，把第1排孔中的杂交梳拿出按相应序号插入第2排孔中，37 ℃培养箱保温，至微孔中杂交缓冲液B刚好被杂交膜吸干，约7～10 min。④酶工作液制备：吸取SA-AP酶原液10 μl至SA-AP酶液瓶中，混匀。⑤酶结合：在酶板条第3排孔中各加入1滴SA-AP酶工作液，把第2排孔中的杂交梳拿出按相应序号插入第3排孔中，25 ℃反应7～10 min，至微孔中工作液被杂交膜刚好吸干。⑥显色：在酶板条第4排孔中加入显色底物液A，显色底物液B各1滴，混匀，把第3排孔中的杂交梳拿出按相应序号插入第4排孔中，25 ℃反应15 min，拿出杂交梳判断结果。若在杂交膜上出现蓝紫色斑点则为阳性。
, 百拇医药
2 结果
用RT-PCR方法扩增4份标准菌株(HTNV-114)及5份正常人血清标本，并对PCR扩增后产物进行反相杂交，结果4份标准菌株均呈阳性，5份正常人血清标本均阴性。用同样方法对30例早期HFRS患者的40份血清、尿标本进行检测，结果均呈阳性；对其他发热性疾病血、尿标本检测均阴性。HTNV-114阳性对照均为阳性(见表1)。另对30例HFRS患者按各病期所采集的血清标本118份进行检测，结果发热期、休克期、少尿期、多尿期、恢复期阳性率分别为100%(20/20)，100%(28/28)，80%(24/30)，15%(3/20)，0(0/20)(见表2)。用传统的电泳法PCR技术检测以上标本出现少数假阳性及假阴性(见表1，2)。
表1 各类标本PCR与PCR杂交梳检测结果比较 标本
来源
n
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PCR
PCR杂交梳
血清
HFRS
30
28
30
发热疾病
10
1
0
阴性对照
5
, 百拇医药 0
0
尿液
HFRS
10
9
10
发热疾病
10
0
0
阴性对照
5
0
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0
表2 HFRS各病期血清标本两种方法检测的比较(例，%) 病期
n
PCR阳性
PCR杂交梳
发热期
20
19(95.00)
20(100.0)
休克期
28
27(96.43)
, http://www.100md.com
28(100.0)
少尿期
30
22(73.33)
24(80.00)
恢复期
20
0(0)
0(0)
3 讨论
李盈盈等[4]利用PCR技术对HFRS病毒进行分型，结果与血清学分型一致，已充分说明PCR技术灵敏度高，特异性强。但在实际应用过程中笔者发现，PCR产物分析的手段较落后，因为琼脂糖凝胶电泳的方法只能判断产物的大小，并不能鉴别产物的特异性，故传统的PCR检测方法存在易产生非特异性产物，假阳性和重复性差等缺点。
, 百拇医药
本文采用PCR杂交梳技术对30例早期HFRS患者的血、尿标本进行检测均呈阳性结果，且按各病期采集标本亦表明早期诊断具有较高价值。由于整个检测体采用到PCR、核酸分子杂交、酶联显色三个方面的技术[5]，其特异性互相补充和加强，同时，复星PCR杂交梳试剂盒还采用了UDG/dUTP防污染系统，可以去除任何来源(包括引物在内)的污染，因而进一步提高了结果的准确性。因此，PCR结合反相杂交技术在HFRS早期诊断时具有更敏感、快速、准确的特点，值得临床推广。
【作者简介】 邹建龙(1955～)，男，湖南汩罗县人，传染科副主任医师，主要从事肝病及出血热的临床研究。
【参 考 文 献】
[1] Tang YW,Ruo SL,Sanchez A,et al.Hantavirus strains isolated from rodentia and insectivoya in rural china differentiated by PCR assay[J].Arch Virol,1990,115:37-46
, 百拇医药
[2] 欧阳颗.多聚酶链反应在传染病诊断中的应用[J].临床内科杂志，1993，10(3)：8
[3] 郑曲波，李灼亮，罗端德，等.逆转录-聚合酶链反应用于肾综合征出血热病毒基因分型诊断[J].中华传染病杂志，1999，17(3)：197
[4] 李盈盈，杭长寿，刘 旭，等.聚合酶链反应技术在肾综合征出血热病毒基因分型中的应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，1994，8：20-25
[5] 尚世强，洪文澜，俞惠民，等.16S rRNA基因PCR加反相杂交技术检测细菌DNA[J]，中华传染病杂志，1999，17(1)：30-32
【收稿日期】 1999-11-29, 百拇医药
单位：湖南省津市市人民医院 津市 415400
关键词：出血热，流行性；聚合酶链反应；诊断
湖南医学000134【中图分类号】 R512.8 【文献标识码】 B 【文章编号】 1001-9421(2000)01-0065-02
目前国内外常用PCR技术对出血热肾病综合征(HFRS)病毒进行检测，该技术具有灵敏度高，特异性强，简便快速等优点[1]，但被检标本极微量的污染均可造成假阳性，影响结果的准确性[2]。而培养法及其它检测方法敏感性及特异性均低，且费时、费力。作者等1998～1999年采用PCR杂交梳技术对HFRS病毒进行检测，效果满意，现报道如下。
1 材料与方法
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1.1 材料 ①对照病毒株来源：HTNV-114由湖北医科大学病毒所提供。②临床标本来源：采集本院及330医院30例发病10 d以内的HFRS患者标本共40份，(其诊断符合1986年全国HFRS会议诊断标准)，其中血清30份，尿沉淀细胞10份。同时对30例患者全程随访，按各病期采集血清标本共118份。另采集同期发热性疾病(上呼吸道感染、泌尿道感染)血、尿标本各10份，采集正常人血清及尿液各5份作为对照。③试剂来源：PCR杂交梳试剂盒及电泳法PCR试剂盒均由上海复星实业股份有限公司提供。
1.2 方法 (1)标本RNA提取：所采标本立即用于RNA提取或短期冷藏(2～8 ℃)不超过48 h，与标本接触的仪器均经无菌处理，全过程严格无毒操作。血、尿标本RNA提取采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法快速抽提[3]。(2)RT-PCR：每人份取15 μl PCR杂交梳反应液，2 μl聚合酶和3 μl样品上清，混合，加入一滴石蜡油，标记后漩涡振荡20 s，8 000 r/min离心30 s。取阳性对照和阴性对照标本，按上述步骤操作。反应管放在扩增仪上42 ℃，保温60 min后立即进行扩增，按93 ℃→45 s→55 ℃ 45 s→72 ℃ 60 s顺序循环40次，最后72 ℃延时5 min。结束后取15 μl产物进行电泳，观察阳性条带，阴性、阳性对照判断结果。(3)反相杂交：①DNA变性：在扩增后的HFRS病毒反应管中分别加入20 μl DNA变性液，充分混匀，室温放置2 min。②杂交：在酶板条第1排孔中各加入40 μl杂交缓冲液A按顺序加入10 μl已变性DNA，混匀，按相应序号插入杂交膜，37 ℃培养箱保温，至微孔中杂交缓冲液A被杂交膜刚好吸干，约7～10 min。③洗膜：在酶板条第2排孔中各加入1滴杂交缓冲液B后，把第1排孔中的杂交梳拿出按相应序号插入第2排孔中，37 ℃培养箱保温，至微孔中杂交缓冲液B刚好被杂交膜吸干，约7～10 min。④酶工作液制备：吸取SA-AP酶原液10 μl至SA-AP酶液瓶中，混匀。⑤酶结合：在酶板条第3排孔中各加入1滴SA-AP酶工作液，把第2排孔中的杂交梳拿出按相应序号插入第3排孔中，25 ℃反应7～10 min，至微孔中工作液被杂交膜刚好吸干。⑥显色：在酶板条第4排孔中加入显色底物液A，显色底物液B各1滴，混匀，把第3排孔中的杂交梳拿出按相应序号插入第4排孔中，25 ℃反应15 min，拿出杂交梳判断结果。若在杂交膜上出现蓝紫色斑点则为阳性。
, 百拇医药
2 结果
用RT-PCR方法扩增4份标准菌株(HTNV-114)及5份正常人血清标本，并对PCR扩增后产物进行反相杂交，结果4份标准菌株均呈阳性，5份正常人血清标本均阴性。用同样方法对30例早期HFRS患者的40份血清、尿标本进行检测，结果均呈阳性；对其他发热性疾病血、尿标本检测均阴性。HTNV-114阳性对照均为阳性(见表1)。另对30例HFRS患者按各病期所采集的血清标本118份进行检测，结果发热期、休克期、少尿期、多尿期、恢复期阳性率分别为100%(20/20)，100%(28/28)，80%(24/30)，15%(3/20)，0(0/20)(见表2)。用传统的电泳法PCR技术检测以上标本出现少数假阳性及假阴性(见表1，2)。
表1 各类标本PCR与PCR杂交梳检测结果比较 标本
来源
n
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PCR
PCR杂交梳
血清
HFRS
30
28
30
发热疾病
10
1
0
阴性对照
5
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0
尿液
HFRS
10
9
10
发热疾病
10
0
0
阴性对照
5
0
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表2 HFRS各病期血清标本两种方法检测的比较(例，%) 病期
n
PCR阳性
PCR杂交梳
发热期
20
19(95.00)
20(100.0)
休克期
28
27(96.43)
, http://www.100md.com
28(100.0)
少尿期
30
22(73.33)
24(80.00)
恢复期
20
0(0)
0(0)
3 讨论
李盈盈等[4]利用PCR技术对HFRS病毒进行分型，结果与血清学分型一致，已充分说明PCR技术灵敏度高，特异性强。但在实际应用过程中笔者发现，PCR产物分析的手段较落后，因为琼脂糖凝胶电泳的方法只能判断产物的大小，并不能鉴别产物的特异性，故传统的PCR检测方法存在易产生非特异性产物，假阳性和重复性差等缺点。
, 百拇医药
本文采用PCR杂交梳技术对30例早期HFRS患者的血、尿标本进行检测均呈阳性结果，且按各病期采集标本亦表明早期诊断具有较高价值。由于整个检测体采用到PCR、核酸分子杂交、酶联显色三个方面的技术[5]，其特异性互相补充和加强，同时，复星PCR杂交梳试剂盒还采用了UDG/dUTP防污染系统，可以去除任何来源(包括引物在内)的污染，因而进一步提高了结果的准确性。因此，PCR结合反相杂交技术在HFRS早期诊断时具有更敏感、快速、准确的特点，值得临床推广。
【作者简介】 邹建龙(1955～)，男，湖南汩罗县人，传染科副主任医师，主要从事肝病及出血热的临床研究。
【参 考 文 献】
[1] Tang YW,Ruo SL,Sanchez A,et al.Hantavirus strains isolated from rodentia and insectivoya in rural china differentiated by PCR assay[J].Arch Virol,1990,115:37-46
, 百拇医药
[2] 欧阳颗.多聚酶链反应在传染病诊断中的应用[J].临床内科杂志，1993，10(3)：8
[3] 郑曲波，李灼亮，罗端德，等.逆转录-聚合酶链反应用于肾综合征出血热病毒基因分型诊断[J].中华传染病杂志，1999，17(3)：197
[4] 李盈盈，杭长寿，刘 旭，等.聚合酶链反应技术在肾综合征出血热病毒基因分型中的应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，1994，8：20-25
[5] 尚世强，洪文澜，俞惠民，等.16S rRNA基因PCR加反相杂交技术检测细菌DNA[J]，中华传染病杂志，1999，17(1)：30-32
【收稿日期】 1999-11-29, 百拇医药