颞骨火棉胶切片贴片技术及其新的抗原恢复方法
作者：邹艺辉 黄德亮 杨伟炎 方耀云
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000433 为解决人颞骨火棉胶切片贴片技术问题，我们进行实验以寻找较佳方法。
一、材料和方法
我院尸体解剖患者取颞骨标本，经固定、脱钙、脱水、梯度火棉胶浸胶包埋后，作水平或垂直位连续切片，每片厚20 μm。利用实验标本修剪时余下的切片和非实验耳部分切片，进行贴片实验。
1.贴片剂：①0.1 %左旋多聚赖氨酸 (poly-L-lysine，PLL，相对分子质量150 000～300 000；购自Sigma公司，美国)溶液；②2种PLL晶体(相对分子质量150 000～300 000和>300 000；Sigma公司，美国)配制成不同浓度的溶液[1]；③三-氨丙基三乙氧硅烷(3-amino propyltriethoxy silane，APES)处理载玻片(本院病理科)；④2%明胶(本院病理科)；⑤Histogrip处理载玻片(北京中山生物公司)。
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2.载玻片的准备：①清洗：分别采用单片刷洗和超声清洗后重铬酸钾硫酸洗液浸泡； ②涂片：载玻片以推血片方式涂贴片胶[1]，置60℃烤片1 h或自然晾干，备用；③硅化：清洁载玻片于涂贴片胶前行硅化处理[1]。
3.抗原恢复液的制备：取纯氢氧化钠50 g，溶于250 ml 100%甲醇液，充分振溶后置棕色瓶中静置1～2周，取上清液用100%甲醇稀释备用[2，3]。
4.抗原恢复与超敏感的生物素-链霉卵白素法(super sensitive biotin-streptavidin，SSBSA)按照文献[2]的基本方法，逐步改变实验条件，每一步结束后选择较好的一种方式，再改变下一步条件。
5.不同处理方法对贴片效果的影响主要实验如下：①比较不同种类、不同浓度、不同分子量的贴片胶；②不同载玻片处理方法，包括直接刷洗、超声洗片及硅化处理载玻片；③不同切片脱胶方法：乙醇∶乙醚=3∶1溶胶、 1∶3抗原恢复液中浸泡5～10 min、 塑料薄膜转移法等；④不同贴片方法(包括直接贴片法和辗压法)；⑤不同烤片温度；⑥不同抗原恢复液浓度和浸泡时间对贴片的影响。
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6.统计学方法：切片数<10的以成功比表示，切片数>10的以成功率表示，两个率的比较采用χ2 检验。
二、结果
1.不同载玻片处理方法：超声清洗的载玻片较干净，涂片较均匀；硅化处理贴片效果差。涂贴片胶后烤干或晾干无差异，采用60℃烤1 h，24 h后用较好。
2.不同种类、不同浓度、不同分子质量贴片胶处理的载玻片贴片成功率：APES、2%明胶、Histogrip及0.05%、0.02% PLL(相对分子质量150 000～300 000)贴片成功率为0%；相对分子质量150 000～300 000和>300 000的0.1% PLL贴片成功率分别为82.2%(231 /281)和91.7%(33 /36)，P<0.05。
3.火棉胶切片先脱胶的贴片情况：先脱胶后贴片成功率提高，但中耳的结构破坏严重。
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4.不同贴片方法及贴片后处理的贴片成功率：辗压、湿孵方法无效，成功率为0%；烤片温度：55～60℃与35～37℃贴片成功率分别为66.7%(12/18)和41.2%(7/17)，P<0.05。烤片程度是关键因素。贴片后滤纸吸干、晾干或仅55～60℃烤干，效果均欠佳，滴加0.1%PLL覆盖组织后55～60℃烤片效果好。
5.不同抗原恢复液的浓度及浸泡时间的贴片成功比和成功率：恢复液浓度1∶5与1∶3贴片成功比分别为8/10，5/8，脱胶30 min与50 min贴片成功率分别为75.0%(9/12)、76.9%(10/13)，P>0.05，但随脱胶时间延长，切片组织结构破坏明显。
三、颞骨火棉胶切片贴片和抗原恢复的较佳方法
修剪的颞骨火棉胶切片置蒸馏水中浸洗10 min，贴于已涂0.1% PLL(相对分子质量>300 000)载玻片上，滤纸吸干后滴加0.1%PLL覆盖组织，55～60℃烤片(控制好烤片程度)，置1∶5抗原恢复液中浸泡30 min，100%、70%甲醇各10 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，0.01 mol/L，pH 7.5)浸洗3 min×2次，0.3%triton X-100处理10 min，PBS洗3 min×2次，3%过氧化氢4 min，PBS洗5 min×3次；0.1%胰酶(此步根据待测抗原而定)37℃，30 min，PBS洗5 min×3次；10%山羊血清37℃15 min。一抗(鼠抗人纤维连接蛋白，fibrinectin，Fn)20℃过夜，PBS洗5 min×3次，生物素标记二抗(抗鼠、兔)37℃40 min，PBS洗5 min×3次，三抗(辣根酶标记链霉卵白素)37℃40 min，PBS洗5 min×3次，二氨基联苯胺(3,3′-diamino benzidine，DAB)显色5～10 min，自来水冲洗，甘油封片。
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火棉胶切片贴片技术中的重点：①选择0.1% 相对分子质量>300 000的PLL；②干净载玻片；③55～60℃烤片及烤片程度的控制；④抗原恢复液浓度及恢复时间的控制。
通信作者：邹艺辉(Email：zouyihui@263.net)
参考文献
1，姜泊，张亚历. 分子生物学常用实验方法. 北京：人民军医出版社，1997. 128-129.
2，Shi SR, Cote C, Kalra KL, et al. A technique for retrieving antigens in formalin-fixed, routinely acid-decalcified, celloidin-embedded human temporal bone section for immunohistochemistry. J Hitochem Cytochem，1992,40：787-792.
3，Keithey EM, Tian Q. Fibronectin-like immunoreactivity of the basilar membrane of celloidin-embeded human temporal bone sections. Acta Otolaryngol，1994，114：613-619.
(收稿日期：1999-10-18), http://www.100md.com
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000433 为解决人颞骨火棉胶切片贴片技术问题，我们进行实验以寻找较佳方法。
一、材料和方法
我院尸体解剖患者取颞骨标本，经固定、脱钙、脱水、梯度火棉胶浸胶包埋后，作水平或垂直位连续切片，每片厚20 μm。利用实验标本修剪时余下的切片和非实验耳部分切片，进行贴片实验。
1.贴片剂：①0.1 %左旋多聚赖氨酸 (poly-L-lysine，PLL，相对分子质量150 000～300 000；购自Sigma公司，美国)溶液；②2种PLL晶体(相对分子质量150 000～300 000和>300 000；Sigma公司，美国)配制成不同浓度的溶液[1]；③三-氨丙基三乙氧硅烷(3-amino propyltriethoxy silane，APES)处理载玻片(本院病理科)；④2%明胶(本院病理科)；⑤Histogrip处理载玻片(北京中山生物公司)。
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2.载玻片的准备：①清洗：分别采用单片刷洗和超声清洗后重铬酸钾硫酸洗液浸泡； ②涂片：载玻片以推血片方式涂贴片胶[1]，置60℃烤片1 h或自然晾干，备用；③硅化：清洁载玻片于涂贴片胶前行硅化处理[1]。
3.抗原恢复液的制备：取纯氢氧化钠50 g，溶于250 ml 100%甲醇液，充分振溶后置棕色瓶中静置1～2周，取上清液用100%甲醇稀释备用[2，3]。
4.抗原恢复与超敏感的生物素-链霉卵白素法(super sensitive biotin-streptavidin，SSBSA)按照文献[2]的基本方法，逐步改变实验条件，每一步结束后选择较好的一种方式，再改变下一步条件。
5.不同处理方法对贴片效果的影响主要实验如下：①比较不同种类、不同浓度、不同分子量的贴片胶；②不同载玻片处理方法，包括直接刷洗、超声洗片及硅化处理载玻片；③不同切片脱胶方法：乙醇∶乙醚=3∶1溶胶、 1∶3抗原恢复液中浸泡5～10 min、 塑料薄膜转移法等；④不同贴片方法(包括直接贴片法和辗压法)；⑤不同烤片温度；⑥不同抗原恢复液浓度和浸泡时间对贴片的影响。
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6.统计学方法：切片数<10的以成功比表示，切片数>10的以成功率表示，两个率的比较采用χ2 检验。
二、结果
1.不同载玻片处理方法：超声清洗的载玻片较干净，涂片较均匀；硅化处理贴片效果差。涂贴片胶后烤干或晾干无差异，采用60℃烤1 h，24 h后用较好。
2.不同种类、不同浓度、不同分子质量贴片胶处理的载玻片贴片成功率：APES、2%明胶、Histogrip及0.05%、0.02% PLL(相对分子质量150 000～300 000)贴片成功率为0%；相对分子质量150 000～300 000和>300 000的0.1% PLL贴片成功率分别为82.2%(231 /281)和91.7%(33 /36)，P<0.05。
3.火棉胶切片先脱胶的贴片情况：先脱胶后贴片成功率提高，但中耳的结构破坏严重。
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4.不同贴片方法及贴片后处理的贴片成功率：辗压、湿孵方法无效，成功率为0%；烤片温度：55～60℃与35～37℃贴片成功率分别为66.7%(12/18)和41.2%(7/17)，P<0.05。烤片程度是关键因素。贴片后滤纸吸干、晾干或仅55～60℃烤干，效果均欠佳，滴加0.1%PLL覆盖组织后55～60℃烤片效果好。
5.不同抗原恢复液的浓度及浸泡时间的贴片成功比和成功率：恢复液浓度1∶5与1∶3贴片成功比分别为8/10，5/8，脱胶30 min与50 min贴片成功率分别为75.0%(9/12)、76.9%(10/13)，P>0.05，但随脱胶时间延长，切片组织结构破坏明显。
三、颞骨火棉胶切片贴片和抗原恢复的较佳方法
修剪的颞骨火棉胶切片置蒸馏水中浸洗10 min，贴于已涂0.1% PLL(相对分子质量>300 000)载玻片上，滤纸吸干后滴加0.1%PLL覆盖组织，55～60℃烤片(控制好烤片程度)，置1∶5抗原恢复液中浸泡30 min，100%、70%甲醇各10 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，0.01 mol/L，pH 7.5)浸洗3 min×2次，0.3%triton X-100处理10 min，PBS洗3 min×2次，3%过氧化氢4 min，PBS洗5 min×3次；0.1%胰酶(此步根据待测抗原而定)37℃，30 min，PBS洗5 min×3次；10%山羊血清37℃15 min。一抗(鼠抗人纤维连接蛋白，fibrinectin，Fn)20℃过夜，PBS洗5 min×3次，生物素标记二抗(抗鼠、兔)37℃40 min，PBS洗5 min×3次，三抗(辣根酶标记链霉卵白素)37℃40 min，PBS洗5 min×3次，二氨基联苯胺(3,3′-diamino benzidine，DAB)显色5～10 min，自来水冲洗，甘油封片。
, 百拇医药
火棉胶切片贴片技术中的重点：①选择0.1% 相对分子质量>300 000的PLL；②干净载玻片；③55～60℃烤片及烤片程度的控制；④抗原恢复液浓度及恢复时间的控制。
通信作者：邹艺辉(Email：zouyihui@263.net)
参考文献
1，姜泊，张亚历. 分子生物学常用实验方法. 北京：人民军医出版社，1997. 128-129.
2，Shi SR, Cote C, Kalra KL, et al. A technique for retrieving antigens in formalin-fixed, routinely acid-decalcified, celloidin-embedded human temporal bone section for immunohistochemistry. J Hitochem Cytochem，1992,40：787-792.
3，Keithey EM, Tian Q. Fibronectin-like immunoreactivity of the basilar membrane of celloidin-embeded human temporal bone sections. Acta Otolaryngol，1994，114：613-619.
(收稿日期：1999-10-18), http://www.100md.com